CC BY
54
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 211-215
УДК 577.1
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СРАВНЕНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ФОРМ мРНК FAS ЧЕЛОВЕКА
© 2012 г. Д.В. Новиков1, М.Ю. Лебедев2, Н.А. Сахарное1, О.В. Уткин1’4,
Е.А. Балмусоеа 2, А.В. Алясоеа3
1НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии ^Нижегородская государственная медицинская академия
4 Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной
dv_novikov@yahoo. com
Поступила в редакцию 22.03.2012
Разработаны методы обнаружения различных форм мРНК Fas и сравнения их количественного отношения между собой. Метод, основанный на классической ОТ-ПЦР, позволяет анализировать набор альтернативных форм мРНК Fas в различных тканях человека. Метод, основанный на ПЦР в реальном времени, применим для сравнения количественного отношения мРНК Fas к мРНК Fas с делецией шестого экзона в одной реакции.
Ключевые слова: апоптоз, мРНК Fas человека, полимеразная цепная реакция, праймеры, нуклеотидная последовательность.
Введение
Fas (APO-I; CD95) - поверхностный трансмембранный белок I типа, относится к суперсемейству фактора некроза опухоли. Рецептор Fas экспрессируется на поверхности клеток широкого круга тканей и участвует в передаче сигнала внутрь клетки. Интересной особенностью рецептора является его участие в передаче сигнала, приводящего как к дифференцировке клеток, так и к реализации апоптоза. На примере эритроцитов человека было показано, что во время раннего эритропоэза взаимодействие Fas с лигандом приводит к активации каспаз и стимулирует созревание эритроцитов, но не влияет на пролиферацию клеток и не вызывает апопто-за. У созревших эритроцитов взаимодействие рецептора Fas с лигандом приводит к апоптозу [1]. Направленность сигнала опосредуется количеством рецептора Fas, находящегося на поверхности клетки. Для передачи сигнала, приводящего к Fas-зависимому апоптозу, необходимым условием является формирование на мембране клетки липидных плотиков (от англ. rafts), насыщенных рецепторами Fas, и их взаимодействие с плотиками, состоящими из лиганда [2].
Количество рецептора Fas на поверхности клетки прямо пропорционально количеству кодирующей его мРНК [3]. Механизмом, регулирующим синтез мРНК рецептора Fas, является
сплайсинг пре-мРНК [4]. В процессе сплайсинга образуется множество форм мРНК Fas, из которых в наибольшем количестве образуются только две. Первая состоит из 9 экзонов и кодирует мембранную форму белка (мРНК Fas). Вторая образуется за счет альтернативного сплайсинга и состоит из 8 экзонов и отличается от первой делецией 6 экзона с сохранением рамки считывания (FasAexo6). Шестой экзон кодирует трансмембранный регион, удаление которого приводит к синтезу растворимой формы белка секретируемой клеткой в окружающее пространство. Остальные альтернативные формы мРНК Fas образуются за счет единичных или комбинированных делеций разных экзонов, приводящих к сбою рамки считывания. Исключение составляют первый и второй экзоны, которые присутствуют во всех альтернативных формах мРНК Fas [5].
Качественные и количественные изменения количества мРНК Fas и мРНК FasAexo6 и кодируемых ими белков являются отражением функционального состояния клеток иммунной системы. В наивных лимфоцитах преобладает синтез мРНК FasAexo6, а после активации повышается концентрация мРНК, которая кодирует мембранную форму белка [3]. При онкологических заболеваниях наблюдается дисбаланс в образовании альтернативных форм мРНК большого количества апоптотических факторов, включая Fas [6]. Концентрации растворимой формы белка Fas в
сыворотке крови изменяются при онкологических заболеваниях [7], вирусных инфекциях [8] и ожоговой травме [9]. Такие изменения могут быть использованы в клинической практике для мониторинга течения заболеваний и в качестве прогностических факторов. Цель настоящей работы -разработка лабораторных методов детекции и количественного сравнения различных форм мРНК Fas между собой.
