CC BY
9DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-32-6-17 УДК 582.951.4;575.164;575.222.7;575.852
Е. В. Дрозд1, О. Г. Бабак1, Н. А. Некрашевич1, Н. В. Анисимова1, Т. В. Никитинская1, К. К. Яцевич1, И. В. Гашкова2, А. М. Артемьева2, А. В. Кильчевский1
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ НАКОПЛЕНИЯ АНТОЦИАНОВ У SOLANUMMELONGENA L. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ R2R3 МУВ-АКТИВАТОРА
Тосударственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: e.drozd@igc.by
2ФГБНУ ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова (ВИР) Россия, 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 42-44
На основе сопоставления накопления антоцианов в различных частях растений баклажана и полиморфизмов гена Mybl S. melongena с использованием статистического метода Хи-квадрат подтверждена высокая эффективность молекулярных маркеров, выявляющих аллели Myb1-del6 иMyb1-del26 S. melongena, связанные с нарушением синтеза антоцианов в плодах. В результате изучения характера накопления антоцианов в плодах S. melongena в зависимости от аллельного состава гена Mybl у гибридов F1 и популяций F2-F3 установлен промежуточный характер наследования признака «накопление антоцианов в различных частях растений» у гетерозиготных форм с аллелями Myb1-del6иMyb1-del26гена Mybl баклажана. Показана полная идентичность нуклеотидного состава экзонных областей генаMyb2 S. melongena у форм с различным накоплением антоцианов в плодах. С помощью разработанных маркеров получен новый селекционный материал для создания сортов для функционального питания.
Ключевые слова: Solanum melongena, регуляция синтеза антоциана, ДНК маркеры, генетический полиморфизм.
Введение
Баклажаны являются одной из овощных культур, возделываемых в закрытом грунте в Беларуси. Важность данной культуры в питании человека связана с диетическими свойствами, что обусловлено низким содержанием углеводов (причем большая часть в виде клетчатки) и практически полным отсутствием жиров в плодах [1]. Цвет плодов баклажанов является не только отличительной чертой, характеризующей сорт, но и важным критерием, который влияет на выбор производителей и потребителей. Плоды баклажана характеризуются различной окраской кожицы: от белой, зеленой до темно-фиолетовой. Фиолетовый цвет плодов главным образом определяется присутствием вторичных метаболитов — антоцианов [2, 3]. Производители часто отдают предпочтение сортам с фиолетовыми плодами, поскольку у плодов с такой окраской легче определить стадию технической зрелости, что важно, так как при переходе в стадию биологи-
ческой зрелости плоды накапливают соланин, придающий им горький вкус. Потребители также чаще выбирают плоды с накоплением анто-цианов в кожице (фиолетовой окраски), обеспечивающих более высокую антиоксидантную, бактерицидную активности данных продуктов питания для человека. При этом использование в качестве продуктов питания плодов без антоцианов (зеленой и белой окраски) может иметь важное значение для людей, склонных к аллергенам баклажана [4] или в питании которых употребление веществ с высокой антиоксидантной активностью должно быть ограничено.
Принимая во внимание, что структурные гены пути биосинтеза антоцианов функционируют под контролем регуляторного комплекса, называемого MYB-bHLH-WD40 (MBW) [3], исследование аллельного полиморфизма генов этого регуляторного комплекса является важным. На основе представленных последовательностей гена МуЬ1 К2К3-МУВ фактора,
связанного с накоплением антоцианов [5, 6], в Институте генетики и цитологии к настоящему моменту установлены полиморфизмы гена МуЬ1, разработаны маркеры к аллелям, связанным с нарушением синтеза антоцианов в плодах. Аллель МуЬ1 сорта Зелёненький характеризуется наличием делеции размером 6 п. н. в конце экзона 1, которая приводит к выпадению двух аминокислот в белке и образованию плода зеленого цвета. Аллель МуЬ1 сорта баклажана Снежный отличается от аллеля МуЬ1, обеспечивающего нормальный синтез антоциа-нов, делецией размером 26 п. н., охватывающей конец интрона 1-начало экзона 2, и 11 ЗЫР в кодирующих областях изучаемого гена. Показано, что 26 п. н. делеция в гене МуЬ1 приводит к нарушению сплайсинга и сокращению мРНК на область второго экзона [7, 8]. Выявленные новые аллели МуЬ1^в16 и МуЬ1^е126 были включены в электронную генетическую базу GenBank [5]. Среди изучаемых образцов выделена форма Грушевидный, у которой при активном накоплении антоцианов в вегетативной части плоды оставались зелеными, при этом в генотипе сорта присутствует аллель МуЬ1, обеспечивающий нормальный синтез антоци-анов. Сделано предположение о влиянии других генов на проявление признака накопления антоцианов в плодах у данного образца [7, 8].
