CC BY
47
DOI 10.24411/2074-5036-2020-10022 УДК 636.082.2:636.034
Ключевые слова: ген, аллель, полиморфизм, ПЦР, LEP, крупный рогатый скот, пептид, гормон.
Key words: gene, allele, polymorphism, PCR, LEP, cattle, peptide, hormone
1,2Варламова М. И., 1 Шакиров Ш. К., хСафина Н. Ю., Тайнутдинова Э. Р., 1 Алимов А. М.
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЛЕПТИН ГОЛШТИНСКОЙ ПОРОДЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
HOLSTEIN CATTLE LEPTIN (LEP) GENE POLYMORPHISM
'Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства - обособленное структурное подразделение Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук» Адрес: 420059, Россия, Республика Татарстан, Казань, ул. Оренбургский тракт, д. 48
Tatar Scientific Research Institute of Agriculture — Subdivision of the Federal State Budgetary Institution of Science «Kazan scientific center of the Russia Academy of Sciences» Address: 420059, Russia, Republic of Tatarstan, Kazan, Orenburg tract st., 48 2Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» Адрес: 420029, Республика Татарстан, Казань, ул. Сибирский тракт, д. 35 N.E. Bauman Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Federal State Budgetary Institution of Higher Education Address: 420029, Russia, Republic of Tatarstan, Kazan, Siberian tract st., 48
Варламова Маргарита Игоревна, м. н. с. ТатНИИСХ - обособленное структурное подразделение ФИЦ КазНЦ РАН, аспирант кафедры биохимии, физики и математики ФГБОУ ВО «Казанская ГАВМ им. Н. Э. Баумана».
E-mail: mvarlamova25@gmail.com
Varlamova Margarita Igorevna, junior researcher of the TatSRIA - Subdivision ofFIC KazanSC of RAS, postgraduate student of the Department of Biochemistry, Physics and Mathematics of the Bauman Kazan State Academy of Veterinary Medicine. E-mail: mvarlamova25@gmail.com Сафина Наталья Юрьевна, н. с., к. б. н., E-mail: natysafina@gmail.com Safina Natalia Yurievna, Researcher, PhD of Biology. E-mail: natysafina@gmail.com Шакиров Шамиль Касымович, д. с.-х. н., профессор, гл. науч. сотрудник. E-mail: intechkorm@mail.ru Shakirov Shamil Kasymovich, Doctor of Agriculture, Professor, Chief Researcher. E-mail: intechkorm@mail.ru Гайнутдинова Эльза Равилевна, м. н. c. E-mail: elga120574@mail.ru Gaynutdinova Elza Ravilevna, Junior Researcher. E-mail: elga120574@mail.ru Алимов Азат Миргасимович, д. в. н., профессор. E-mail: azat36alimov@mail.ru Alimov Azat Mirgasimovich, Doctor of Veterinary, Professor. E-mail: azat36alimov@mail.ru
Аннотация. Цель данного исследования состояла в том, чтобы изучить полиморфизм гена лептин (LEP) во 2-ом экзоне 4 хромосомы крупного рогатого скота голштинской породы. В исследуемой популяции животных (228 голов) методом полимеразной цепной реакции были идентифицированы все возможные полиморфные варианты аллелей и генотипов гена лептин. Частота встречаемости аллелей C и T у представленного гена составила: 0,570 и 0,430 соответственно. Наблюдаемое распределение генотипов было следующим: TT - 18,4 %; TC - 49,1 %; CC - 32,5 %, что говорит о полиморфности популяции. Полученные данные указывают на разнообразие генетической структуры голштинской популяции крупного рогатого скота Республики Татарстан. В изучаемом поголовье генетическое равновесие не нарушено. Распределение генотипов совпадает с результатами других исследователей.
Summary. The purpose of this article was to study the leptin (LEP) gene polymorphism in the 2nd exon of chromosome 4 of Holstein cattle. In the studied animal population (228 animals), all possible polymorphic variants of alleles and genotypes of the leptin gene were identified by polymerase chain reaction. The frequency of occurrence of alleles C and T in the presented gene was: 0.570 and 0.430, respectively. The observed distribution of genotypes was as follows: TT - 18.4 %; TC - 49.1 %; CC - 32.5 %, which indicates that the population is polymorphic. The obtained data indicate the diversity of the genetic structure of the Holstein population of the Republic of Tatarstan. In the studied population, the genetic balance is not disturbed. The distribution of genotypes coincides with the results of other researchers.