Экспериментальная часть
В работе использовали нуклеотидные последовательности гена Fas и мРНК Fas, зарегистрированные в базе данных GenBank под регистрационными номерами NG_009089 и Z47993 соответственно. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием компьютерной программы MEGA3.1 и базы данных сайта NCBI www.ncbi.nih.gov компьютерной сети интернет.
Исследовали образцы периферической крови больной раком молочной железы и десяти больных раком толстого кишечника, полученные в клинике Областного онкологического центра им. Семашко г. Нижнего Новгорода. В том числе был исследован образец опухолевого очага от больной с диагнозом рак молочной железы. Образцы периферической крови пациентов с ожоговой травмой были получены от пострадавших, проходивших лечение во взрослом ожоговом отделении ФГБУ «ННИИТО» Мин-здравсоцразвития России. В качестве контроля использовались образцы периферической крови десяти клинически здоровых добровольцев и образец кожи здорового человека.
Исследуемые образцы помещали в буфер содержащий 4 М гуанидинтиоционата, 0.25 М ацетата Na и 0.5% Triton-X100, и хранили при -20°С до использования. Выделение РНК проводили по методике [10]. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили с использованием M-MuLV обратной транскриптазы (Promega, США), согласно рекомендациям производителя. В качестве затравки использовали олигонуклеотид GR-20 (5’-GGATTTAAGGTTGGAGATTCA-3 ’ [4]). Полу-
ченную кДНК использовали как для детекции вариантов сплайсинга мРНК Fas, так и для оценки их количественного отношения.
Детекцию вариантов сплайсинга мРНК Fas проводили методом классической полимеразной цепной реакции (ПЦР), Реакционная смесь для ПЦР содержала следующие компоненты: 85 мМ ацетата калия, 25 мМ трицина, рН 8.7, 8% глицерина, 1% диметилсульфоксида, 1.5 мМ Mg2+, по 0.4 мМ каждого из дНТФ, по 10 пМ
прямого и обратного праймеров, 5 мкл кДНК и
5 е.а. Taq-полимеразы. Реакционную смесь покрывали минеральным маслом и проводили 35 циклов первой ПЦР при условиях: 94°С - 30 сек, 55 °С - 30 сек, 72°С - 45 сек и 25 циклов второй ПЦР при условиях: 94°С - 30 сек, 60°С - 30 сек, 72°С - 45 сек. В первом раунде ПЦР использовали праймеры 1F (5’-ATCCTGGGCATCTGGACCCT-3 ’[4]) и GR-20. Во втором раунде проводили раздельную детек-тцию мРНК Fas и мРНК FasAex°6 в разных пробирках. Для мРНК Fas использовали комбинацию праймеров 1F и А (5’-TTCCTTTCTCTTCACCCAA-3’). Для мРНК FasAex°6 - 1F и Б (5’-TTCCTTTCTCTTCACTTCC-3’). Результаты анализировали методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромида этидия.
Для оценки количественного отношения мРНК Fas к мРНК FasAex°6 проводили ПЦР в реальном времени. Реакционная смесь содержала (85 мМ ацетата калия, 25 мМ трицина, рН 8.7, 8% глицерина, 1% диметилсульфокси-да), 1.5 мМ Mg2+, 0.4 мМ каждого из дНТФ, 0,5 мкл TaqF-полимеразы (ООО «ИнтерЛабСер-вис», Москва), по 10 пМ прямого FasF (5’-ACCAAATGTGAACATGGAAT-3’) и обратного FasR (5’- CTTTCTGTGCTTTCTGCATG-3’) [11] праймеров, по 5 пМ зондов специфичных к мРНК Fas (5’ -ROX-AGAT CT AACTT GGGGT GG CTTTGTCTTCTT-BHQ2-3’) [11] и мРНК FasДех°6 (5’ -FAM-AGAGGAAGTGAAGAGAA AGGAAGTACAGA-BHQ1-3’). Проводили ПЦР в анализаторе нуклеиновых кислот «АНК-32» (ЗАО «Синтол», Москва) или приборном комплексе SmartCycler II (Cepheid, США), при следующих температурных условиях: 94°С - 5 мин и 50 циклов при 94°С - 30 сек, 55°С - 40 сек, 72°С - 45 сек. За время проведения реакции регистрировали пороговый цикл (Ct). Эффективность реакции (Е) оценивали с использованием
серийных разведений по формуле Е = 10-1/slope.