Целью данных исследований было статистическое подтверждение эффективности разработанных ранее маркеров аллелей МуЬ1^16 и МуЬ1^е126 на широком материале и изучение особенностей проявления антоциановой окраски у гибридов F популяции F2 и F3 форм баклажана с различным сочетанием выявленных аллелей гена МуЬ1. Для этого были поставлены следующие задачи: оценить наблюдаемое проявление окраски плода и проанализировать его соответствие с распределениями аллелей в генотипах образцов популяций F2 и F3 по критерию Хи-квадрат (х2); осуществить поиск полиморфизма гена МуЬ2 у образцов с различным накоплением антоцианов и оценить его связь с фенотипическим проявлением анто-циановой окраски плодов.
Материалы и методы исследования
Объектами для сопоставления особенностей фенотипического проявления антоциано-вой окраски различных частей растений (плод,
цветок, лист, стебель) и аллельного состава гена Mybl, а также для секвенирования гена Myb2 с целью поиска возможных полиморфизмов являлись коллекционные образцы баклажана из Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова. Для изучения особенностей проявления признака «накопление антоцианов в плодах» использовали 18 созданных гибридов Fj между сортами с различными аллелями гена Mybl: Пеликан х Линия 9 Jokuwase t. s. n. (Mybl-del26/Mybl), Пеликан х Зелёненький (Mybl-del26/Mybl-del6), Донецкий урожайный х Грушевидный (Mybl-del6/Myb1), Донецкий урожайный х Снежный (Myb1-del6/Myb1-del26), Зелёненький х Линия 2 Jokuwase t. s. n. (Mybl-del6/Mybl-del26), Зелёненький х Грушевидный (Myb1-del6/ Mybl), Зелёненький х Линия 9 Jokuwase t. s. n. (Myb1-del6/Myb1), Снежный х Зелёненький (Myb1-del26/Myb1-del6), Снежный х Линия 9 Jokuwase t. s. n. (Myb1-del26/Myb1), Снежный х Грушевидный (Myb1-del26/Myb1), Грушевидный х Пеликан (Mybl /Mybl-del26), Грушевидный х Зелёненький (Mybl/Mybl-del6), Грушевидный х Снежный (Mybl/Mybl-del26), Синдбад Пинкстрип х Грушевидный (Mybl/Mybl), Синдбад Пинкстрип х Линия 9 Jokuwase t. s. n. (Mybl/Mybl), Король Севера х Shina omaru nasu (Mybl/Mybl), Shina omaru nasu х Король Севера (Mybl/Mybl), Линия 2 Jokuwase t. s. n. х Зелёненький (Mybl-del26/Mybl-del6). Для установления эффективности разработанных маркеров использовали популяции F2 и F3 созданных гибридов. Образцы изучаемых культур характеризовались широким фенотипическим полиморфизмом по признаку «накопление антоцианов в плодах».
Выделение ДНК проводили при помощи Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) из молодых верхушечных листьев растений баклажана согласно протоколу производителя. Количество ДНК в образце определяли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro (Швеция).
ДНК-типирование аллелей гена Mybl созданных гибридов и расщепляющихся популяций проводили с использованием ранее подобранных праймеров [7, 8]. ПЦР-реакцию проводили в Термоциклере Biometra T Professional Basic (Германия). Реакционная ПЦР-смесь объемом 15 мкл содержала
60-100 нг геномной ДНК; 2,5 мМ dNTP Mix (Thermo Scientific), и 1,4 единицы Tornado DNA-полимеразы в инкубационном буфере «F» (Праймтех, Беларусь) и 0,25 пмоль/мл праймеров (Праймтех, Беларусь). Режим ПЦР был следующим: 95 °C — 15 мин, затем следовало 35 циклов: 99 °C — 1 с, 55-60 °C — 30 с и 72 °C — 1 мин. Реакцию завершали при 72 °C в течение 7 мин.
Продукты ПЦР реакции разделяли методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия и документировали с помощью системы Bio-Rad GelDoc2000 (США). Размеры амплифициро-ванных фрагментов определяли при использовании в качестве маркера молекулярного веса 100 bp Plus DNA ladder (Thermo Scientific). Продукты ПЦР с использованием SCAR маркера MybMel с флюоресцирующей меткой разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием ДНК-секвенатора ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Размер ампликонов определяли с использова-
Секвенирующие реакции выполняли с применением набора Big Dye® Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) согласно методике производителя. Продукты секвенирующей реакции очищали спиртовым осаждением и растворяли в 20 мкл формамида, денатурировали нагреванием до
нием стандарта Liz500.
