CC BY
5УДК 575.2:577.2
А.Н. Рабоконь, А.Е. Демкович, Я.В. Пирко, Я.Б. Блюм
ПОЛИМОРФИЗМ ДЛИНЫ ИНТРОНОВ ГЕНОВ БЕТА-ТУБУЛИНА КАК ЭФФЕКТИВНЫЙ ИНСТРУМЕНТ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ
(Обзорная статья)
Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины Украина, 04123, г. Киев, ул. Осиповского, 2а
Введение
Развитие молекулярной биологии способствует появлению новых подходов к генетическим исследованиям организмов, переходу к новым технологиям анализа генома. Этот процесс обусловлен наличием информативных генетических маркеров, что позволяет создать новые тест-системы для анализа генетического полиморфизма как на уровне продуктов гена (белки, ферменты), так и на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК) [1, 2]. Молекулярные маркеры, основанные на полиморфизме длин фрагментов ДНК и белков, позволяют успешно решать целый ряд задач фундаментального и прикладного характера, в том числе изучать биоразнообразие, возможные механизмы эволюции, проводить картирование хромосом, а также используются для семеноводства, племенного дела и т.д. [1, 3].
Оценка генетического полиморфизма имеет большое значение для изучения динамики генетической структуры популяций и экологических отношений в природных и искусственных растительных сообществах. Сведения о генетических ресурсах имеют фундаментальное значение для разработки программ получения новых сортов и защиты диких видов растений. Понимание генетических основ дивергенции и адаптации популяций является одной из важнейших задач популяционной генетики, играя ключевую роль в оценке эволюционных процессов. Молекулярно-генетические маркеры позволяют идентифицировать отдельные гены, их блоки, которые контролируют адаптивные признаки в популяциях растений и животных, что радикально изменило подходы к оценке генетического разнообразия, паспортизации и классификации сортов, картированию и определению физической природы генов и генети-
ческого мониторинга в селекции и генетике культурных растений [3, 4, 5].
Важной задачей в исследовании генетического полиморфизма живых организмов является оптимальный подбор молекулярно-генетических маркеров для этих целей. Одним из наиболее доступных и быстрых способов обнаружить вариабельность генома является применение молекулярных методов, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующая оценка соответствующих полиморфизмов ДНК. Используемые маркеры должны обладать определенными свойствами и иметь определенные характеристики, в том числе: доступность фенотипических проявлений аллельных вариантов для идентификации, равномерность распределения в геноме, легкую выявляемость и воспроизводимость результатов, возможность автоматизации процесса и т. д. [3, 4, 5].
На данный момент уже разработано большое количество различных ДНК-маркеров, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, некоторые из них используются только с определенной целью. Развитие маркерных систем направлено от оценки анонимных последовательностей (ISSR, RAPD) к определению полиморфизма целевых последовательностей генов. Кроме того, по мере накопления информации о структуре генома, постоянно продолжаются поиски новых, более эффективных, удобных и дешевых маркерных систем для проведения генетического анализа.
ДНК-маркеры на основе ПЦР-реакции
На сегодняшний день существует большая группа маркеров, основанных на полиморфизме ДНК, включая следующие: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism -полиморфизм длин рестрикционных фраг-
ментов), VNTR (Variable Number of Tandem Repeats - минисателлиты или полиморфизм количества тандемных повторов; ДНК-фингерпринт), SSR (Simple Sequence Repeat -микросателлиты), RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Restriction Fragment Length Polymorphism), SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Использование поли-меразной цепной реакции (ПЦР) существенно облегчает анализ и может быть реализовано в подавляющем большинстве современных методов. Большой интерес представляет группа STS (Sequence Tagged Site) ДНК-маркеров, основанных на известных геномных последовательностях. К ним относятся SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), полученные в результате секвенирования и подбора праймеров к одному из ампликонов RAPD-спектра; CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), аналогичные SCAR-маркерам, и имеющие дополнительный этап обработки ре-стриктазами, повышающий количество выявляемых полиморфизмов. Микросателлитные повторы являются основой для двух типов маркеров. Один связан с исследованием полиморфизма участков ДНК, находящихся между микросателлитными последовательностям ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), другой -с непосредственным исследованием полиморфизма микросателлитных последовательностей SSR (Simple Sequence Repeats). В обоих случаях для подбора праймеров необходимо знание специфических последовательностей, фланкирующих микросателлитные повторы. Первый метод генерирует большое количество локусов с использованием одной пары прай-меров, второй является локус-специфичным. Сравнительно невысокое число и сложность анализа SSR-локусов в значительной степени компенсируются высокой вариабельностью, воспроизводимостью, простотой анализа и возможностью его частичной автоматизации [6, 7], что представляется весьма удобным для индивидуального генотипирования организмов. IRAP-анализ (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) - метод амплификации геномной ДНК между близкорасположенными последовательностями ретротранспозонов. Для генотипирования этих последовательностей используют специально сконструированные прай-меры PawS. Полиморфизм в данном случае об-
условлен либо мутацией в участке связывания праймера, либо уникальным биологическим процессом - ретроранспозицией, происходящей в результате встраивания ретротранспозо-на в новый участок геномной ДНК без потери первоначального участка [5, 8]. Метод REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplification Polymorphism) аналогичен IRAP, однако наряду с праймерами к ретротранспозонам используются микросателлитные праймеры - двух-, трех- или четырехбазовые, например, (NN)n, (NNN)n или (NNNN)n, ввиду того, что микросателлиты могут выявить высокие показатели мутации, имеющие индивидуальное местоположение у различных генотипов [8, 9].
