CC BY
54
Вестник Челябинского государственного университета. 2015. № 21 (376). Биология. Вып. 3. С. 12-16.
УДК 575:577.21 ББК 28.04-28.074
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОМБИНАЦИЙ, УЧАСТВУЮЩИХ В ФОРМИРОВАНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА
ПРИ ТУБЕРКУЛЁЗЕ ЛЁГКИХ, МЕТОДОМ КАНОНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СООТВЕТСТВИЙ
Работа выполнена при поддержке Фонда перспективных научных исследований Челябинского государственного университета
А. Л. Бурмистрова, С. В. Беляева'2
ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет», Челябинск, Россия 2ГБУЗ «Челябинская областная станция переливания крови», Челябинск, Россия
В результате проведённого исследования с использованием метода канонического анализа соответствий (CCA) установлены комбинации генов воспалительного ответа (IL1RA, ILip, IL-10, TNFA, TLR2 и TLR4), формирующие паттерны, демонстрирующие возможные варианты воспалительного ответа при различных клинических формах туберкулёза лёгких у русских Челябинской области. Для фиброзно-кавернозной формы туберкулёза характерна высокая частота генотипа IL1P(+3953)*T/T. Для очаговой формы — высокая частота генотипов TNFA(-308)*G/G, TLR4(Asp299Gly)*A/G и TLR4(Thr399Ile)*C/T. Для инфильтративной формы (с распространёнными инфильтратами) — высокие частоты генотипов TNFA(-308)*G/A и TNFA(-308)*A/A и TLR2(Arg753Gln)*G/G.
Ключевые слова: туберкулёз лёгких, цитокины, TLR, канонический анализ соответствий.
Туберкулёз остаётся важной международной и национальной проблемой, по-прежнему представляя серьёзную угрозу для общественного здоровья во многих странах мира, нанося человечеству колоссальный медицинский и экономический ущерб, являясь одной из ведущих причин смертности от инфекционных заболеваний. Большинство эпидемиологических данных поддерживают роль врождённого иммунного ответа в развитии туберкулёза [7], поскольку адекватное сетевое взаимодействие его факторов в большинстве случаев приводит к элиминации патогена. Однако гиперактивация или угнетение механизмов врождённого иммунитета могут вызвать развитие патологического процесса [2]. С помощью рецепторов, в том числе TLR (То11-подобные рецепторы), клетки врождённого иммунитета узнают и отвечают на PAMPs (паттерны патоген-ассоциированных молекул), а именно: выделяют цитокины, хемокины и другие активные молекулы и руководят иммунным ответом не только через презентацию антигена, но, как считают в последние годы, обеспечивают ключевыми сигналами Т-лимфоциты: сигналами дифференциров-ки наивных CD4+ Т-лимфоцитов в функциональные субтипы Т-хелперов [8]. Цитокины играют ключевую роль в защите против микобактерий [5]. Синергическое действие провоспалительных
цитокинов (^ф, TNFА) активирует макрофаги и усиливает внутриклеточный киллинг патогенов, действуя в качестве основных эффекторных механизмов клеточного иммунного ответа [6], в то время как противовоспалительные цитокины (ШИА, ^-10) предотвращают альтерацию тканей при избыточном воспалении в ответ на ми-кобактерии, подавляя продукцию 1Ь1р и TNFA.
Цель: выявление комбинаций генов воспалительного ответа (ШЯА, 1Ь1р, 1Ь-10, ТОТА, TLR2 и TLR4), формирующих паттерны, ассоциированные с клиническими фенотипами туберкулёза лёгких.
Материалы и методы. Исследуемую группу составили 86 больных туберкулёзом лёгких — пациенты Челябинского областного клинического противотуберкулёзного диспансера — и 85 здоровых доноров Челябинской областной станции переливания крови. Группы относились к русской популяции и проживали в Челябинской области. Популяционная принадлежность определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям VIII Международного симпозиума, Лос-Анджелес, США, 1980). Группы больных и контроля имели одинаковый социоэкономиче-ский статус (социально адаптированные слои населения).
Среди больных, согласно российской клинической классификации (Российская клиническая классификация, приказ Минздрава РФ от 21 марта 2003 г. № 109), выделены группы: больные с фиброзно-кавернозным туберкулёзом — 11, с инфильтративным — 53, с очаговым — 13, с цирротическим — 1, с туберкулемой — 3, с экс-судативным плевритом — 2, с диссеминирован-ным — 3. Сравнение иммуногенетических показателей проводили в группах больных с различной степенью поражения органа-мишени: с ин-фильтративной, очаговой и фиброзно-каверноз-ной формами туберкулёза лёгких, в связи с малым количеством больных с другими клиническими фенотипами заболевания.