Введение
Генетический полиморфизм представляет собой важную составляющую генетической характеристики популяции. Для анализа генетического полиморфизма могут применяться различные аналитические методы. Наиболее чувствительным и перспективным является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Преимущество этого ДНК-анализа заключается в том, что можно определить генотип животного независимо от пола, возраста и физиологического состояния, что является важным фактором в селекционной работе [8].
Лептин — пептидный гормон, выполняющий ключевую роль в энергетическом обмене, а также регулирующий нейроэндокринные процессы в организме. Физиологической задачей лепти-на является увеличение затрат энергии и синтез макроэргических молекул. Синтезируется и секретируется в жировых клетках и передает в гипоталамус информацию о липидном обмене. Структурно лептин представляет собой протеин, состоящий из 167 аминокислот и включающий 21 аминокислотную последовательность [10].
У крупного рогатого скота ген LEP картирован на 4 хромосоме и имеет 3 экзона и 2 интрона [2]. В качестве потенциальных маркеров молочной и мясной продуктивности можно рассматривать аллели гена лептина [3].
Целью работы является изучение полиморфизма гена лептин во 2-ом экзоне 4 хромосомы у голштинской породы крупного рогатого скота.
Материалы и методы
Исследования были выполнены в высокотехнологичном роботизированном молоч-
ном комплексе КФХ «Мухаметшин З. З.» Сабинского района Республики Татарстан и в отделе агробиологических исследований Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства — обособленного структурного подразделения федерального исследовательского центра Российской академии наук. Для опыта по изучению гена LEP была использована кровь 228 коров голштинской породы. ДНК экстрагировали набором «АмплиПрайм» ДНК-сорб-В (Некст Био, Россия) в соответствии с инструкцией. Животных генотипировали методом АС ПЦР (аллель специфическая полимеразная цепная реакция). На одну пробу реакционной смеси было взято: ДНК 2 мкл, dNTPs 2мкл; Taq ДНК 0,2 мкл, Taq буфер 2 мкл (СибЭнзим, Россия). Общий объем 1 пробы 20 мкл.
Для анализа полиморфизма гена LEP применяли комплект праймеров (СибЭнзим, Россия): 5 ' -GACGATGTGCCACGTGTGGTTTCTTCTGT-3 ' и
5 ' -CGGTTCTACCTCGTCTCCCAGTCCCTCC-3', 5 ' -TGTCTTACGTGGAGGCTGTGCCCAGCT-3 ' для аллеля T и
5 ' -AGGGTTTTGGTGTCATCCTGGACCTTTCG-3 ' для аллеля C. [9]
Реакционную смесь амплифицирова-ли при помощи оборудования 100 Thermal Cycler (BioRad, США), с установленными температурно-временными режимами: денатурация в течение 5 мин при температуре 94 C°, затем 40 циклов отжига 94 C° -10 сек, 60 C° - 10 сек, 72 C° - 10 сек и элонгация 72 C° - 5 мин.
Электрофоретическое разделение проводилось в 2,6 % агарозном геле, содержавшем бромид этидиума и 1*TBE буфер в течение 25 минут.
Таблица 1
Частота встречаемости аллелей и генотипов гена LEP (N=228)
Распределение Генотипы Аллели x2
TT TC CC T C
n % n % n %
Наблюдаемое 42,0 18,4 112,0 49,1 74,0 32,5 0,430 0,570 0,001
Ожидаемое 42,1 18,5 111,8 49,0 74,1 32,5
Визуализацию осуществляли в УФ-транс-иллюминаторе, фиксацию и документирование в системе Gel&Doc (Bio-Rad, США).
Для расчета вариабельности генотипов применяли формулу Г. Н. Шангина-Бере-зовского, а для аллелей - формулу Е. К. Мерку-рьевой [4], генетическое равновесие устанавливали согласно закону Харди-Вайнберга. Оценку значимости различий между фактическим и ожидаемым распределением генотипов определяли по методу хи-квадрата Пирсона (х2).
