CC BY
37
УДК 636.2.034:636.2.082.2
Ключевые слова: бык-производитель, полиморфизм, ПЦР-ПДРФ, ген LTF
Key words: bull, polymorphism, PCR-RFLP, gene LTF
Тюлькин С. В., Муратова А. В., Хатыпов И. И., Загидуллин Л. Р., Ахметов Т. М., Равилов Р. Х., Вафин Р. Р.
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЛАКТОФЕРРИНА У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ В РЕСПУБЛИКЕ ТАТАРСТАН
POLYMORPHISM OF LACTOFERRIN GENE IN SERVICING BULLS IN REPUBLIC OF TATARSTAN
'ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» Адрес: 420087, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Родина, д. 25а
'Tatar Interregional Veterinary Laboratory, Federal Government Budgetary Institution
Address: 420087, Russia, Republic of Tatarstan, Kazan, Rodin street, 25a 2ООО «АМС Медиа». Адрес: 105082, Россия, Москва, ул. Большая Почтовая, 22 2AMCMedia, LLS. Address:105082, Russia, Moscow, Bol'shaya Pochtovaya, 22 3ООО УК «Просто молоко». Адрес: 420054, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Лебедева, 4
3Prosto Moloko, LLS. Address: 420054, Russia, Republic of Tatarstan, Kazan, Lebedev street, 4 4ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана» Адрес: 420074, Russia, Republic of Tatarstan, г. Казань, ул. Сибирский тракт, 35 4N. Е. Bauman Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Federal State Educational Institution of Higher Professional Education. Address: 420074, Russia, Republic of Tatarstan, Kazan, Siberian tract street, 35
Тюлькин Сергей Владимирович, к. с.-х. н., зав. отделом1 Tyulkin Sergey V., Ph.D. in Agricultural Sciences, Head of the Dept.' Муратова Александра Владимировна, руководитель отдела2 / Muratova Alexandra V., Head of the Dept.2 Хатыпов Ильдус Ильгамович, ведущий специалист3 / Khatipov Ildus I., Leading Expert3 Загидуллин Ленар Рафикович, к. б. н., доцент каф. механизации с.-х. производства4 Zagidullin Lenar R., Ph.D. in Biological Sciences, Associate Professor of the Dept. of Mechanization of Agricultural Production4 Ахметов Тахир Мунавирович, д. б. н., и. о. проф. каф. технологии животноводства4 Ahmetov Tahir M., Doctor of Biological Sciences, Acting Professor of the Dept. of Technology of Animal Production4 Равилов Рустам Хаметович, д. в. н., проф., зав. каф. эпизоотологии4 Ravilov Rustam H., Doctor of Veterinary Sciences, Professor, Head of the Epizootology Dept.4 Вафин Рамиль Ришадович, д.б.н., научный консультант1 Vafin Ramil R., Doctor of Biological Sciences, Scientific Adviser'
Аннотация. Цель данного исследования состояла в том, чтобы определить полиморфные варианты гена лак-тоферрина (LTF) крупного рогатого скота методом ПЦР-ПДРФ. Два аллеля A и B и два генотипа AA и AB гена LTF выявлены в изученной популяции (70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей). Частота встречаемости A и B аллелей гена LTF была 0,78 и 0,22, соответственно. Кроме того, частота встречаемости генотипов AA, AB и BB составила 55,7 %, 44,3 % и 0 % для гена LTF, соответственно. Полученные впервые данные о полиморфизме гена LTF можно использовать в практической селекции на повышение продуктивных и полезных качеств у крупного рогатого скота.
Summary. The objective of the present study was to determine the polymorphic patterns of lactoferrin (LTF) gene in cattle using PCR-RFLP method. Two alleles A and B and two genotypes AA and AB of LTF gene were observed in the studied population (70 thoroughbred and crossbred Holstein breed bulls). The frequencies of A and B alleles of LTF gene were 0,78 and 0,22, respectively. Furthermore, the frequencies of AA, AB and BB genotypes were 55,7 %, 44,3 % and 0 % for the LTF gene, respectively. The data on polymorphism of gene LTF obtained for the first time can be used in practical selection aiming to increase productive and useful qualities in cattle.