Оценка соответствия между наблюдаемыми и ожидаемыми распределениями оценивалась методом х2, где общей мерой отклонения практических данных от теоретических, т. е. критерия соответствия х2, является сумма отношений квадратов разностей между частотами практического fn и теоретического Fn распределений к частотам теоретического Fn распределения для данной группы (формула 1) [9].
X2 = I ((/„ - / Рп (1)
Нуклеотидные последовательности экзон-ных областей гена МуЬ2 у образцов баклажана определяли путем секвенирования. Для этого фрагменты амплификации, полученные на геномной ДНК с подобранными нами гено-специфическими праймерами (табл. 1) были секвенированы. Для дизайна праймеров использовали программу Primer-BLAST на сайте Национального центра биотехнологической информации США.
95 °C в течение 2 мин и далее проводили капиллярный электрофорез с использованием ДНК-секвенатора ABI 3500. Компьютерную обработку данных, полученных в результате секвенирования, проводили в программе Sequencing Analysis Software v 5.2 (Applied Biosystems).
Таблица 1
Список праймеров, использованных для секвенирования гена Myb2
Наименование праймера Область секвенирования Последовательность праймера, 5' ^ 3' Температура отжига, С Размер ПЦР продукта, н. п.
Myb2-1F/R Экзон 1 ACAGCTAATAGGGGTTTGAACA 57 547
TGTTTCCACTATAAAAGATAAGACC
Myb2-2F/R Экзон 2 CAAGGCAAAGGATCTTCTAAACC 57 537
TTAGAAGAGCAGTAGTGAGTATC
Myb2-3F/R Первая часть экзона 3 CTTAATACATGACGTGGACCATC 59 748
CTGAAAAGTCATCCCAACCATC
Myb2-4F/R Вторая часть экзона 3 GACCTTCTCAAGTGCAAAGAATG 58 626
GCTAACCCCGATCATTTTAGT
Результаты и их обсуждение
В ранее выполненных исследованиях [7, 8] с помощью разработанных маркеров аллелей Myb1-del26, Myb1-del6, Mybl проведено ДНК-типирование широкой коллекции сортов баклажана и расщепляющейся популяции Jokuwase t. s. n. Для этого были использованы SCAR маркер Mybmel (для типи-рования аллеля Myb1-del26) и CAPS маркер МуЬте1^и(для типирования аллеля Mybl-del6). Однако, учитывая небольшие различия в размерах продуктов, получаемых при ис-
М 1 2 J 4SS7S а ш ц U 14 11 16 17 1» 1»
----- ----------- --- ----
м 1 I s ь 1 г ч 10 н U 1! ]• 15 1»
пользовании SCAR маркера Mybmel, типиро-вание гетерозиготных форм было затруднено, особенно при одновременном наличии в генотипе Myb1-del26, Myb1-del6, что показано на рисунке 1.
С целью дальнейшего совершенствования методов выявления данных полиморфизмов разработан SCAR маркер MybMel dеl6-26. Для четкого разделения ампликонов с минимальными различиями в размерах использовали прямой праймер MybMel с флуоресцентной меткой и последующим анализом продукта
43ЪР 453,4291, р 455Ър
Рис. 1. Продукты амплификации ДНК образцов гибридов F1: А — Зелёненький х Линия 9 Jokuwase 1 s. п. (МуЬ1-del6/Мyb1); Б — Снежный х Зелёненький (МyЪ1-del26/МyЪ1-del6); В — Пеликан х Линия 9 Jokuwase 1 s. п.
(МуЪ1^е126/МуЪ1)
на генетическом анализаторе. Данный способ типирования позволил четко выявлять оба аллеля, связанных с нарушением синтеза анто-цианов в гомо- и гетерозиготных формах. В результате ДНК-типирования на генетическом анализаторе выявлялись фрагменты размером 429, 449, 455 п. н., характеризующие аллели МуЪ1-ёе126, МуЪ1-ёе16, МуЬ1 соответственно.
По результатам ДНК-анализа и фенотипиче-ской оценки для изучения особенностей про-
явления признака «накопление антоцианов в плодах» были созданы гибриды Б1 с различными аллелями, ряд фенотипов которых представлен на рисунке 2.
В 2020 году испытывались 18 гибридов Б1 баклажана с различными полиморфизмами гена МуЪ1. Оценка данных гибридов проводилась в 2 этапа — в зимний период в теплицах Минской овощной фабрики и в летний период в теплицах БОС Института генетики и цито-
А Б В Г Д
Рис. 2. Проявление интенсивности антоциановой окраски на стебле, плодах, листьях и венчике цветка у сортов баклажана с выявленными полиморфизмами: А — Линия 9 Jokuwase 1 s. п. (МуЪ1); Б — Грушевидный (МуЪ1); В — Зелёненький (МуЪ1^е16); Г — Пеликан (МуЪ1^е126); Д — Линия 2 Jokuwase 1 s. п. (МуЪ1^е126)
логии НАН Беларуси. В результате исследования соответствия изучаемых аллелей и их фе-нотипического проявления у коллекционных образцов и расщепляющегося поколения гете-
розиготной формы баклажана Jokuwаse 1. б. п. выявлен промежуточный характер наследования признака «накопление антоцианов в различных частях растений)) у гетерозиготных
форм с аллелями МуЬ1/МуЬ1 и МуЬ1^е126 гена МуЬ1 баклажана.