Генотипирование генов цитокинов и TLR осуществляли путём полиморфизма длин рестрик-ционных фрагментов и аллель-специфической ПЦР (таблица). Выделение ДНК проводили с использованием реагентов Protrans DNA Box 500 согласно инструкции производителя (Protrans, Германия). Для амплификации использовали прибор «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия).
Метод детекции результатов — электрофорез в 3 %-м агарозном геле и 8 %-м полиакриламид-ном геле.
Для статистической обработки использовали метод канонического анализа соответствий (Canonical Correspondence Analysis) с помощью программного пакета PAST 2.17с. Анализ соответствий — это разведочно-описательный метод анализа, позволяющий представить на одном графике объекты и переменные и визуализировать структуру таблиц. Принципиально значимыми являются возможность наложения на одну плоскость показателей таблиц и интерпретация их одинаковым способом [3]. В ходе исследова-
ния результаты, полученные эмпирическим путём, можно представить графически в виде точек в пространстве низкой размерности, образованном двумя осями.
Результаты и обсуждение. На рисунке представлен график с нанесёнными на него клиническими фенотипами туберкулёза, полом и генотипами генов воспалительного ответа. Показатели клинических форм и пола больных представлены на графике в виде векторов, показатели генотипов — в виде точек. Результаты интерпретировались в аспекте близости координат исследуемых категорий (генотипов генов, пола и клинических фенотипов): чем ближе категории расположены друг к другу, тем более схожими между собой они считаются в структуре подлежащих факторов. Нами выделены те генотипы, которые в наибольшей степени ассоциированы с развитием конкретных клинических фенотипов. Мерой качества полученного решения выступает процент инерции, объяснённой двумя осями. График построен по первым двум осям инерции, наиболее полно описывающим информацию, заключённую в распределении генотипов генов и гендерных характеристик относительно клинических фенотипов туберкулёза (более 50 % информации). Первая ось описывает 33,34 %% информации об ассоциации клинических фенотипов с определёнными генотипами воспалительного ответа и полом больных, вторая ось — 22,17 % инерции.
Первая каноническая ось разделяет потенциальные факторы риска развития очаговой и ин-фильтративной форм: для очаговой формы характерны высокие частоты генотипов TNFА (-308) *G/G, TLR4 (Asp299Gly) *ЛЮ и TLR4 (Т^399Пе) *С/Т, для инфильтративной формы — TNFА (-308) *0/Л и ТЬЯ2 (Л^753ап) *С/а Генотип
Характеристика полиморфных сайтов исследуемых генов
Ген Исследуемый локус Рестриктазы Производитель рестриктаз и праймеров
IL1P +3953 С/Т Taq I (65 °С) Праймеры — ООО «Синтол» (Россия) Рестриктазы — ООО «Сибэнзим» (Россия) Реакционная смесь GenePakTMCore — ООО «Лаборатория ИзоГен» (Россия)
TNFA -238 G/A -308 G/A BamH I (37 °С) Nco I (37 °С)
TLR4 Asp299Gly Thr399Ile Nco I (37 °С) Hinf I (37 °С)
TLR2 Arg753Gln Msp I (37 °С)
IL10 -1082 G/A, -819 C/T, -592 C/A - НПФ «Литех» (Россия)
IL1RA VNTR - ИХБФМ СО РАН (Россия)
14
А. Л. Бурмистрова, С. В. Беляева
-4,0 -3,2 -2,4 -1,6 -0,8 0,0 0,8 1,6 2,4 3,2 Каноническая ось 1 (33,34 % инерции)
Паттерны генов воспаления при различных клинических формах туберкулёза лёгких по результатам ССА. Точками обозначены генотипы, серый вектор — вектор формы туберкулёза, чёрный вектор —
вектор пола
ТОТА (-308) *А/А встречался только в одном случае — у больного с инфильтративной формой.
Вторая ось позволяет определить различия по потенциальным факторам риска развития фи-брозно-кавернозной и очаговой форм: для фи-брозно-кавернозной характерна высокая частота генотипа ^ф (+3953) *Т/Т (встречался только у больных с данной формой), для очаговой — ТОТА (-308) *G/G, TLR4 (Asp299Gly) *АЮ и TLR4 (ТЫ399Ие) *С/Т. Данная ось также отражает гендерные различия: для мужчин характер -на фиброзно-кавернозная форма, для женщин — очаговая.
Анализируя данные, полученные при использовании канонического анализа соответствий, можно предположить:
1. Для фиброзно-кавернозной формы туберкулёза, чаще встречающейся у мужчин, наиболее характерными являются высокие частоты высокопродуктивного генотипа ^ф (+3953) *Т/Т (определён только у больных с фиброзно-кавернозной формой), что позволяет говорить о провоспалительном цитокиновом генотипе.