Результаты исследований
В результате ПЦР-диагностики по ло-кусу гена LEP были обнаружены 2 аллеля и 3 генотипа, имеющие следующую длину пар нуклеотидов: СС - 131, 239; TC - 136, 164, 239; TT - 164, 239. Частота аллеля T составила 0,430 и аллеля C — 0,570 (Таблица 1). Генотипы распределились следующим образом: TT - 42 особи (18,4 %); TC - 112 особей (49,1 %); CC - 74 особи (32,5 %), что говорит о полиморфности популяции. Статистически значимых отклонений в анализируемой популяции между наблюдаемым и ожидаемым распределением генотипов, оцененных по закону Харди-Вайнберга, не обнаружено. Изучаемое поголовье крупного рогатого скота по гену-кандидату LEP находилось в генетическом равновесии, х2 не превышает значения 0,001 при допустимом критическом значении 6,0 (Х2 < х2крит; х2крит = 6,0).
Обсуждение результатов
Похожая тенденция наблюдается в исследованиях ряда авторов, высокая частота аллеля С преобладает над аллелем Т и варьирует от 0,5300,680. В работах исследователей голштинско-го скота в Республике Татарстан составила: 0,580 [6], 0,590 [8], 0,680 [1]; у холмогорской породы - 0,530 [7], казахская белоголовая -0,630 [5], Вагю и Лимузин - 0,680 [11]. Указанные результаты схожи с данными, полученными нами. По сообщению ученых, изучавших полиморфизм гена LEP в различных популяциях крупного рогатого скота, частота аллеля T колеблется от 0,320-0,470. Анализ структур популяций показал следующую частоту встречаемости: у голштинского скота Татарстана - 0,320 [1], 0410 [8], 0,420 [6], Вагю и Лимузин - 0,321 [Щ
казахской белоголовой - 0,370[5], холмогорской - 0,470 [7]. Что касается генотипа ТС, он был наиболее часто встречающимся в популяции крупного рогатого скота всех изучаемых пород, в том числе и в нашем исследовании. Из 228 исследуемых животных генотип ТС идентифицирован у 112 (49,1 %). В меньшей степени выявлен генотип ТТ и установлен у 42 особей (18,4 %) в популяции.
Заключение
В результате генотипирования голштин-ской породы крупного рогатого скота был установлен полиморфизм гена LEP. Частота встречаемости аллеля Т - 0,430, аллеля С - 0,570. Генотипы ТТ, ТС, и СС - 18,4 %, 49,1 % и 32,5 % соответственно. В изучаемом поголовье генетическое равновесие не нарушено. Распределение генотипов совпадает с результатами других исследователей. Такой незначительный разброс, вероятно, связан с результатом селекционной работы. Для более полного анализа необходимо провести ряд опытов по изучению биоразнообразия на большем числе животных.
Статья подготовлена в рамках государственного задания «Мобилизация генетических ресурсов растений и животных, создание новаций, обеспечивающих производство биологически ценных продуктов питания с максимальной безопасностью для здоровья человека и окружающей среды». Номер регистрации: АААА-А18-118031390148-1.
Список литературы
1. Зиннатов Ф.Ф. Взаимосвязь полиморфизма генов липидного обмена (1ер, tg5) с молочной продуктивностью крупного рогатого скота / Ф.Ф. Зиннатов, А.Р. Шамсова, Ф.Ф. Зиннатова, Т.М. Ахметов и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана. 2017. № 231. С. 72-75.
2. Калашникова Л.А. Рекомендации по геномной оценке крупного рогатого скота / Л.А. Калашникова и др. // Лесные Поляны: ВНИИплем, 2015. 35 с.
3. Ковалюк Н.В. Использование полиморфизма локуса лептина в селекции крупного рогатого скота айрширской породы / Н.В. Ковалюк, В.Ф. Сацук, А.Е. Волченко, Е.В. Мачульская и др. // Молочное и мясное скотоводство. 2014. № 6. С. 13-15.
4. Меркурьева Е.К. Генетика с основами биометрии / Е.К. Меркурьева, Г.Н. Шангин-Березовский. М.: Колос, 1983. 400 с.