С другой стороны, в задачах классификации и филогенеза предпочтительнее использование функциональных последовательностей, которые в той или иной степени связаны со структурными или физиологическими отличиями организмов, чем нефункциональной ДНК [10, 11]. В зависимости от глубины филогенетического анализа, ординация таксонов и уровень разрешения могут убывать при использовании медленно эволюционирующих последовательностей генов и в тоже время искусственно завышаться при использовании быстро эволюционирующих последовательностей, например, SSR-маркеров, теряющих разрешающую способность на высоком таксономическом уровне [12]. Интроны являются умеренно эволюционирующими последовательностями и довольно успешно используются при создании маркерных систем для оценки генетического разнообразия. Обычно рассматриваемые как «мусорная» ДНК, и в этой связи, минимально отклоняющиеся от модели нейтральной эволюции Кимуры [13] интроны, в частности полиморфизмы их длины, оказались универсальными для широкого спектра организмов и удобными для генетического картирования, поскольку они непосредственно связаны с конкретными генами [14, 15, 16].
Одна из таких систем STS-маркеров основана на полиморфизме длин интронов генов Р-тубулина (Tubulin-Based Polymorphism - TBP). Она имеет определенный набор преимуществ по сравнению с остальными маркерами, разработанными на основе полиморфизма интронов. В частности, высокая межвидовая гомология, основанная, с одной стороны, на значительном
консерватизме фланкирующих интрон участков экзонов Р-тубулина, к которым подобраны прай-меры, а с другой стороны на вырожденности праймеров [17]. Также это совмещается с относительным обилием в геноме генов Р-тубулина. В отличие от интронов многих других генов интроны Р-тубулинов, видимо, играют определенную регулирующую роль, поэтому их эволюция идет медленнее, чем у многих других последовательностей интронов [18-21]. Одним из преимуществ использования интронов генов Р-тубулина в царстве растений является их кластерная структура с гомологичными последовательностями у каждого фланкирующего экзона. Это делает ТВР даже более эффективным для предварительной или ускоренной оценки генетического разнообразия, чем активно используемые AFLP- или SSR-полиморфизмы, для которых необходима значительная предварительная информация о структуре генома.
Принцип ТВР-метода. Генотипирование растений с помощью ТВР
Метод ТВР основан на наличии интрон-специфического ДНК-полиморфизма у растительных генов семейства Р-тубулина [17]. Полипептиды Р-тубулина являются ключевыми составляющими микротрубочек - внутриклеточных структур, участвующих в основных процессах деления и роста эукариотических клеток [22, 23]. В связи с ключевой ролью Р-тубулина в жизни клетки их первичная аминокислотная последовательность довольно консервативна у всех эукариотических организмов. Каждый вид содержит определенное количество генов Р-тубулина (изотипов), которые образуют семейство данных генов [24, 25, 26]. У растений почти все гены Р-тубулина
ATG
имеют общую геномную организацию - два интрона, расположенные в четко фиксированных локусах в пределах кодирующих экзонов (исключение - гены Р-тубулина у кукурузы ^еатаШВ1) и риса (о^аШВ2) [17, 27], у которых присутствует только один (первый) интрон. Схематическое изображение генов Р-тубулина растений и амплифицируемые зоны приведены на рис. 1. Экзоны генов, кодирующих Р-тубулин, консервативны, в то время как интроны относятся к гипервариабельным участкам генов и могут иметь различную длину [28]. Подобрав к консервативным участкам экзонов (на границе с ин-тронами) праймеры, можно с помощью по-лимеразной цепной реакции получить копии последовательностей, находящихся между ними, то есть, интронов. Полиморфизм наблюдается в том случае, когда длина интро-нов у сравниваемых образцов оказывается различной.