Отношение количества мРНК Fas к количеству мРНК FasAex°6 (Fas/FasAex°6), рассчитывали по формуле (Eas) CtFas/(EFasAexo6) CtFasAeX°6 [12].
Результаты и их обсуждение
Для детектции альтернативных форм мРНК Fas использовали метод, предложенный нами ранее [13]. При разработке метода проводили сравнение нуклеотидных последовательностей гена и мРНК Fas. Поскольку в клетке преобладает образование двух форм мРНК, были выбраны олигонуклеотидные праймеры, позволяющие раздельно детектировать мРНК Fas и
Рис. 1. Схема расположения праймеров на первичной структуре мРНК Fas и FasAexoó, используемых в классической ПЦР
Рис. 2. Электрофореграмма фрагментов кДНК, полученных методом ОТ-ПЦР при исследовании разных типов тканей человека. Буквой А обозначены треки, полученные с использованием праймера А, буквой Б -праймера Б. 1 - образец периферической крови здорового волонтера; 2 - маркер размерности ДНК фХ174/НаеШ; 3 - образец периферической крови больной раком молочной железы; 4 - образец опухолевого очага рака молочной железы; 5 - образец здоровой кожи человека. Размер фрагментов кДНК, полученных для мРНК Fas, составил 584 п.о. (а); FasExo6Del - 521 п.о. (б); FasExo5Del - 522 п.о. (в); FasExo3,4Del - 337 п.о. (г); FasExo4,6Del - 412 п.о. (д); FasExo3,4,6Del - 274 п.о. (е)
мРНК FasAexo6. На рис. 1 представлена схема расположения праймеров на первичной структуре мРНК Fas и мРНК FasAexo6. Как видно из рисунка, 5’ концевая область обоих олигонуклеотидов комплементарна 7 экзону, а четыре нуклеотидных основания, расположенных на 3’ конце праймера - разным. Для выявления мРНК Fas использовали праймер А, который отжигается на месте соединения 6 и 7 экзонов, а для мРНК FasAexoó - праймер Б, комплементарный месту соединения 5 и 7 экзонов. Расчетные данные показали, что применение праймеров А и Б в паре с опубликованным ранее праймером 1F в ПЦР [5] позволит выявлять дополнительные альтернативные формы мРНК Fas. Праймер А позволяет обнаруживать мРНК Fas и ее альтернативные формы с единичными или комбинированными делециями 3, 4 и 5 экзонов. Праймер Б позволяет детектировать мРНК FasAexo6 и альтернативные формы с делециями
3 и 4 экзонов, комбинированными с делецией 6 экзона.
Образцы периферической крови, опухолевого очага рака молочной железы и здоровой кожи человека тестировали методом классической ОТ-ПЦР на присутствие различных форм мРНК Fas. На рис. 2 представлена электрофореграмма полученных фрагментов кДНК. Делецию экзонов определяли по электрофоретической подвижности в сравнении с маркером размерности ДНК. Как видно из рисунка, во всех исследуемых клетках детектировалась мРНК, кодирующая мембранный белок Fas. Различия выявлены в наборе альтернативных форм мРНК Fas. В клетках периферической крови здорового добровольца детектировались пять альтернативных форм мРНК (FasAexoó, FasAexo5, FasAexo3,4, FasAexo4,6 и FasAexo3,4,6). В образце периферической крови больной раком молочной железы были обнаружены три альтернативные формы (FasAexoó, FasAexo4,6 и FasAexo3,4,6). В опухолевом очаге рака молочной железы присутствовала только одна альтернативная мРНК FasAexo4,6, а в образце кожи здорового челове-
жзон 4 экзон 5 экзон 6 экзон 7
___31 мРНК Fas
экзон 4
экзон 5
ROX BHQ2
экзон? —?1 мРНК FasAexoó
FAM BHQ1
Рис. 3. Схема расположения праймеров и зондов на первичной структуре мРНК Fas и FasAexo6, используемых для проведения ПЦР в реальном времени
ка обнаружены мРНК FasAexo6, FasAexo5, FasAexo3,4 и FasAexo4,6. Представленные данные иллюстрируют различия в образовании альтернативных форм мРНК Fas как в периферической крови, так и в других типах клеток человека.
