Ассоциация полиморфизма гена-кандидата лептин с энергией роста и физическим развитием голштинского крупного рогатого скота Текст научной статьи по специальности «Животноводство и молочное дело»

ЕТ ЕР ПИАРНЫЙ

Врач

УДК 636.082.2:636.034

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА-КАНДИДАТА ЛЕПТИН С ЭНЕРГИЕЙ РОСТА И ФИЗИЧЕСКИМ РАЗВИТИЕМ ГОЛШТИНСКОГО КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

1Н.Ю.Сафина - аспирант; 2Ю.Р.Юльметьева - кандидат биологических наук, ст.н.с., завлабораторией;

'Т.М.Ахметов - доктор биологических наук, доцент; 2Ш.К.Шакиров - доктор с.-х. наук, профессор;

2Ф.Ф.Зиннатова - кандидат биологических наук.

1ФГБОУ ВО«Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана», г.Казань, (420029, г.Казань, Сибирский тракт, 35, e-mail: natysafina@gmail.com).

2ФГБНУ «Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства», г.Казань (420100,

г.Казань, Оренбургский тракт, 48, e-mail: tatniva@mail.ru).

Интенсивное разведение телок дает возможность осеменять их в более раннем возрасте и раньше оценить продуктивный потенциал, что позволяет повысить экономическую результативность молочного производства и стимулирует процесс генетического улучшения поголовья. Целью данного исследования является изучение взаимосвязи полиморфизм генов лептина у коров голштинской породы с их ростом и физическим развитием. Для проведения ДНК-тестирования по гену-кандидату LEP были отобраны пробы крови у 301 коровы голштинской породы. Генотипирование животных по гену лептин выполнялось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В ходе ДНК-тестирования были идентифицированы все возможные генотипы LEP. Частота встречаемости полиморфизмов и аллелей ранжировалась следующим образом: CC - 29,9%, TC - 55,5%, TT - 14,6% и C - 0,58, T- 0,42. Анализ ожидаемого и наблюдаемого распределения генотипов по гену LEP методом хи-квадрат между генотипами CC, TC и TT продемонстрировал, что вариабельность составляет 1,2, что говорит о том, и генное равновесие по исследуемому гену-кандидату не нарушено. Гетерозиготные животные рождаются более тяжеловесными, животные с генотипом CC имеют более высокую массу во время последующих взвешиваний: 6, 12, 18 месяцев и при первом отеле. Животные с генотипом TT оказались отстающими по массе на протяжении всех контрольных взвешиваний в разном возрасте. В различные возрастные периоды наблюдалась следующая закономерность: животные с генотипом CC имели наибольший относительный привес в первые два промежутка между взвешиваниями, но отставали по этому показателю к моменту отела, с генотипом TT наблюдалась обратная взаимосвязь, с генотипом TC имели средние результаты между контрольными измерениями за исключением прироста в период с 12 до 18 месяцев. Эти же тенденции сохраняются при рассмотрении абсолютного среднесуточного прироста. Результаты этого исследования показывают, что животные с генотипом LEPCC могут быть полезны в селекции в сторону улучшения популяции голштинского скота по хозяйственно-полезным признакам, связанными с энергией роста, конституцией и физическим развитием.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ген, лептин, ДНК, полиморфизм, ПЦР, продуктивность, скот, рост.

Интенсивное выращивание телок позволяет осуществлять их осеменение в молодом возрасте и, соответственно, раньше выявлять потенциал продуктивности, дает возможность повысить экономическую эффективность производства молока, ускорить процесс генетического совершенствования скота [1]. Идентификация генов, влияющих на энергетический баланс, мясную и молочную продуктивность скота -интересная и перспективная область в животноводстве. Отбор животных с помощью молекулярно-гене-тических маркеров может способствовать улучшению генетического потенциала поголовья крупного рогатого скота. Использование в селекционных программах достижений в области биотехнологий значительно упрощает оценку биологического разнообразия и генетической изменчивости, влияющей на характеристики хозяйственно-полезных признаков. Преимущество ДНК-анализа заключается в том, что можно определить генотипы животного независимо от пола, возраста и физиологического состояния, что является

важнейшим фактором в селекционном разведении [2].