В ходе исследований проведен подробный анализ изменения антоциановой окраски плодов, стеблей и жилок листьев. Анализ гибридов F1 баклажана показал отсутствие ан-тоциана у гибридов с аллелями МуЬ1^е126 и МуЬ1^е16 во всех частях растения, кроме венчика (Пеликан х Зелёненький, Донецкий урожайный х Снежный, Снежный х Зелёненький). Окраска плода на стадии технической спелости у данной группы гибридов была белая или светло-салатовая. Гибриды между формами с нормальным аллелем гена МуЬ1 и МуЬ1^е126 (Снежный х Линия 9 Jokuwase t. s. п. и др.) илиМуЬ1^е16 (Зелененький х Линия 9 Jokuwase 1 s. п. и др.) имели проме-
жуточный характер накопления антоцианов в плодах и вегетативных частях растений. Гибриды, одним из родителей которых был сорт Грушевидный, характеризующийся активным накоплением антоциана в вегетативных частях и его отсутствием в плодах (при наличии нормального аллеля МуЬ1/МуЬ1), имели белые и зеленые плоды в комбинациях скрещивания с МуЬ1^е126 или МуЬ1^е16 и промежуточный характер накопления в вегетативных частях (Зелёненький х Грушевидный, Снежный х Грушевидный); в комбинациях скрещивания с аллелем МуЬ1 плоды имели промежуточный характер накопления антоциана в плодах и вегетативных органах (Синдбад Пинкстрип х Грушевидный) (рис. 3).
Выращивание образцов в защищенном грун-
Рис. 3. Проявление интенсивности антоциановой окраски на стебле, плодах, листьях и венчике цветка у сортов баклажана с выявленными полиморфизмами: А — Пеликан х Зелёненький (МуЬ1-ёе126/МуЬ1-ёе16); Б — Донецкий урожайный х Грушевидный (МуЬ1-ёе16/МуЬ1); В — Пеликан х Линия 9 Jokuwase 1. п. (МуЬ1-ёе126/ МуЬ1-МуЬ1); Г — Донецкий урожайный х Снежный (МуЬ1-ёе16/МуЬ1-ёе126); Д — Синдбад Пинкстрип х Линия
9 Jokuwase 1 8. п. (МуЬ1/МуЬ1)
те в зимний период позволило в летний период, наряду с испытанием гибридов F провести испытание и оценку расщепляющегося материала 9 популяций следующих гибридов F2: Пеликан х Линия 9 Jokuwase 1. 8. п., Зелёненький х Линия 9 Jokuwase 1. 8. п., Снежный х Зелененький, Донецкий урожайный х Снежный, Снежный х Линия 9 Jokuwase 1. 8. п., Грушевидный х Пеликан, Грушевидный х Снежный, Shina omaru пази. х Король Севера. По результатам испытания гибридов F1 выделен гибрид баклажана Синяя птица, который после оценки ГСИ включен в Реестр сортов сельскохозяйственных растений Беларуси.
Для сопоставления фенотипического проявления признака «накопление антоцианов различными частями растений» и аллелей гена МуЬ1 выполнено ДНК-типирование 371
растения изучаемых популяций. Для подтверждения статистической достоверности эффективности разработанных маркеров были использованы популяции F2: Зелёненький х Линия 9 Jokuwase 1. 8. п. — 148 растений и Пеликан х Линия 9 Jokuwase 1. 8. п. (МуЬ1-del26/МyЬ1) — 158 растений. Был проведен анализ соответствия фенотипических признаков проявления антоциановой окраски на вегетативных органах и аллелей МуЬ1 методом Хи-квадрат, результаты которого представлены в таблицах 2 и 3.
В 2021 году был выращен и протипирован расщепляющийся материал 6 популяций F3 (по 200 растений на популяцию) следующих гибридов: Пеликан х Линия 9 Jokuwase 1. 8. п., Синдбад Пинкстрип х Линия 9 Jokuwase 1. 8. п., Синдбад Пинкстрип х Грушевидный,
Таблица 2
Результаты анализа расщепления популяции — Зелёненький х Линия 9 Jokuwаse 1. б. п.