Первоначально особое внимание уделялось лишь только первому интрону гена Р-тубулина, поскольку он присутствует у всех видов растений и начинается с 397 ну-клеотида после стартового кодона АТС [17, 27]. Биоинформационный анализ экзон-интронной структуры генов Р-тубулина у различных видов растений позволил разработать вырожденные праймеры: TBPF1: 5'-GARGCYGARAAYTGYGAYTG-3'; TBPR1: 5 '-ТCHGGRTAYTCYTCHCKRAT-3', которые дают возможность во время проведения ПЦР синтезировать последовательности ДНК, включающие интроны генов Р-тубулина [17]. Сам ТВР-метод (основанный на полиморфизме длины 1-го интрона) был разработан для риса (запатентовано РСТ/IT99/00415), в даль-
TGA
hTBP
экзон 1) интрон 1 ( экзон 2 )интр°н 2 ( экзон 3 ;
TBP сTBP
Рис. 1. Стрелки указывают положение и ориентацию праймеров в соответствующем методе. АТГ и ТГА указывают на старт и стоп-кодоны, соответственно. Квадратные скобки охватывают область амплифицикации
с помощью методов ХВР, сХВР и КГВР
нейшем проверен и успешно применен для установления генетических связей внутри подвидов и разновидностей Brassica L., Lotus L., Coffea L. [17]. В базовом ТВР-методе для создания характерного электрофорети-ческого профиля продукт ПЦР-реакции разделяется в неденатурирующем 6%-ном по-лиакриламидном геле [29] и визуализируется путем окрашивания геля нитратом серебра [30, 31]. Бэнды чаще всего регистрируют в бинарной системе: присутствующим присваивают значение единицы, отсутствующим -нуля. Размер ампликонов соответствующего бэнда определяют, используя ДНК-маркер.
В дальнейшем была предложена модификация ТВР-метода - сТВР (combinatorial ТВР) [32], который опирается на полиморфизм длины II-го интрона генов Р-тубулина и сочетает в себе данные как о полиморфизме длины первого, так и второго интронов. При этом используются следующие две пары праймеров: TBPfex1: 5'-AACTGGGCBAARGGNCAYTAYAC-3' и TBPrex1: 5'-ACCATRCAYTCRTCD GCRTTYTC-3' (фланкируют границы первого интрона генов тубулина); TBPfin2: 5 '-GARAAYGCHGAYGARTGYATG-3' и TBPrin2: 5'-CRAAVCCBACCATGAARAARTG-3' (фланкируют второй интрон) [32]. Метод сТВР (анализ I-го и II-го интронов) использовался для оценки видов и с ортов Rosa L., Eleusine Gaertn., Arachis L., Camelina Crantz, Phaseolus vulgaris L. и целого ряда диких травянистых растений [28, 32, 33]. В 2011 году была предложена новая модификация ТВР, названная hTBP (horse TBP) [34], основанная на одновременной амплификации обоих интронов и экзона, лежащего между ними. Используется всего лишь одна пара вырожденных праймеров: TBP-F:
5'-AACTGGGCBAARGGNCAYTAYAC-3' и TBP-R: 5 '-CRAAVCCBACCATGAARAA RTG-3' [28]. Данный метод был использован для характеристики представителей рода Camelina [34].
В последнее время авторы метода предлагают использовать для разделения полученных фрагментов капиллярный электрофорез (CE-TBP), который позволяет получать более точные и легче воспроизводимые данные [33, 35, 36]. Ведутся разработки по применению ТВР для идентификации видов, являющихся компонентами сложных коммерческих растительных смесей. Это может быть использовано в анализе пищи при установлении состава продуктов питания растительного происхождения, выявлении различных аллергенов, возбудителей болезней, продуцентов токсинов и т.д. Уже проанализированы растительные смеси, содержащие пшеницу, ячмень, сою, кукурузу, люцерну и подсолнечник [35, 37, 38].
Таким образом, на данный момент с использованием различных ТВР-маркеров исследованы представители 11 семейств высших растений (см. табл.). В то время как исследования Бревиарио с коллегами сосредоточены на двудольных травянистых растениях, нами была сделана оценка применимости ТВР для злаков и древесных растений. Так, с помощью ТВР-метода удалось выявить межсортовой полиморфизм у Hordeum vulgare L. и Тгiticum aestivum L., а также обнаружить внутривидовой полиморфизм различных популяций Aegilops biuncialis Vis. (по ТВР^ТВР-маркерам). ТВР-метод был успешно апробирован на отечественных сортах Camelina sativa (L.) Crantz, Eleusine coracana Gaertn. и Eleusine indica (L.) Gaertn.