Введение
Генодиагностика (ДНК-диагностика) представляет собой перспективное направление фундаментальной и прикладной биотехнологии, одной из областей применения
которой является разведение и селекция сельскохозяйственных животных. Необходимой предпосылкой для выполнения генной диагностики является наличие генетического полиморфизма, который лежит в основе
наследственной изменчивости всех признаков организма. Говоря о генетическом полиморфизме, имеют ввиду, что конкретный локус представлен по меньшей мере двумя вариантами проявления - аллелями [2].
На сегодняшний день актуальной проблемой является изучение генетической информации о полиморфизме маркеров, являющихся генами-кандидатами продуктивности у крупного рогатого скота [1].
В качестве потенциально значимого маркера, связанного с хозяйственно-полезными признаками у крупного рогатого скота, могут рассматриваться аллели А и В гена лак-тоферрина (ЦГР).
Из-за того, что лактоферрин обладает иммунными свойствами, предполагается, что его ген может являться геном-кандидатом, связанным с таким признаком как резистентность к маститам у крупного рогатого скота. Исследования полиморфизма гена ЦГР крупного рогатого скота показывают, что необходимо их продолжить [4]. Генетические варианты гена ЦГР могут выступать в качестве ДНК-маркера, ассоциирующегося с содержанием соматических клеток в молоке и с заболеваемостью маститом у коров. Так, исследования показали, что наличие в геноме коров аллеля А гена ЦГР приводит к повышению заболеваемости коров маститом [5].
Полиморфизм гена ЦГР связан с функционированием белка - лактоферрина - и его физико-химическими свойствами. Исследования, проведенные на коровах породы ве-чур, показали, что структурные различия в гене ЦГР приводят к изменению состава молока [8].
Все выше представленное говорит о значимости изучения полиморфизма гена ЦГР у крупного рогатого скота.
Материалы и методы
Исследования проводились в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан. Для проведения ДНК-тестирования по гену ЦГР у 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей отобраны пробы крови. Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА
до конечной концентрации 10 мМ. ДНК из крови выделяли аммиачным способом.
Определение генотипа у быков по гену ЦГР проводили методом ПЦР-ПДРФ. Для амплификации фрагментов гена ЦГР использовали следующие праймеры: ЦГР-Р: 5/-GCCTCATGACAACTCCCACAC-3/, ЦГР^: 5/-CAGGTTGACACATCGGTTGAC-3/ [6].
Продукт амплификации гена ЦГБ обрабатывали ферментом рестриктазой - ЕсоЫ, производства ООО «СибЭнзим» (Россия).
Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин. в 1*ТВЕ буфере. После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам.
Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле:
р = п / N где
р - частота определения генотипа, п - количество особей, имеющих определенный генотип, N - число особей.
Частоту отдельных аллелей определяли по формулам:
РА = (2пАА + пАВ) / 2N и qB = (2пВВ + + пАВ) / 2^ где
РА - частота аллеля А, qB - частота аллеля В, N - общее число аллелей.
По закону Харди - Вайнберга рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции быков-производителей.
Результаты и обсуждение
Процесс валидации способа проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов ЦГБ-гена крупного рогатого скота по протоколу [6], а также последующий анализ выравнивания фланкируемых с парой прай-меров ЦГР-Б+ЦГР-Я соответствующих ну-клеотидных последовательностей представлен на рисунке 1.
В результате апробации признанного ПЦР-ПДРФ-протокола для идентификации аллельных вариантов ЦГБ-гена крупного ро-
Праймер ЬТР-Г_
Ген/аллель СССТСАТСАС ААСТСССАСА С
ЬТГ/А 001 СССТСАТСАС ААСТСССАСА ССААААСАСТ АСТТТАТТТТ СТАААТТТТС АССАТТАТТА
ЬТГ/В 001 ............................................................