(МуЪ1-ёе!6/МуЪ1) методом х2
Показатели Расщепление Сумма
МуЪ1-йе16/МуЪ1-йе16 МуЪ1/МуЪ1-йе16 МуЪ1/МуЪ1
Ожидаемое расщепление (НО) 1 2 1 5
Наблюдаемые частоты (/) 31 79 38 148
Ожидаемые частоты 37 74 37 148
Разность частот (/Г) -6 5 1 -
Квадрат разности (/Г)2 36 25 1 -
Отношение (/Г)2^ 0,97 0,33 0,02 0,99 = х2
Фенотипическое проявление антоциана на вегетативных органах слабое на стебле среднее и сильное на стебле и жилках листьев сильное на стебле и жилках листьев
Примечание.
Нулевая гипотеза (Н0) — ожидаемое расщепление: 1 МуЪ1^е16/МуЪ1^е16 : 2 МуЪ1/МуЪ1^е16 : 1 МуЪ1/МуЪ1 Чисто степеней свобод — (с-1) х (к-1) = (3-1) х (2-1) = 2; х2теор = 6,0;
Х2факт = 0,99 < х2теор = 6,0, следовательно, гипотеза верна и расщепление соответствует 1 : 2 : 1.
Таблица 3
Результаты анализа расщепления популяции — Пеликан х Линия 9 Jokuwase 1. б. п
(МуЪ1-ёе126/МуЪ1) методом х2
Показатели Расщепление Сумма
МуЪ1-йе126/МуЪ1-йе126 МуЪ1/МуЪ1-йе126 МуЬ1/МуЬ1
Ожидаемое расщепление (НО) 1 2 1 5
Наблюдаемые частоты (/) 40 81 37 158
Ожидаемые частоты 39,5 79 39,5 158
Разность частот (/Г) 0,5 2 -2,5 -
Квадрат разности (/Г)2 0,25 4 6,25 -
Окончание таблицы 3
Показатели Расщепление Сумма
МуЪ1-йе126/МуЪ1-йе12в МуЪ1/МуЪ1-йе126 МуЬ1/МуЬ1
Отношение (/Г)2^ 0,006 0,05 0,15 0,2 = х2
Фенотипическое проявление антоциана на вегетативных органах слабое на стебле среднее и сильное на стебле и жилках листьев сильное на стебле и жилках листьев
Примечание.
Нулевая гипотеза (Н0) — ожидаемое расщепление: 1 МуЬ1-йе126/МуЬ1-йе126 : 2 МуЬ1/МуЬ1-йе126 : 1 МуЬ1/МуЬ1 Чисто степеней свобод — (с-1) х ^-1) = (3-1) х (2-1) = 2; х2тео = 6,0;
Х2ф = 0,2 < х2 = 6,0, следовательно, гипотеза верна и расщепление соответствует 1 : 2 : 1.
Донецкий урожайный х Грушевидный, Снежный х Грушевидный, Зелёненький х Грушевидный. Для сопоставления с фенотипиче-ским проявлением признака в теплицы было высажено по 10-15 растений с различными вариантами сочетания аллелей в связи с ограниченными размерами площади. В таблице 4 представлены результаты данного сопоставления. По результатам оценки популяций F3 отобраны формы для создания новых сортов и гибридов с различным накоплением антоци-анов в плодах.
Согласно результатам оценки, фенотипиче-
ское проявление антоциановой окраски у высаженных растений в популяциях F2 и F3 соответствовало ожидаемому по результатам ДНК-типирования образцов. Как и по ранее полученным результатам, выделились формы, одним из родителей которых являлся сорт Грушевидный. Возможно, данное фенотипическое проявление вызвано действием других регуля-торных генов, определяющих процесс биосинтеза антоцианов.