Список видов растений, проанализированных с помощью ТВР-метода
№ Вид растения Тип интронов [анализируемые диапазоны] Литературный источник
Покрытосеменные, двудольные
Капустные (Brassicaceae)
1. Brassica napus L. I-интрон [205-275 п.н.], I-интрон и II-интрон (сТВР) [I: 300-600 п.н., II: 500-1000 п.н.], I-интрон (ТВР) [3002000 п.н.], CE-TBP [360-950 п.н.] [17, 27, 35]
2. Camelina Crantz I-интрон + II-интрон (h-TBP) [600-2000 п.н.], II-интрон (сТВР) [300-880 п.н.], I-интрон (ТВР) [300-4000 п.н.] [33, 34]
Продолжение таблицы
№ Вид растения Тип интронов [анализируемые диапазоны] Литературный источник
Бобовые (Fabaceae)
3. Lotus L. I-интрон (TBP), I-интрон и II-интрон (cTBP) [205-275 п.н.] [17, 32]
4. Trifolium L. I-интрон и II-интрон (cTBP) [300-1500 п.н.] [32]
5. Glycine L. I-интрон (TBP), I-интрон CE-TBP [305-1110 п.н.] [35]
6. Medicago L. I-интрон (TBP) [300-2000 п.н.], I-интрон CE-TBP [650-1000 п.н.] [35]
7. Phaseolus vulgaris L. I-интрон и II-интрон (cTBP) [I: 300-2000 п.н., II: 200-1500 п.н.] [28]
Мареновые (Rubiaceae)
8. Coffea L. I-интрон (TBP) [587-1000 п.н.] [17]
Розоцветные (Rosaceae)
9. Rosa spp. I-интрон и II-интрон (cTBP) [I: 4000-1500 п.н., II: 300-1200 п.н.] [32]
Астровые (Asteraceae)
10. Crepis spp. I-интрон (TBP/cTBP) [330-1500 п.н.] [32]
11. Helianthus L. I-интрон (TBP) [360-1020 п.н.], I-интрон CE-TBP [370—2000 п.н.] [35]
12. Achillea L. I-интрон (TBP) [100-1200 п.н.] [39]
Гречишные (Polygonaceae)
13. Rumex acetosa L. I-интрон (TBP/cTBP) [330-1500 п.н.] [32]
Подорожниковые (Plantaginaceae)
14. Veronica persica Poiret. I-интрон (TBP/cTBP) [330-1500 п.н.] [32]
15. Plantago lanceolata L. I-интрон (TBP/cTBP) [330-1500 п.н.] [32]
Страстоцветные (Passifloraceae)
16. Passiflora L. I-интрон (TBP), I-интрон CE-TBP [380-1500 п.н.] [36]
Льновые (Linaceae)
17. Linum usitatíssimum L. I-интрон (TBP) [400-3000 п.н.] [*]
Буковые (Fagaceae)
18. Quercus L. I-интрон (TBP) [200-2000 п.н.] [*]
Покрытосеменные, oднодольные
Злаки (Poaceae)
19. Eleusine Gaertn. I-интрон и II-интрон (cTBP) [I: 300-1500 п.н., II: 200-1500 п.н.], I-интрон (TBP) [200-2000 п.н.] [27, *]
20. Arachis L. I-интрон и II-интрон (cTBP) [I: 300-1500 п.н., II: 200-1500 п.н.] [27]
21. Oryza L. I-интрон и II-интрон (cTBP) [28]
22. Nardus stricta L. I-интрон (TBP/cTBP) [300-1500 п.н.] [32]
23. Phleum pratense L. I-интрон (TBP/gTBP) [300-1500 п.н.] [32]
24. Festuca violacea Gaudin. I-интрон (TBP/cTBP) [300-1500 п.н.] [32]
25. Deschampsia cespitosa (L.) P. Beauv. I-интрон (TBP/cTBP) [300-1500 п.н.] [32]
26. Bromus hordaceus L. I-интрон (TBP/cTBP) [300-1500 п.н.] [32]
Окончание таблицы
№ Вид растения Тип интронов [анализируемые диапазоны] Литературный источник
Злаки (Poaceae)
27. Poa L. I-интрон (ТВР/сТВР) [330-1500 п.н.] [32]
28. Arrhenatherum P. Beauv. I-интрон (ТВР/сТВР) [330-1500 п.н.] [32]
29. Holcus lanatus L. I-интрон (ТВР/сТВР) [330-1500 п.н.] [32]
30. Phalaris arundinacea L. I-интрон (ТВР/сТВР) [330-1500 п.н.] [32]
31. Dactilis glomerata L. I-интрон (ТВР/сТВР) [330-1500 п.н.] [32]
32. Triticum L. I-интрон (ТВР) [300-2000 п.н.], I-интрон CE-ТВР [350-840 п.н.], I-интрон (ТВР) [300-2000 п.н.] [35, 40]
33. Zea L. I-интрон (ТВР) [300-2000 п.н.], I-интрон CE-ТВР [550-1020 п.н.] [35]
34. Hordeum L. I-интрон (ТВР ) [300-2000 п.н.], I-интрон CE-ТВР [400-900 п.н.] [35, 40]
35. Aegilops L. I-интрон (ТВР), I-интрон + II-интрон (h-ТВР) [300-4000 п.н.] [41]
* - результаты приведены в данной статье