5. Молдакаримов А. Изучение полиморфизма гена леп-тина (LEP) при экспериментальном моделировании эндокринных нарушении у телят казахской белоголовой породы / А. Молдакаримов, Б.А. Буралхиев // Журнал КазНАУ «Исследования и результаты». 2015. № 1-1. С. 157-161.
6. Сафина Н.Ю. Ассоциация полиморфизма гена-кандидата лептин с энергией роста и физическим развитием голштинского крупного рогатого скота / Н.Ю. Сафина, Ю.Р. Юльметьева, Т.М. Ахметов и др. // Ветеринарный врач. 2017. № 6. С. 52-56.
7. Тюлькин С.В. Влияние породы и генотипа по гену лептина на молочную продуктивность и качество молока коров. / С.В. Тюлькин, Р.Р. Шайдуллин, Х.Х. Гильма-нов и др. // Ветеринарный врач. 2019. № 3. С. 52-56.
8. Тюлькин С.В. Полиморфизм по генам соматотро-пина, пролактина, лептина, тиреоглобулина быков-про-
изводителей / С.В. Тюлькин, Т.М. Ахметов, Э.Р. Вали-уллина, Р.Р. Вафин // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. Т. 16(4/2). С. 1008-1012.
9. Armstrong E. Molecular markers related to marbling in uruguayan creole cattle / E. Armstrong, F. Peñagaricano, R. Artigas, L. De Soto, C. Corbi, S. Llambí, G. Rincón, A. Postiglioni // Archivos de Zootecnia. 2011. Vol. 60(231). P. 707-716.
10. Komisarek, J. Impact of LEP and LEPR gene polymorphismos functional traits in Polish Holstein Friesian cattle / J. Komisarek // Animal Science Paper and Reports. 2010. Vol. 10. P. 133-141.
11. Wu, X.-L. Evaluation of candidate gene effects for beef backfat via Bayesian model selection / X.-L. Wu, M.D. MacNeil, S. De // Genetica. 2005. Vol. 125. P. 103-113. DOI 10.1007/s10709-005-5255-1.
АППАРАТ ДЛЯ ИМПУЛЬСНОЙ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОЙ ТЕРАПИИ «УМИ-05»
На протяжении многих лет клиника БНПЦ ЧИН и Институт Ветеринарной Биологии (Санкт-Петербург) используют в своей практике уникальный прибор — генератор низкочастотного магнитного импульсного излучения большой мощности «УМИ-05» (ранее «УИМТ-2», «УИМТ-3»). Данный прибор применяется для моно-или комплексной терапии целого ряда болезней, которые ранее считались неизлечимыми или очень тяжело поддавались лечению.
Основные направления применения «УМИ-05»
Болезни мочевой системы: мочекаменная болезнь, пиелонефрит, поликистоз, цистит.
• Желчекаменная болезнь. Болезни опорно-двигательного аппарата: остеохондроз позвоночника, дископатия, артрозо-артриты, бурсит, растяжение связок, ушибы, контрактуры суставов, миозит.
• Купирование эпилептических приступов и эпилептического статуса.
• Гипертензия.
• Отит гнойный.
• Отит аллергический.
Стандартный курс лечения
• 10 сеансов по 30—50 импульсов на одну патологическую область. Мощность 50—80 %. Курс можно повторить с перерывом в 10 дней.
• Профилактический курс для животных группы риска (остеохондроз, МКБ и пр.) — 7—10 сеансов с интервалом 6 месяцев.
• Применение прибора не вступает в противоречие с использованием фармакологических и хирургических методов лечения.
• Магнитотерапию не следует проводить на области тела, содержащей металлоконструкции (например, штифты или пластины для остеосинтеза).
Экономика
• Быстрая окупаемость прибора.
• Минимальная затрата рабочего времени: длительность одного сеанса на одну патологическую зону — 2—3 минуты.
• Высокая эффективность лечения, полное излечение или введение животного в стойкую ремиссию по веем перечисленным болезням гарантируют значительное увеличение рейтинга клиники в целом и приток новых клиентов.
Стоимость прибора 27000 рублей Заказать УМИ - 05 можно по тел./факсу: (812) 927-55-92 доб 208; (812) 612-13-34 доб. 208 или по e-mail: ivb-info@mail.ru. подробности на сайте: www.invetbio.spb.ru