********** ********** ********** ********** ********** **********
Ген/аллель
1ЛТ/А 061 СТСССАТСТТ АТСвТСТТТТ САССТСТСАА ССАААСААСС ТСААйААААА АТТТАСТТАС
ЬТЕ/В 061 ............................................................
********** ********** ********** ********** ********** **********
Ген/аллель
ЬТГ/А 121 АТСССССТТС САССТССААА АТАААТТТСТ ТАААСТССАТ АТАСАТСТТТ САААТСТССТ
ЬТГ/В 121 ............................................................
********** ********** ********** ********** ********** **********
Ген/ аллель ЕеоБ.!
ЬТГ/А 181 СССТСССААС ТССАТСТАТв ААСТСССАСС СТСССАСТАТ САТАТССАСС АТАСТАААСС
1ЛТ/В 181 .................... . .Т. ....................................
********** ********** ** ******* ********** ********** **********
_Праймер ЬТЕ-в
Ген/аллель С ТСААСССАТС ТСТСААССТС
ЬТГ/А 241 ТАСССТАТСТ СААТАССТТА ТТААТТСТСС АТАТАТСАСС ТСААСССАТС ТСТСААССТС
ЬТГ/В 241 ............................................................
кккккккккк кккккккккк кк кккккккк кккккккккк кк кккккккк кккккккккк
ПЦР- ЕсоЕН- ЕсоБ1-
Ген/аллель продукт картирование ПДРФ-профиль
ЬТГ/А 300 Ьр 1-300 300 Ьр
ЬТГ/В 300 Ьр 1-200/201-300 200/100 Ьр
Рис. 1. Результаты выравнивания и EcoRI-рестрикционного картирования амплифицируемых с помощью прай-меров ШТ-Б и LTF-R нуклеотидных последовательностей ДНК локуса LTF-гена Bos. tauI"us (аллели А и В).
гатого скота была протестирована пара оли-гонуклеотидных праймеров: ЦГБ-Б+ЦГБ-К; пара этих праймеров инспирируют амплификацию участка ЦГБ-гена крупного рогатого скота длиной 300 Ьр, соответственно ЦГБ-ПДРФ-ЕсоМ профиль (АА = 300 Ьр, ВВ = 200/100 Ьр и АВ = 300/200/100 Ьр) распознает его генотипы (рис. 2).
Исследование быков-производителей по гену ЦГБ методом ПЦР-ПДРФ показал следующие результаты. Так, у 70 быков распределение генотипов было следующим: АА -39 (55,7 %), АВ - 31 (44,3 %) и ни одного животного с генотипом ВВ. При этом частота аллелей А и В составила 0,78 и 0,22 соответственно (табл. 1).
Изучение литературных данных по полиморфизму гена ЦГБ показал, что частота
Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена ШГ с праймерами. ШТ'-Б+ШТ'-Я и эндонуклеаз-ным расщеплением ферментом EcoRI. Обозначения: М - ДНК-маркеры 100 Ьр (СибЭнзим); 1, 3, 4, 8 - генотип АА (300 Ьр); 2, 5, 6, 7 - генотип АВ (300/200/100 Ьр).
встречаемости аллелей А и В в популяциях чистопородного и помесного крупного рогатого скота составила: южной и восточной анатолийской красной породы - 0,46740,6304 и 0,3696-0,5326 [3], голштинской породы иранской селекции - 0,61 и 0,33 [7],
Таблица 1.
Полиморфизм гена ЦШ у быков-производителей
Показатели Генотипы Частота аллелей Х2
АА АВ ВВ
п % п % п % А В
Генотип по гену ШТ1
Наблюдаемые 39 55,7 31 44,3 0 0 0,78 0,22 2,41
Ожидаемые 43 61,4 24 34,3 3 4,3
джерсейской породы - 0,627 и 0,373 [10], помесной польской черно-пестрой породы с разной кровностью по голштинской породе - 0,677 и 0,323 [9]. Причем в наших исследованиях частота встречаемости аллелей А (0,78) и В (0,22) гена была выше показателей по аллелю А и, соответственно, ниже по аллелю В, чем в публикациях по данной тематике.