По результатам анализа литературы [10, 11] и поиска последовательностей МуЬ транскрипционного фактора в генетических
Наименование гибрида F1, аллели № образца F3 Размер ПЦР продукта, п.о. Аллель Наличие и интенсивность антоциановой окраски
Лист Плод Венчик цветка
Снежный х Грушевидный (МуЬ1-ёе126/ МуЬ1) Б41-2 455/429 МуЬ1Ш26 Средняя Салатовый Ярко-сиреневый
Б41-3 429 йе126 Отсутствует Салатово-белый Сиреневый
Б41-4 429 йе126 Отсутствует Зеленый Сиреневый
Б41-12 429 йе126 Отсутствует Светло-салатовый Сиреневый
Зелёненький х Грушевидный (МуЬ1-ёе16/ МуЬ1) Б42-5 455 йе16/МуЬ1 Средняя Зеленый Сиреневый
Б42-6 449/455 йе16/МуЬ1 Отсутствует Светло-зеленый Бледно-сиреневый
Б42-7 449/455 йе16/МуЬ1 Средняя Фиолетовый Бледно-сиреневый
Таблица 4
Проявление признака «накопление антоцианов различными частями растений» у форм баклажана в зависимости от аллелей гена МуЬ1
Окончание таблицы 4
Наименование гибрида F1, аллели № образца F3 Размер ПЦР продукта, п.о. Аллель Наличие и интенсивность антоциановой окраски
Лист Плод Венчик цветка
Донецкий урожайный х Грушевидный (МуЪ1^е16/ МуЪ1) Б43-1 455 Mybl Сильная Сиреневый Сиреневый
Б43-3 449/455 del6/Myb1 Средняя Светло-зеленый Бледно-сиреневый
Б43-7 455 Mybl Сильная Светло-сиреневый Сиреневый
Б43-10 449/455 del6/Myb1 Сильная Светло-салатовый Бледно-сиреневый
Б43-13 455 Mybl Легкая Сиреневый Сиреневый
Синдбад Пинкстрип х Грушевидный (МуЪ1/МуЪ1) Б44-2 455 Mybl Сильная Сиреневый Сиреневый
Б44-16 455 Mybl Средняя Светло-сиреневый Сиреневый
Б44-27 455 Mybl Средняя Бело-розовый Сиреневый
Б44-31 455 Mybl Средняя Светло-сиреневый Сиреневый
Синдбад Пинкстрип х Jokuwase 1. б. п. 9 рас. (МуЪ1/МуЪ1) Б45-2 455 Mybl Сильная Сиреневый Сиреневый
Б45-4 455 Mybl Сильная Фиолетовый Сиреневый
Б45-13 455 Mybl Сильная Фиолетовый Сиреневый
Б45-15 455 Mybl Сильная Светло-сиреневый Сиреневый
Пеликан х Jokuwase 1. б. п. 9 рас. (МуЪ1^е126/ МуЪ1) Б46-2 455/429 Mybl/del26 Сильная Фиолетово-белый Сиреневый
Б46-4 429 del26 Отсутствует Белый Сиреневый
Б46-10 455/429 Mybl/del26 Сильная Фиолетово-белый Сиреневый
Б46-11 429 del26 Отсутствует Белый Сиреневый
Б46-13 455 Mybl Сильная Бело-сиреневый Сиреневый
базах данных GenBank, SolGenomics для дальнейшего исследования выбрана последовательность гена Myb2 Solanum melongena. На основании данных о последовательностях ДНК генаMyb2 (SolGenomics, Sme2.5_05099.1) и мРНК (GenBank, KF727477.1) была установлена экзонно-интронная структура данного гена. В результате сравнения последовательностей генов Mybl (KT727965.1) и Myb2 (Sme2.5_05099.1) выявлено, что экзонная область гена Mybl короче на 66 п. н. Существенная разница обнаружена в величине интронов.
В последовательности гена МуЪ2 интроны составляют большую часть гена — около 81%, в то время как у гена МуЪ1 интронная область составляет 37%. На рисунке 4 представлены аминокислотные последовательности, формируемые на основе трех аллелей гена МуЪ1 и гена МуЪ2, а также выделены области доменов транскрипционных факторов. Данный рисунок демонстрирует, что выявленные полиморфизмы в аллелях гена МуЪ1-ёе126 (сорт Пеликан) и МуЪ1-ёе16 (сорт Зелёненький) приводят к нарушению структуры доменов в син-
тезируемых белковых соединениях, что делает невозможным нормальное взаимодействие доменов транскрипционного фактора с промоторами активируемых генов.