Нами был проведен ТВР-анализ перспективных масличных сортообразцов C. sativa из коллекции Национального ботанического сада им. Н.Н. Гришко НАН Украины: сортов Перемога, Клондайк, Мираж, Евро-12, а также селекционных линий ЕОРЖЯФ-1, ЕОРЖЯФ-2, ЕОРЖЯФ-3, ЕОРЖЯФ-4, ЕОР-ЖЯФ-5, ЕОРЖЯФЧ, ЕОРЖЯФЧП и ЕОР-ЖЯФД. Из полученной электрофореграммы (рис. 2 а) видно, что все ампликоны - участки интронов Р-тубулина - имеют длину в диапазоне от 295 до 3200 пар нуклеотидов (п.н.). Примечательным является то, что у С. sativa образуется большое количество продуктов амплификации (около 50) и все они четко различимы на электрофореграмме. Значительная часть зон являются мономорфны-ми - представленными единственным амп-ликоном. В целом можно выделить 7 четких полиморфных зон, расположенных в диапазонах 295-300 п.н., 350-400 п.н., 600-700 п.н., 1000-1100 п.н. Например, для сортообразцов ЕОРЖЯФ-3 и Евро-12 характерно наличие фрагментов размером 295 п.н., а для ЕОР-ЖЯФ-5 и ЕОРЖЯФЧП - 370 п.н. (у остальных образцов образуются фрагменты длиной 375 п.н.). У 4 из 12 сортообразцов наблюдается фрагмент 660 п.н. (Мираж, ЕОРЖЯФ-1, ЕОРЖЯФ-5, ЕОРЖЯФЧП), у остальных восьми - 650 п.н. Ампликон размером 1085 п.н.
обнаружен только у образца ЕОРЖЯФЧ. Таким образом, например, сортообразец ЕОРЖЯФЧ отличается от других наличием ампликонов 660 п.н., 1085 п.н. и отсутствием - 295 п.н., 375 п.н., 650 п.н. и 1110 п.н.
ТВР-метод также продемонстрировал дифференцирующую способность при исследовании представителей рода Eleusine Gaertn. Было исследовано 2 сорта E. coracana украинской селекции (Тропиканка и Евгения), два сомакло-нальных варианта SE-1 и SE-4, полученные из сорта Тропиканка, 2 генотипа E. indica (4А-2-1, 4А-1) и природная популяция E. indica. При этом, хотя часть ампликонов является одинаковой для всех образцов, возможно, являясь специфичными для рода Eleusine, различия легко заметны как между разными видами, так и между генотипами в пределах одного вида. Результаты электрофоретического анализа (рис. 2 б) свидетельствуют о том, что во время амплификации образуются продукты длиной от 100 до 4440 п.н. Однако более четкие зоны располагаются в диапазоне от 370 до 4440 п.н. Различия между двумя видами заключаются в том, что у E. coracana чаще наблюдаются ампликоны 1440 п.н., 855 п.н., 1190 п.н., а у E. indica - 1410 п.н., 830 п.н., 980 п.н. Кроме того, ампликон 450 п.н. присутствует у всех образцов E. indica, а у E. coracana - только у сорта Евгения и сомаклонального варианта
Рис. 2. Электрофореграмма с ампликонами интронов генов р-тубулина: а - C. sativa; б - Eleusine; в - L. usitatissimum. Прямоугольниками отмечены полиморфные зоны; М - маркер; К - контроль; 1-15 (в верхней части рисунка) - номера образцов. а - 1-12: сорта и сортообразцы C. sativa: Мираж, ЕОРЖЯФ-2, ЕОРЖЯФ-3, Евро-12, ЕОРЖЯФ-4, Перемога, Клондайк, ЕОРЖЯФЧ, ЕОРЖЯФ-1, ЕОРЖЯФ-5, ЕОРЖЯФЧП, ЕОРЖЯФД; б - 13-16: E. coracana (сорт Тропиканка, сомаклональный вариант SE-1, сомаклональный вариант SE-4, сорт Евгения), 17-18: E. indica (4А-2-1, 4А-1), 19 - природная популяция E. indica; в - 20-26: сорта L. usitatissimum: Хейя-15, Хейя-13, Светоч, Свитанок, Антей, Zenga, Глазур
SE-1. Как ни странно, наибольшие отличия обнаружены для природной популяции E. indica -у нее отсутствует целый ряд ампликонов, ранее выявленных у вида E. indica: 610 п.н., 830 п.н., 980 п.н., 1575 п.н., 2130 п.н., 2370 п.н., 3640 п.н.; и имеются уникальные - 370 п.н., 540 п.н., 735 п.н. Таким образом, для дифференциации растений рода Eleusine оказалось достаточным использование лишь I-го интрона гена Р-тубулина.