Вероятно, паттерн генов воспалительного ответа способен модифицировать реализацию иммунного ответа хозяина на возбудитель в направлении неадекватного гипервоспалительного ответа, сопровождающегося периодами ремиссий/активаций, в итоге приводя к прогрессии и развитию тяжёлой фиброзно-кавернозной формы.
2. Для очаговой формы, чаще встречающейся у женщин, характерна высокая частота (по сравнению с фиброзно-кавернозной и инфильтра-тивной формами) генотипа ТОТА (-308) *0/0, отличительным признаком которого является средняя продукция одного из самых ярких представителей провоспалительных цитоки-нов — TNFa. Кроме того, для больных с данной формой характерны высокие частоты генотипов TLR4 (Asp299Gly) *АЮ и TLR4 (ТЫ"399Пе) *С/Т, которые не обнаружены у больных с фиброзно-кавернозной формой, что указывает на возможность выделения данных генотипов в качестве маркеров благоприятного течения заболевания. Подобные результаты были получены при изучении TLR4 при другом микобактериозе — лепре,
где наличие мутантных аллелей TLR4, несмотря на нарушение функции рецептора, приводит к большей устойчивости к микобактериям [4].
Вероятно, паттерн генов воспаления, ассоциированный с очаговой формой поражения, демонстрирует, при прочих равных условиях, наиболее благоприятный исход в реализации иммунного ответа хозяина на наличие инфекции.
Для инфильтративной формы (с распро-странёнными инфильтратами) — провоспали-тельный цитокиновый генотип: высокие частоты генотипов ТОТА (-308) *0/А и ТОТА (-308) *А/А. Кроме того, для больных с данной формой характерен генотип TLR2 (Arg753Gln) *ОЮ. Ранее мы установили, что данные различия достоверны в отношении фиброзно-ка-вернозной формы [1]. Вероятно, наличие в генотипе больного с инфильтративной формой
туберкулёза лёгких данного генотипа можно считать маркером относительно благоприятного течения инфильтративных форм туберкулёза лёгких.
Можно предположить, что больные с таким генотипом представляют группу риска в отношении прогрессии заболевания к более тяжёлой форме, в частности фиброзно-кавернозной, при наличии других гено-фенотипических особенностей организма больного.
Заключение. Таким образом, можно допустить, что представленные паттерны генов воспаления, полученные в результате использования канонического анализа соответствий, демонстрируют возможные варианты воспалительного ответа хозяина наM. tuberculosis, ассоциированные с различными клиническими фенотипами туберкулёза лёгких у русских Челябинской области.
Список литературы
1. Беляева, С. В. Анализ полиморфизмов гена TLR2 у больных туберкулёзом лёгких представителей русской популяции Челябинской области / С. В. Беляева, А. Л. Бурмистрова, Т. А. Суслова [и др.] // Молекулярная диагностика - 2014 : сб. тр. VIII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - М. : 2014. - Т. 2. - С. 167-168.
2. Ганковская, О. А. Молекулярно-генетические механизмы врождённого иммунитета на уровне слизистых оболочек при патологии инфекционного генеза : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / О. А. Ганковская. - М., 2010. - 48 с.
3. Шафир, М. Простой и множественный анализ соответствий как метод разведочного анализа данных [Электронный ресурс] : выпуск. квалификац. работа / М. Шафир. - М. : ГУ-ВШЭ, 2006. - 119 с. -URL: http://radar-research.rU/wp-content/uploads/2013/10/1.Shaphir_2006_diploma.pdf
4. Hart, B. Genetic Diversity of Toll-Like Receptors and Immunity to M. leprae infection / B. Hart, R. Tapping // J. of Tropical Medicine. - 2012. - Vol. 2012. - P. 1-12.
5. Peresi, E. Cytokine polymorphisms, their influence and levels in Brazilian patients with pulmonary tuberculosis during antituberculosis treatment / E. Peresi, L. R. Oliveira, W. L. da Silva [et al.] // Tuberculosis Research and Treatment. - 2013. - Vol. 2013. - P. 1-13.
6. Sahiratmadja, E. Dynamic changes in pro- and anti-inflammatory cytokine profiles and gamma interferon receptor signaling integrity correlate with tuberculosis disease activity and response to curative treatment / E. Sahiratmadja, B. Alisjahbana, T. de Boer [et al.] // Infection and Immunity. - 2007. - Vol. 75, iss. 2. - P. 820-829.
7. Crevel, R. van Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis / R. van Crevel, T. H. M. Ottenhoff, J. W. M. van der Meer // Clinical Microbiology Reviews. - 2002. - Vol. 15, iss. 2. - P. 294-309.