Для секвенирования последовательности гена МуЬ2 у коллекционных образцов баклажана с контрастной антоциановой окраской плодов, в том числе формы Грушевидный, по-
Первый долкн
1 10 20 30 40 SD 60
5. msfcnwna МуЬ TF ! |МуЬ1) 10727965 1 HNWPPIICTSVRVJ KGSSTEEEDLLLRKCHEKV J4HLVpjLRAOLNRCRKSCPLRtfLNTLRPHI HNWPPI ICTSVRVRKGS1ITEEEDLLLFKCMEKYGEGKIJHLVPARAI>GHLI.LVUFREGPQTM----- BHHFPI ICTBVRVI'KGStnT EEELL LRRCHEK VCTGWIffLVP--iGLNRi;Ei!SGBL FtBLNYLRPH I -!t;UMJV;."SLGVP.f:GMlUE"EDLLLPh:CMD: .'GEGKl'HLVPLIESGLNRCRKSCRLÄBLNYLRPHI
S. roetongena Pelikan Myb TF 1 (МуЫ) Myb1*tel26 all.. S, melonsanaZetenerfkjTF l МуЫ -dtB«teleM... S. rnelonoena R2R3-MYB TF(MYB2) KF727477.1
Второй домен
67 .70 ,80 ,90 100 110 ¡ISO >30
S. melongena Myb TF 1 (МуЫ) KT727965.1 es 65 BG 133 KRGDFiSDEVDLILRLKKLLGNRlTSLIAGRLRCRTAMS-VKNYUMTHLLRKFTIAP---OKINHTCK
S. mefongena Pelikan Myb TF 1 (Myb!) МуЫ -iW2B all... ü. melongena Zelenentyj Myb IF 1 Mjibl-delG aflele M 5. melongena FI2FI3-MliB TF (MYB2) KF72?477.1 1
KRGDFASTEVDLILRLHKLLGHRÜSLIAGRLPGRTANDVMYWJTWLLRKFTIAP---QKINHTCK KRGDFA; CEIDLILRLKKLLa^lRÜSLIiGRf-PERUjLlJItU'KN'iHHUtiiaKKLrajSRPQHQERKiLjMJl 140 ISO 160 170 180 190
S. melongena Myb TF 1 (МуЫ I КТ7279Б5.1 ~üü S2 126 132 2M D113THE11RPÜP R-------------------KVLS3I KKIENL THNHVIV DKE ERC KEIT------
S. melongsniPslikan Myb TF 1 |Mjfc1! Mybl-dtCB sä.. S. melongenaZeleoen'kÄ Myb TF 1 МуЫ -itelG alele M... S. melongena F 2RiMYS T F (MYB Jj KF727477.1
DT ISTNEIIRPQPR-------------------KTL3SIKKKHLTHHMVIVDKEERCKEIT------ LKITIL-TIUIlRPÜPRPPPPPPPPPPPPPRUFSSAKMVSBCUlJ.-m.IlJMVLD.-.jHERHKEIGVMUCEK ZOO 210 220 230 240 250 260
S. melongena Myb TF 1 (МуЫ) КТ727Э65 1 372 S2 ITH ISS 266 -SDEQTniASHDMODÜUilKSLLEHFHDDAVEüEEE-iVTHYEKTLTSLLHEEISSPPLNGCCWSHii
S. mefcmgens RelikanMyb TF 1 IMybl] Mybl'deC6all... S. melongena Zelerten'kij Myb TF 1 Mybl -deiS aiele M.. S. melongena R2R3-MYB TF ¡MYB2) KF727477.1
-SDKQTTtiASHDirODQmKSLLEHFHDDAVEGEEE-AVTHY'EKTLTSLLHEEISSPPLNGGäHSHQ . PKGi'AusisiDD: GVQTJKTUSLI.EHCHEIEEEAUAVLSFE::EHKFL;:;LLHEEM:;SPPH-------q 270 280
S. melonoenaMybTF 1 (МуЬ1ЖТ727Ж5.1 "236 234 258 üeqcdhstddffadidlmwlld
S. mdcngm Pelikan Myb IF 1 IMybl) МуЫ <М2Бel.. S. melongeröZelenen'kij Myb TF 1 MybVdelG^ieSeM... S. melongena R2R3-MYB TF (MYB2) KF727477.1
QEQCDHHDDFSADIDLKHLLD QG£WD Г-WD D F S V DID L HWL FN
Рис. 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей транскрипционных факторов, кодируемых аллелями
генов МуЬ1 и МуЬ2
добраны геноспецифические праймеры, полностью перекрывающие экзоны гена Myb2 (табл. 1). После выравнивания полученных последовательностей генаMyb2 изучаемых форм S. melongena относительно последовательности ДНК Sme2.5_05099.1 (Solgenomic) [6] полиморфизмов выявлено не было (рис. 5), что говорит об отсутствии влияния данного гена на накопление антоцианов в плодах.
В дальнейшем будут изучаться последовательности интронных областей гена Myb2 и другие гены, участвующие в регуляции биосинтеза антоцианов.
Заключение
Усовершенствован метод молекулярного маркирования, позволяющий одновременно выявлять 2 известных аллеля гена Mybl, связанных с нарушением накопления антоциа-нов в плодах. С использованием широкого селекционного материала: образцов Solanum melongena с различными аллелями гена Mybl, внутривидовых гибридов F F2 и F3 Solanum
melongena изучен характер накопления антоцианов в зависимости от аллельного состава гена Mybl. Установлен промежуточный характер наследования признака «накопление антоцианов в различных частях растений» у гетерозиготных форм с аллелями Myb1-del6 и Myb1-del26 гена Mybl баклажана. Показана высокая эффективность SCAR маркера MybMel del6-26 для выявления форм с нарушенным синтезом антоцианов.
По результатам секвенирования последовательностей экзонных областей гена Myb2 форм баклажана с различной антоциановой окраской плодов показана их полная идентичность, что говорит о его неучастии в регуляции накопления антоцианов в плодах.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований Б20Р-285 «Изучение генетических механизмов регуляции накопления антоцианов и каротиноидов у овощных пасленовых (Solanaceae) и капустных (Brassicaceae) культур».