Лептин - гормон, вырабатываемый адипоцитами - клетками жировой ткани, играет важную роль в метаболизме, в частности в накоплении жира в организме, вовлечен в регуляцию пищевого поведения, влияет на функционирование иммунной системы и репродуктивную функцию, а так же на рост и конституцию животных. У крупного рогатого скота 1_ЕР расположен в хромосоме 4д32. Он состоит из 3 экзонов и 2 интронов, из которых только 2 экзона транслируются в белок [3]. Структурно лептин представляет собой протеин, состоящий из 167 аминокислот и включающий 21 аминокислотную сигнальную последовательность [4]. Мутация 1_ЕР (Т/С) приводит к замене цистеина на аргинин в а-спирали лептинового полипептида [5].

Материалы и методы. Исследование проводилось на базе СХПК ПЗ имени Ленина Атнинского района Республики Татарстан и в лаборатории молекулярно-гене-тических исследований ФГБНУ «ТатНИИСХ» г. Казань. Для проведения ДНК-тестирования по гену-кандида-

TyLEP были отобраны пробы крови у 301 коровы гол-штинской породы. Животные, участвующие в опыте, содержались в одинаковых условиях. Взятие образцов производилось из хвостовой вены в вакуумные пробирки EDTAK-3 (APEXLAB, Китай).

Экстрагирование ДНК из полученных проб биоматериала проводилось с использованием готового набора «АмплиПрайм ДНК-сорб В» (ИнтерЛабСервис, Россия). Генотипирование животных по гену-кандидату лептин выполнялось методом аллель-специфической полимеразной цепной реакцией (АС-ПЦР). Для ПЦР использовали реакционную смесь, общим объемом 20 мкл, содержащей 2 мкл ДНК, 2 мкл dNTPs, 2 мкл Taq буфера, 0,2 мкл Taq ДНК-полимеразы и комплект тетрапраймеров (СибЭнзим, Россия) со следующей последовательностью олигонуклеотидов: LEP-F1: GACGATGTGCCACGTGTGGTTTCTTCTGT LEP-R1: CGGTTCTACCTCGTCTCCCAGTCCCTCC LEP-F2: TGTCTTACGTGGAGGCTGTGCCCAGCT LEP-R2: AGGGTTTGGGTGTCATCCTGGACCTTTCG Амплификация осуществлялась на аппарате «T100 Thermal Cycler, Bio-Rad» в следующем режиме: денатурация в течение 5 минут при температуре 940С, затем отжиг 40 циклов 940С - 10 сек, 600С - 10 сек, 720С - 10 сек и элонгация при 720С в течение 5 минут. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводилось горизонтальным форезом в 3%-ом ага-розном геле в присутствии бромида этидия при 20 Вт в течение 30 мин в 1хТВЕ буфере. Визуализация полученных результатов реализовывалась на УФ-трансил-люминаторе «Bio-Rad».

Кроме образцов крови в ходе работы были использованы данные официальной электронной документации о стаде из программы «СЕЛЭКС». Для анализа была взята информация о весе коров при рождении, 6 мес, 12 мес, 18 мес и первом отеле. Обработка данных выполнялась по средствам программы MSExcel и статистических формул. Генетическое равновесие гена-кандидата лептин рассчитывалось согласно закону Харди-Вайнберга:

2 7

^ + 2цр + р = 7, где

ц2 - доля гомозигот по одному из аллелей,

ц - частота этого аллеля,

р2 - доля гомозигот по альтернативному аллелю,

р - частота соответствующего аллеля,

2цр - доля гетерозигот;

и методу хи-квадрат (х):

г2 = Z

(fo-fe) fe '

где

f=z

1о - наблюдаемая частота генотипа,

fe - ожидаемая частота генотипа.

Частота аллелей вычислялось по формуле Г.Н. Шангина-Березовского (1983) [6]:

п

л/'где

f - частота аллели,

п - количество голов заданного генотипа,

N - количество голов в изучаемой популяции.

Относительный и абсолютный среднесуточный привес вычисляли по формулам:

А - привес,

М -живая масса конечная, - живая масса начальная,

£ - интервал между взвешиваниями (сут.).

Уровень достоверности полученных данных проверяли по критерию Стьюдента и доверительному интервалу.

Результаты исследований. В ходе ДНК-тестирования были идентифицированы все возможные генотипы 1.БР гена-кандидата. Распределение частоты встречаемости полиморфизмов и аллелей было следующим: СС - 90 голов (29,9%), ТС - 167 голов (55,5%), ТТ - 44 головы (14,6%) и С - 0,58, Т - 0,42 (табл. 1).