Заключение
Анализ фактического и теоретического распределения генотипов по локусам гена ЦГБ методом Харди - Вайнберга в популяции чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей головного племенного предприятия «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан показал, что разница между генотипами (АА, АВ и ВВ) составила 4,3-10,0 %. При этом показатель вариабельности хи-квадрат (х2) по гену ЦГБ в популяции быков составил 2,41, что ниже достоверных значений. Результаты исследований продемонстрировали, что генное равновесие по гену ЦГБ не нарушено.
Список литературы
1. Зиннатова, Ф. Ф. Роль генов липидного обмена (DGAT1, TG5) в улучшении хозяйственно-полезных признаков крупного рогатого скота / Ф. Ф. Зиннатова, Ф. Ф. Зинатов // Ученые записки Казанской ГАВМ. -2014. - Т. 219. - С. 164-168.
2. Зиновьева, Н. А. Современные методы генетического контроля селекционных процессов и сертификации племенного материала в животноводстве : учеб. пособие / Н. А. Зиновьева, [др.]. - М. : РУДН, 2008. -329 с.
3. Esen Gürsel, F. EcoRI Polymorphism in Intron 6 of the Bovine Lactoferrin Gene in South Anatolian Red and East Anatolian Red Cattle Breeds / F. Esen Gürsel, [et al.] // J. Fac. Vet. Med. Istanbul Univ. - 2013. -V. 39 (2). - P. 183-188.
4. Pawlik, A. Bovine lactoferrin gene polymorphism and expression in relation to mastitis resistance - a review / A. Pawlik, G. Sender, A. Korwin-Kossakowska // Anim. Sci. Paper and Reports. - 2009. - V. 27 (4). - P. 263-271.
5. Schwerin, M. The bovine lactoferrin gene (LTF) maps to chromosome 22 and syntenic groupU12 / M. Schwerin [et al.] // Mammalian Genome. - 1994. - V. 5. - P. 486-489.
6. Seyfert, H. M. Characterization of a first bovine lactoferrin gene variant, based on an EcoRI polymorphism / H. M. Seyfert, C. Kühn // Anim. Genet. - 1994. -V. 25 (1). - P. 54.
7. Sharifzadeh, A. Study of Lactoferrin Gene Polymorphism in Iranian Holstein Cattle Using PCR-RFLP Technique / A. Sharifzadeh, A. Doosti // Global Vet. -2011. - V. 6 (6). - P. 530-536.
8. Shashidharan, A., Physicochemical characterization and functional site analysis of lactoferrin gene of Vechur cow / A. Shashidharan, [et al.] // Bioinformation. - 2011. -V. 6 (7). - P. 275-278.
9. Wojdak-Maksymiec, K. Associations between bovine lactoferrin gene polymorphism and somatic cell count in milk / K. Wojdak-Maksymiec, M. Kmiec, J. Ziemak // Vet. Med. - 2006. - V. 51 (1). - P. 14-20.
10. Wojdak-Maksymiec, K. Interactions between TNF-a, LTF and mLYZ Gene Variants in Determining Somatic Cell Count in Jersey Cows / K. Wojdak-Maksymiec, K. Mikolajczyk // Pakistan Vet. J. - 2012. -V. 32 (4). - P. 477-482.
НОУ ДО «ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ БИОЛОГИИ» г. Санкт-Петербург
Курсы повышения квалификации
Основы ультразвуковой диагностики в ветеринарии Частная ультразвуковая диагностика в ветеринарии Рентгенодиагностика в ветеринарии Лабораторная диагностика в ветеринарии Основы ветеринарной кардиологии Основы эхокардиографии в ветеринарии Частная ветеринарная кардиология
Предварительная регистрация обязательна! Справки по тел. +7 921 095-89-27 График проведения и информация на сайте: www.invetbio.spb.ru/seminars.html
Лицензия Комитета по образованию Санкт-Петербурга на осуществление образовательной деятельности по образовательным программам дополнительного профессионального образования № 1093 от 04.08.2014 г