Рис. 5. Выравнивание последовательностей экзонов гена Myb2 Solanum melongena у сортов с различным накоплением антоцианов: А — область экзона 1, Б — область экзона 2, В — область экзона 3
Список использованных источников
1. Intelmeal [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.intelmeal.ru/nutrition/ foodinfo-eggplant-ru.php. - Дата доступа: 01.03.2022.
2. Мамедов, М. И., Пышная О. Н., Джос Е. А., Шмыкова Н. А., Супрунова Т. П., Митрофанова О. А., Верба В. М. Баклажан (Solanum spp.) / М. И. Мамедов // Изд-во ВНИ-ИССОК. Москва. - 2015. - 264 с.
3. Liu Y., Tikunov Y., Schouten R. E., Marcelis L. F. M., Visser R. G. F., Bovy A. Anthocyanin Biosynthesis and Degradation Mechanisms in Solanaceous Vegetables: A Review / Y. Liu // Frontiers in Chemistry. - 2018. - Vol. 6, n. 52.
4. HELIX [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://helix.ru/kb/item/21-134. - Дата доступа: 01.03.2022.
5. GenBank [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank/. - Дата доступа: 01.08.2021.
6. Solgenomics [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://solgenomics.net/. - Дата доступа: 01.08.2021.
7. Бабак, О. Г. Изучение полиморфизма генов myb-факторов на основе сравнительной геномики овощных пасленовых культур (томат, перец, баклажан) для поиска ДНК-маркеров, дифференцирующих образцы по на-
коплению антоцианов / О. Г. Бабак, Н. А. Не-крашевич, Т. В. Никитинская, К. К. Яцевич, А. В. Кильчевский // Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2019. - Т. 63, №№ 6. -С.721-729.
8. Babak O., Nikitinskaya T., Nekrashevich N., Yatsevich K., Kilchevsky A. Identification of DNA Markers of Anthocyanin Biosynthesis Disorders Based on the Polymorphism of Anthocyanin 1 Tomato Ortholog Genes in Pepper and Eggplant / O. Babak // Crop Breed Genet Genom. - 2020. - Vol. 2, n. 3.
9. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и пе-рераб. - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.
10. Docimo T., Francese G., Ruggiero A., et al. Phenylpropanoids Accumulation in Eggplant Fruit: Characterization of Biosynthetic Genes and Regulation by a MYB Transcription Factor / T. Docimo // Front Plant Sci. - 2016. - Vol. 6, n. 1 233.
11. Zhang Y., Zongli Hu., et al. Anthocyanin Accumulation and Molecular Analysis of Anthocyanin Biosynthesis-Associated Genes in Eggplant (Solanum melongena L.) / Y. Zhang // J. Agric. Food Chem. - 2014. - Vol. 62, n. 13. -P. 2 906-2 912.
E. V. Drozd1, O. G. Babak1, N. A. Nekrashevich1, N. V. Anisimova1, T. V. Nikitinskaya1, K. K. Yatsevich1, I. V. Gashkova2, A. M. Artemyeva2, A. V. Kilchevsky1
STUDY OF ANTHOCYANIAN ACCUMULATION PECULIARITIES IN SOLANUM MELONGENA DEPENDING ON THE POLYMORPHISM OF ACTIVATOR-TYPE R2R3-MYB GENES
1State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: e.drozd@igc.by 2N.I.Vavilov Institute of Plant Genetic Resources (VIR) 42-44 Bolshaya Morskaya St., 190000 St.-Petersburg, Russia
Based on the comparison of anthocyanins' accumulation in various parts of eggplant and Mybl S. melongena polymorphisms using the Chi-squared test, the high efficiency of molecular markers, identifying Myb1-del6 and Myb1-del26 S. melongena alleles associated with impaired anthocyanins' synthesis in fruits, was confirmed. As a result of studying the nature of anthocyanins' accumulation in the fruits of S. melongena, depending on the allelic composition of the Mybl gene in Fj hybrids and F2-F3 populations, an intermediate character of the inheritance of the trait "accumulation of anthocyanins in various parts of plants" was established in heterozygous eggplant forms with Myb1-del6and Myb1-del26alleles of the Mybl gene. Complete identity of the nucleotide composition of exon regions of the Myb2 S. melongena gene was demonstrated in the forms with different anthocyanins' accumulation in fruits. Using the developed markers, a new breeding material for developing of functional nutrition varieties was obtained.
Keywords: Solanum melongena, anthocyanin synthesis regulation, DNA markers, genetic polymorphism.
Дата поступления в редакцию: 04 марта 2022 г.