Впервые проведенный нами ТВР-анализ нескольких сортов L. usitatissimum (рис. 2 в) показал, что амплифицируемые фрагменты находятся в диапазоне от 405 п.н. до 2820 п.н. Всего наблюдается 31 четкая зона, 16 из которых являются полиморфными. Ампликоны визуализируются в следующих диапазонах:
435-480 п.н., 665-730 п.н., 880-885 п.н., 1105 п.н., 1595-1895 п.н. Все изученные образцы имеют довольно четкий ТВР-профиль, по которому их можно дифференцировать друг от друга, что позволяет использовать этот метод в селекционной работе L. usitatissimum.
Вместе с тем, ТВР может быть использован в качестве источника генетических маркеров и при изучении древесных растений [39]. Лесное хозяйство является вторым по экономической значимости после сельского хозяйства возобновляемым биологическим ресурсом Украины. Если в решении биотехнологических и селекционных вопросов сельскохозяйственного производства уже давно применяются молекулярно-генетические маркеры, то в лесоведении они используются не так интенсивно.
Молекулярные маркеры позволяют картировать гены количественных признаков у ряда видов древесных растений. Такие исследования проводятся в первую очередь в отношении признаков, которые имеют значительный экономический интерес, а именно - скорость роста, качество древесины, устойчивость к экстремальным условиям среды, заболеваниям и вредителям. Это важное, значительно развитое в западных странах направление популяционной генетики лесообразующих древесных растений совсем не используется в Украине. Как свидетельствует мировой научный опыт, определение генетического полиморфизма аборигенных видов древесных растений, их популяционно-генетической структуры, ее воспроизведения в семенном потомстве и система скрещивания - только начальный уровень для получения информации о распределении адаптивной изменчивости сложных признаков на микро- и макроэволю-ционных уровнях.
В связи с этим была исследована применимость ТВР-метода для некоторых видов древесных растений, а именно: Quercus robur L, Fagus sylvatica L., Ulmus laevis L., Betula pendula L., Acerplatanoides L. , Picea abies (L.) H. Karst., Pinus sylvestris. Установлено, что по полиморфизму длины только первого ин-трона гена ß-тубулина у Q. robur отличаются растения внутри одной популяции. Размеры ампликонов варьируют в пределах от 295 п.н. до 1820 п.н. Для Fagus L. и Pinus L. диапазон варьирования ампликонов составляет 3003500 п.н. и 300-3000 п.н., соответственно.
В целом, на сегодняшний день несколько лабораторий успешно используют семейство генов ß-тубулина для оценки генетического разнообразия и эволюционных исследований среди эукариотических видов. Все они охарактеризовали ТВР метод как доступный инструмент для генетического анализа и селекционной работы.
Заключение
Опубликованные на данный момент результаты ТВР-анализа у растений свидетельствуют о том, что данный метод, основанный на изучении полиморфизма длины интро-нов генов ß-тубулина, является удобным и надежным подходом, применимым для ши-
рокого спектра видов растений. Он может быть использован для характеристики межи внутривидового разнообразия, а также для построения генетических карт, поскольку непосредственно отражает вариации, происходящие внутри генов. Метод применим в молекулярно-филогенетическом анализе, для предварительной характеристики и распознавания различных сортов растений, быстрого фингерпринтинга популяций. Этот инструмент имеет хорошие перспективы в селекционных исследованиях, направленных на улучшение агрономических и биохимических признаков сельскохозяйственных культур. В целом метод, основанный на оценке полиморфизма длины интронов генов Р-тубулина (ТВР), является быстрым, недорогим, простым и надежным, и практически не требует наличия предварительных сведений о геноме растений, но вместе с тем является обильным источником генетической информации.