Таблица 1

Частота аллелей и генотипов

Хозяйство N Генотип Частота аллелей X2

CC TC TT

n % n % n % C T

СХПК ПЗ им.Ленина 301 90 29,9 167 55,5 44 14,6 0,58 0,42 1,2

90 29,9 149 49,6 62 20,5

Анализ ожидаемого и наблюдаемого распределения генотипов по 1.БР методом х2 между генотипами СС, ТС и ТТ продемонстрировал, что вариабельность составила 1,2, что говорит о том, что генное равновесие по исследуемому гену-кандидату не нарушено.

Другие исследователи ранее фиксировали похо-

жее распределение генотипов по гену 1.БР (СС - 23%, ТС - 54%, ТТ - 23%) среди коров-первотелок в этой же породе данного хозяйства в 2016 году [7].

Предварительные итоги нашей работы описывают различное влияние генотипов (СС, ТС и ТТ) гена-кандидата лептин на живую массу исследуемых

животных. На рисунке 1 можно увидеть сравнительные данные веса опытных коров, зафиксированных

во время контрольных взвешивании для различных генотипов LER

Рис. 1. Вес животных во время

Гетерозиготные животные имеют наибольшую живую массу при рождении, что, как следствие, может являться причиной затруднений при отеле. Животные с генотипом ГС имеют более высокую массу во время последующих взвешиваний: 6, 12, 18 мес и при первом отеле. Животные с генотипом П оказались отстающими по массе на протяжении всех контрольных взвешиваний в разном возрасте, что может говорить о замедленном физическом развитии. Так же нами замечено, что поголовье из этой группы имеет максимальный возраст (мес.) первого отела. Возможно, что недостаточный вес может послужить задержкой для проведения первого осеменения.

контрольных взвешивании, кг.

На рисунках 2 и 3 показаны кривые изменения живой массы между взвешиваниями: от рождения до 6 месяцев, от 6 до 12 мес, от 12 до 18 мес и от 18 мес до первого отела. В различные возрастные периоды наблюдалась закономерность: животные с генотипом LEPCC имели наибольший относительный привес в первые два промежутка между взвешиваниями, но отставали по этому показателю к моменту отела. У животных с генотипом LEPTT наблюдалась обратная взаимосвязь, возможна уже упоминаемая нами взаимосвязь с более поздним осеменением и соответственно более длинным промежутком от 18 мес до отела.

160,0 150,0 140,0 130,0 120,0 110,0 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0

0-6 мес 6-12 мес 12-18 мес 18мес-отел Относительный прирост, иг

•С С

тс

Рис. 2. Относительный прирост между контрольными взвешиваниями, кг.

Рис. 3. Абсолютный среднесуточный прирост между контрольными взвешиваниями, г.

ЕТЕРМНЛРНЫЙ

Врач

Гетерозиготные особи по относительному приросту имели средние результаты между контрольными измерениями за исключением прироста в период с 12 до 18 месяцев. Эти же тенденции сохраняются при рассмотрении абсолютного среднесуточного прироста.

Полиморфизм гена лептин, а так же его взаимосвязь, были исследованы Шоджаем М. с соавторами в 2010 году у овец Кермани. Дана характеристика генотипов, которые по сравнению с другими, имели большую живую массу в разном возрасте. Так же указано, что в этой популяции овец ген лептин может использоваться в качестве избирательного критерия для улучшения веса животных генетически [8]. Ученые, изучавшие ген

Литература

1_ЕР у бразильского скота Нелор сообщали о значительном влиянии его полиморфизма на вес. Так же, как и в нашем исследовании, гомозиготные животные СС имели массу при взвешиваниях выше остальных [5].

Заключение. Можно сделать вывод, что ген-кандидат лептин является полиморфным для изучаемого поголовья, и животные с генотипом _ЕРСС могут быть полезны в селекции в сторону улучшения популяции гол-штинского скота по хозяйственно-полезным признакам, связанными с энергией роста, конституцией и физическим развитием. Таким образом, используя животных с заданным генотипом можно получить более ранние отелы, повышая тем самым рентабельность отрасли.