8. Walsh, K. P. Dendritic cells and other innate determinants of T helper cell polarization / K. P. Walsh, K. H. Mills // Trends in Immunology. - 2013. - Vol. 34. - P. 521-530.
Сведения об авторах
Бурмистрова Александра Леонидовна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой микробиологии, иммунологии и общей биологии, декан биологического факультета Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. burmal@csu.ru
Беляева Светлана Валерьевна — кандидат биологических наук, биолог отдела молекулярно-биоло-гической диагностики Челябинской областной станции переливания крови, доцент кафедры микробиологии, иммунологии и общей биологии Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. shshvetlana@gmail.com
16
A. H. EypMucmpoBa, C. B. EenneBa
Bulletin of Chelyabinsk State University. 2015. No. 21 (376). Biology. Issue 3. Pp. 12-16.
VISUALIZATION OF GENETIC COMBINATIONS INVOLVED IN THE FORMATION OF THE INFLAMMATORY RESPONSE IN TUBERCULOSIS OF LUNGS, BY CANONICAL CORRESPONDENCE ANALYSIS
A. L. Burmistrova
Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. burmal@csu.ru
S. V. Belyaeva
Chelyabinsk regional hemotransfusion station, Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. shshvetlana@gmail.com
The study showed a set combinations of genes inflammatory response (IL1RA, IL1p, IL-10, TNFA, TLR2 and TLR4), forming patterns, that demonstrate possible options for inflammatory response in different clinical forms of pulmonary tuberculosis in Russian Chelyabinsk region by the method of canonical correspondence analysis (CCA).The high frequency of genotype ILip(+3953)*T/T was in fibro-cavernous tuberculosis. For focal forms — high frequency of genotypes TNFA(-308)*G/G, TLR4(Asp299Gly)*A/G and TLR4(Thr399Ile)*C/T. For infiltrative forms (with common infiltrates) — high frequency of genotypes TNFA (-308)*G/A and TNFA(-308)*A/A and TLR2 (Arg753Gln)*G/G.
Keywords: tuberculosis of lungs, cytokines, TLR, canonical correspondence analysis.
References
1. Belyaeva S.V., Burmistrova A.L., Suslova T.A. et al. Analiz polimorfizmov gena TLR2 u bol'nykh tu-berkulyozom legkikh predstaviteley russkoy populyacii Chelyabinskoy oblasti [Analysis of the TLR2 gene polymorphisms in patients with pulmonary tuberculosis representatives of the Russian population of the Chelyabinsk region]. Molekuljarnaya diagnostika 2014, Sbornik trudov VIII Vserossijskoy nauchno-prakticheskoy konferencii s mezhdunarodnym uchastiyem ["Molecular diagnostics 2014". Dijest of work of the 8th Russia-wide scientific conference with international participation]. Moscow, 2014. Vol. 2. Pp. 167-168. (In Russ.).
2. Gankovskaya O.A. Molekulyarno-geneticheskiye mekhanizmy vrozhdyonnogo immuniteta na urovne sl-izistykh obolochekpri patologii infekcionnogo geneza [Molecular genetic mechanisms of innate immunity at the level of the mucous membranes in the pathology of infectious origin. Abstract of thesis]. Moscow, 2010. (In Russ.).
3. Shafir M. Prostoy i mnozhestvennyy analiz sootvetstviy kak metodrazvedochnogo analiza dannykh [Simple and multiple correspondence analysis as a method of exploratory data analysis]. Moscow, 2006. 119 p. (In Russ.).
4. Hart B., Tapping, R. Genetic Diversity of Toll-Like Receptors and Immunity to M. leprae infection. Journal of Tropical Medicine, 2012, vol. 2012, pp. 1-12.
5. Peresi E., Oliveira L.R., da Silva W.L. et al. Cytokine polymorphisms, their influence and levels in Brazilian patients with pulmonary tuberculosis during antituberculosis treatment. Tuberculosis Research and Treatment, 2013, vol. 2013, pp. 1-13.
6. Sahiratmadja E., Alisjahbana B., de Boer T. et al. Dynamic changes in pro- and anti-inflammatory cyto-kine profiles and gamma interferon receptor signaling integrity correlate with tuberculosis disease activity and response to curative treatment. Infection and Immunity, 2007, vol. 75, iss. 2, pp. 820-829.
7. van Crevel R., Ottenhoff T.H.M., van der Meer J.W.M. Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology Reviews, 2002, vol. 15, iss. 2, pp. 294-309.
8. Walsh K.P., Mills K.H. Dendritic cells and other innate determinants of T helper cell polarization. Trends in Immunology, 2013, vol. 34, pp. 521-530.