Список использованных источников
1. Schulman, A.H. Molecular markers to assess genetic diversity / A.H. Schulman // Eu-phytica. - 2007. - Vol. 158. - Р. 313-321.
2. Хавкин, Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур / Э.Е. Хавкин // Сельскохозяйственная биология. - 2003. - № 3. - С. 26-41.
3. Конарев, А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими реcурсами растений / А.В. Конарев // Сельскохозяйственная биология. - 1998. -№ 5. - С. 3-25.
4. Генотипирование сортов яблони российской селекции с использованием микросателлитных маркеров / И. И. Супрун [и др.] // Известия ТСХА. - 2011. - № 6. -С.162-166.
5. Календарь, Р.Н. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение / Р.Н. Календарь, В.И. Глазко // Физиология и биохимия культурных растений. - 2002. -Т. 34. - № 4. - С. 279-296.
6. Dzialuk, A.B. PCR-multiplex of six chlo-roplast microsatellites for population studies and genetic typing in Pinus sylvestris / A.B. Dzialuk, J. Burchyk // Silvae Genet. - 2004. - Vol. 53. -№ 5-6. - P. 246-248.
7. Diwan, N. Automated sizing of fluorescent-labeled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in soybean / N. Diwan, P.B. Cregan // Theor. Appl. Genet. -1997. - Vol. 95. - P. 723-733.
8. Kalendar, R. IRAP and REMAP for ret-rotransposon-based genotyping and fingerprinting / R. Kalendar, A.H. Schulman // Nature Protocols. - 2006. - Vol. 1. - № 5. - Р. 2478-2484.
9. Харченко, П.Н. ДНК-технологии в раз-витииагробиологии/П.Н.Харченко,В.И.Глаз-ко // Москва: Воскресенье. - 2006. - 480 с.
10. Rafalski, J.A. RFLP map of soybean (Glycine max) 2N = 40. In: Genetic Maps (O'Brien, S.J., ed.) / J.A. Rafalski, S.V. Tingey // Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. - 1993. - P. 149-156.
11. Koebner, RM.D. Contributions of DNA molecular marker technologies to the genetics and breeding of wheat and barley / R.M.D. Koebner, W. Powell, P. Donini // Plant Breed. Rev. -2001. - Vol. 21. - P. 181-220.
12. Yang, Z. Comparison of models for nucleotide substitution used in maximum likelihood phylogenetic estimation / Z. Yang, N. Goldman, A. Friday // Mol. Biol. Evol. - 1994. - № 11. -Vol. 3. - P. 16-324.
13. Kimura, M. The neutral theory of molecular evolution / M. Kimura // Cambridge University Press, Cambridge. - 1983. - 332 p.
14. Morello, L. Plant spliceosomal introns: not only cut and paste / L. Morello, D. Breviario // Curr. Genomics. - 2008. - Vol. 9. - P. 227-238.
15. How introns influence and enhance eu-karyotic gene expression. / L.H. Herve [et al.] // Trends Biochem. Sci. - 2003. - № 28. - Vol. 4. -P. 215-220.
16. Breviario, D. Plant tubulin genes: Regulatory and evolutionary aspects [monograph on the internet] / D. Breviario // In Plant Microtubules (P. Nick, Ed.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg. - 2008. - P. 207-232.
17. Tubulin-based polymorphism (TBP): a new tool, based on functionally relevant sequences, to assess genetic diversity in plant species / M. Bardini [et al.] // Genome. - 2004. -Vol. 47. - P. 281-291.
18. Tissue-preferential expression of a rice a-tubulin gene, OsTubA1, mediated by the first intron / J.S. Jeon [et al.] // Plant Physiol. -2000. - Vol. 123. - P. 1005-1014.
19. A long leader intron of the OsTub16 rice beta-tubulin gene is required for high level gene expression and can autonomously promote transcription both in vivo and in vitro / L. Morello [et al.] // Plant J. - 2002. - Vol. 29. -P. 33-44.
20. Introns are key regulatory elements of rice tubulin expression / E. Fiume [et al.] // Planta. -2004. - Vol. 218. - P. 693-703.