1. Волкова, И.А. Интенсивность роста телок черно-пестрой породы и их последующие продуктивные качества: автореф. дис. ... канд. с.-х. наук: 06.02.04 / И.А.Волкова. - Омск: ОГАУ, 2001. - 26 с.

2. Полиморфизм по генам соматотропина, пролактина, лептина, тиреоглобулина быков-производителей / С.В.Тюлькин, Т.М.Ахметов, Э.Р.Валиуллина, Р.Р.Вафин // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2012. -Т. 16, № 4/2. - С. 1008-1012.

3. Рекомендации по геномной оценке крупного рогатого скота / Л.А.Калашникова [и др.]. - Лесные Поляны: ВНИИплем, 2015. - 35 с.

4. Komisarek, J. Impact of LEP and LEPR gene polymorphismos functional traits in Polish Holstein Friesian cattle / J.Komisarek // Animal Science Paper and Reports. - 2010. - Vol. 10. - P. 133-141.

5. DGAT1 and LEP polymorphisms in Nelore cattle / Souza [et al.] // Animal Science. - 2010. - Vol. 88. - Р. 435-441.

6. Меркурьева, Е.К. Генетика с основами биометрии / Е.К.Меркурьева, Г.Н.Шангин-Березовский - М.: Колос, 1983. - 400 c.

7. Ассоциация полиморфизма генов TG5 и LEP с динамикой лактации коров-первотелок / Е.Н.Рачкова, Ф.Ф.Зиннатова, Ю.Р.Юльметьева [и др.] // Ветеринарный врач. - 2016. - № 6. - С. 61-66.

8. Association of growth traitand Leptin genepolymorphismin Kermani sheep / M.Shojaei [et al.] // Journal of Cell and Molecular Research. - 2010. - Vol. 2 (1). - P. 67-73.

ASSOCIATION OF POLYMORPHISM IN LEPTIN CANDIDATE GENE WITH ENERGY OF GROWTH AND PHYSICAL DEVELOPMENT IN HOLSTEIN CATTLE

1Safina N.Yu. - postgraduate student; 2Yulmeteva Yu.R. - Candidate of Biological Sciences;

1Ahmetov T.M. - Doctor of Biological Sciences; 2Shakirov Sh.K. - Doctor of Agricultural Sciences,

professor; 2Zinnatova F.F. - Candidate of Biological Sciences.

1Bauman N.E. Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Kazan (e-mail:natysafina@gmail.com).

2Tatar Research Institute of Agriculture, Kazan (e-mail: tatniva@mail.ru).

Intensive breeding of heifers provides an opportunity to implement their insemination at an earlier age and to give the earlier assessment of the productive capacity, provides the possibility of increasing economic efficiency of dairy production and spurs the process of genetic improvement of livestock. The aim of this study was to examine the correlational study between leptin candidate gene polymorphisms in Holstein cows with their growth and physical development. To conduct DNA testing on the LEP candidate gene blood samples were selected from 301 Holstein cows. Animal genotyping according to the leptin candidate gene was performed by polymerase chain reaction (PCR). All possible genotypes of the LEP candidate gene were identified in the course of dNA testing. Frequency of occurrence of polymorphisms and alleles was ranked as follows: CC - 29.9%, TC - 55.5%, TT - 14.6% and C - 0.58, T - 0.42.The analysis of the expected and observed distribution of genotypes according to the LEP candidate gene by chi-square test between genotypes CC, TC and TT has showed that the variability is 1.2, which suggests that genetic equilibrium in the studied candidate gene is not broken. Heterozygous animals have the largest live weight at birth, animals with genotype CC have a larger weight during the follow-up weighing: 6,12,18 months and at the first parturition. Animals with genotype

ЕТЕРМНАРНЫЙ

Врач

TT turned out to lag behind by weight for all check weighings at different ages. In different age periods the following pattern was observed: animals with genotype CC had the highest relative weight gain in the first two intervals between weighings, but lagged behind in this indicator by the time of parturition. An inverse relationship was observed with genotype TT, animals with genotype TC had average results between the reference measurements with the exception of gain in the period from 12 to 18 months. These trends persist when considering the absolute average daily gain. The results of this study show that animals with genotype LEPCC can be useful in breeding for the improvement of population of Holstein cattle by economic traits related to the growth power, body composition and physical development.

KEYWORDS: gene, leptin, DNA, polymorphism, PCR, productivity, cattle, growth.

References

1. Volkova, I.A. Intensivnost' rosta telok cherno-pestroj porody i ihposleduyushchie produktivnye kachestva [Intensity of growth of heifers of black-motley breed and their subsequent productive qualities]: abstract from dissertation for Candidate of veterinary medicine: 06.02.04. - Omsk: OGAU, 2001. - 26 p.

2. Polimorfizm po genam somatotropina, prolaktina, leptina, tireoglobulinabykov-proizvoditelej [Polymorphism in the genes of somatotropin, prolactin, leptin, thyroglobulin of bulls-producers] / S.V.Tyul'kin, T.M.Ahmetov, E.R.Valiullina, R.R.Vafin // Vavilovskij zhurnal genetiki i selekcii, 2012. - Issue 16. - Vol. 4/2. - P. 1008-1012.

3. Rekomendacii po genomnoj ocenke krupnogo rogatogo skota [Recommendations for genomic evaluation of the cattle] / L.A.Kalashnikova [et al.] - Lesnye Polyany: VNIIplem, 2015. - 35 p.

4. Komisarek, J. Impact of LEP and LEPR gene polymorphismos functional traits in Polish Holstein Friesian cattle / J.Komisarek // Animal Science Paper and Reports. - 2010. - Vol. 10. - P. 133-141.

5. DGAT1 and LEP polymorphisms in Nelore cattle / Souza [et al.] // Animal Science. - 2010. - Vol. 88. - P. 435-441.

6. Merkur'eva, E.K. Genetika s osnovami biometrii [Genetics with the basics of biometrics] / E.K.Merkur'eva, G.N.Shangin-Berezovskij - Moscow: Kolos, 1983. - 400p.

7. Associaciya polimorfizma genov TG5 i LEP s dinamikoj laktacii korov-pervotelok [Association of gene TG5 and LEPpolymorphism with the dynamics of lactation heifers] / E.N.Rachkova, F.F.Zinnatova, Yu.R.Yul'met'eva [et al.] // Veterinarnyj vrach, - 2016. - Vol. 6. - P. 61-66.

8. Shojaei, M. Association of growth trait and Leptin gene polymorphism in Kermani sheep/ Moslem Shojaei, Mohammadreza Mohammad Abadi, Masood Asadi Fozi, Omid Dayani, Amin Khezri and Masoumeh Akhondi // Journal of Cell and Molecular Research, 2010, - Vol. 2 (1). - P. 67-73.

УДК 636.2.084.41

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА КРОВИ КОРОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ИХ КОРМЛЕНИЯ

1А.И.Андреев - доктор сельскохозяйственных наук, профессор; 2А.А.Менькова - доктор биологических наук, профессор; 3В.И.Ерофеев - доктор биологических наук, профессор;

4В.Н.Шилов - доктор сельскохозяйственных наук, доцент.

Национальный исследовательский Мордовский государственный университет, г.Саранск (430904, г.Саранск, п. Ялга, Российская, 31, тел. +7(8342) 25-41-79, e-mail: kafedra_zoo@agro.mrsu.ru). 2ФГБОУ ВО«Брянский государственный аграрный университет»(243365 Брянская область, Выгоничский район, с. Кокино, Советская, 2 а, e-mail: aamenkova@mail.ru). 3ФГБОУ ДПО «Мордовский институт переподготовки кадров Агробизнеса», г.Саранск (430904, г.Саранск, п. Ялга, Пионерская, 33,тел.: +7(8342)25-37-35, e-mail:ipka-rm@mail.ru). 4ФГБОУ ДПО «Татарский институт переподготовки кадров агробизнеса», г.Казань (420059, г. Казань, Оренбургский тракт, 8, тел. +7 (843) 2778167, e-mail: shilovvn@yandex.ru).

На гематологические и биохимические показатели крови оказывают влияние различные факторы. Изучен комплекс показателей, характеризующий воздействие силосов из кукурузы и суданской травы в сочетании с люцерной на морфологический и биохимический состав крови дойных коров. Для опыта были подобраны по принципу аналогов три группы коров черно-пестрой породы. Исследованиями установлено, что включение в рацион коров второй группы суданко-люцернового силоса по сравнению с животными, получавшими кукурузный и суданковый силос способствовало повышению содержания гемоглобина, эритроцитов, общего белка в крови