21. Breviario, D. Multiple tubulins: evolutionary aspects and biological implications / D. Breviario, S. Gian, L. Morello // Plant J. - 2013. -Vol. 75. - P. 202-218.
22. Peter, N. Signaling to the microtubular cy-toskeleton in plants / N. Peter // Int. Rev. Cytol. -1998. - Vol. 184. - P. 33-80.
23. Nogales, E. Structural insights in to microtubule function / E. Nogales // Annu. Rev. Biochem. - 2000. - Vol. 69. - P. 277-302.
24. McKean, P.G. The extended tubulin su-perfamily / P.G. McKean, S. Vaughan, K. Gull // J. Cell Sci. - 2001. - Vol. 114. - P. 2723-2733.
25. Liaud, M.-F. The P-tubulin gene family of pea: primary structures, genomic organization and introndependent evolution of genes / M.-F. Liaud, H. Brinkmann, R. Cerff // Plant Mol. Biol. - 1992. - Vol. 18. -P. 639-651.
26. Luduena, R.F. Multiple forms of tubulin: different gene products and covalent modifications / R.F. Luduena // Int. Rev. Cytol. - 1998. -Vol. 178. - P. 207-275.
27. High polymorphism and resolution in targeted fingerprinting with combined beta-tubulin introns / D. Breviario [et al.] // Mol. Breed. -2007. - 20. - P. 249-259.
28. Plant tubulin intronics / D. Breviario [et al.] // Cell Biol. Int. - 2008. - Vol. 32. - P. 571-573.
29. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / J. Sambrook, W.R. David // Cold Spring Harbor. - 2001. - Vol. 2. - 763 p.
30. Optimization of a reliable, fast, cheap and sensitive silverstaining method to detect SSR markers in polyacrylamidegels / H. Benbouza [et al.] // Biotechnol. Agron. Soc. Environ. -2006. - № 10. - Vol. 2. - P. 77-81.
31. Optimization of PCR protocol in microsatellite analysis with silver and SYBR stains / M.H. Rahman [et al.] // Plant Mol. Biol. Reporter. - 2000. - Vol. 18. - P. 339-348.
32. cTBP: A successful intron length polymorphism (ILP)-based genotyping method targeted
to well defined experimental needs / L. Braglia [et al.] // Diversity. - 2010. - № 2. - P. 572-585.
33. Genomic fingerprinting of Camelina species using cTBp as molecular marker [Электронный ресурс] / I. Galasso [et al.] // Amer. J. Plant Sci. - 2015. - Режим доступа: http://www.scirp.org/journal/ajps; http://dx.doi. org/10.4236/ajps.2015.68122. - Дата доступа: 20.05.2015.
34. h-TBP: an approach based on intron-length polymorphism for the rapid isolation and characterization of the multiple members of the ß-tubulin gene family in Camelina sativa (L.) Crantz / I. Galasso [et al.] // Mol. Breeding. -2010. - Vol. 28. - P. 635-645.
35. Technical improvement of the TBP (tubu-lin-based polymorphism) method for plant species detection, based on capillary electrophoresis / F. Gavazzi [et al.] // Electrophoresis. - 2012. -Vol. 33. - P. 2840-2851.
36. TBP-assisted species and hybrid identification in the genus Passiflora / L. Braglia [et al.] // Mol Breed. - 2014. - Vol. 33. - P. 209-219.
37. A multiplex, bead-based array for profiling plant-derived components in complex food matrixes / E. Ponzoni [et al.] // Anal. Bioanal. Chem. - 2013. - Vol. 405. - P. 9849-9858.
38. Traceback identification of plant components in commercial compound feed through an oligonucleotide microarray based on tubulin in-tron polymorphism / E. Ponzoni [et al.] // Food Chem. - 2014. - Vol. 162. - P. 72-80.
39. nipKO, Я.В. Дослщження генетично! мшливосп pi3HHx видiв рослин за допомогою аналiзу полiморфiзму штрошв гешв Р-тубул^ / Я.В. Шрко // Промышленная ботаника. - 2011. - № 11. - С. 152-156.
40. Дослщження полiморфiзму довжини ш-трошв гешв Р-тубулина у сор^в Triticum aesti-vum L. та Hordeum vulgare L. / А.М. Рабоконь [та ш.] // Фактори експериментально'1 еволюцп органiзмiв: збiрник наукових праць. - К.: Логос, 2015. - Т. 17. - С. 82-86.
41. Intron length polymorphism of P-tubulin genes of Aegilops biuncialis Vis. / A. Rabokon [et al.] // The Open Plant Sci. J. - 2015. (in press).
Дата поступления статьи 18 августа 2015 г.