Для количественного сравнения форм мРНК Fas, содержащих и не содержащих шестой эк-зон, использовали методический подход, основанный на различиях нуклеотидных последовательностей в местах соединения экзонов [11]. В основу метода была взята разновидность ПЦР в реальном времени Taq-Man. Метод основан на использовании в ПЦР олигонуклеотидных зондов, содержащих флуоресцентную метку и ее гаситель. В процессе синтеза ДНК полимераза разрушает зонд, что приводит к освобождению метки от гасителя и появлению флуоресценции. Количество освободившейся метки прямо пропорционально количеству синтезируемой ДНК, что позволяет рассчитать исходное соотношение исследуемых молекул [14]. На основе проведенного анализа нуклеотидных последовательностей мРНК Fas были подобраны олиго-нуклеотидные праймеры и зонды для проведения реакции.
На рис. 3 представлена схема расположения олигонуклеотидов на первичной структуре мРНК Fas. Праймеры ограничивали участок кДНК между 4 и 8 экзонами. Зонд, специфичный к мРНК Fas, отжигался на нуклеотидной последовательности, соответствовавшей шестому экзону, зонд, специфичный к мРНК FasAexo6 - на место соединения пятого и седьмого экзонов. Праймеры позволяли амплифи-цировать как мРНК, содержащую шестой экзон, так и мРНК с делецией шестого экзона. В состав зондов были включены разные флуоресцентные красители, что позволяло проводить реакцию в одной пробирке. Следует отметить, что такой подход позволяет избегать ряда недостатков, свойственных методу количественной ПЦР в реальном времени [15]. Во-первых, нет необходимости в использовании генов домашнего хозяйства, применяемых для нормализации
данных - устранения различий в изначальном количестве исследуемых клеток и погрешности, вносимой при манипуляциях. Реакция проводится в одной пробирке, в эквимолярных соотношениях. Во-вторых, нивелируется погрешность, вносимая за счет генетической неоднородности человеческой популяции. В промоторе гена Fas обнаружены два однонуклеотидных полиморфизма, которые широко распространены среди людей. Известно, что генетические различия оказывают влияние на активность гена Fas и, соответственно, на количество синтезируемой пре-мРНК [16]. В предложенном нами подходе оценивается отношение форм мРНК Fas и мРНК FasAexo6 друг к другу, а не активность гена Fas относительно гена референта.
Разработанный метод испытывали на образцах периферической крови человека. Исследовали образцы десяти добровольцев, у которых не было жалоб на здоровье, десяти больных раком толстого кишечника и 13 пациентов, получивших ожоговую травму. Результаты реакции оценивали как отношение количества мРНК Fas к количеству мРНК FasAexoó (Fas/FasAexo6) по формуле, представленной в разделе «Экспериментальная часть». Установлено, что в периферической крови добровольцев отношение Fas/FasAexoó было близко к единице или смещалось в сторону увеличения концентрации мРНК Fas в 1.1-1.9 раза. У больных колоректальным раком отношение мРНК Fas/FasAexo6 варьировало от 1.9 до 3. При ожоговой травме в лейкоцитах периферической крови пострадавших отношение мРНК Fas/FasAexo6 составляло от 1.1 до 2.0. Такие различия в отношении мРНК Fas/FasAexo6 характеризуют состояние клеток иммунной системы. Повышение количества мРНК Fas относительно мРНК FasAexo6 свидетельствует о готовности лимфоцитов периферической крови к апоптозу, опосредованному активацией [3], т.е. этот показатель отражает степень активации лимфоцитов периферической крови.
Таким образом, методом ОТ-ПЦР обнаружены различные формы мРНК Fas и проведено сравнение их количественного содержания между собой. Метод, основанный на классической ОТ-ПЦР, позволяет анализировать набор альтернативных форм мРНК Fas в различных тканях человека. Метод, основанный на ПЦР в реальном времени, применим для сравнения количественного отношения мРНК Fas к мРНК FasAexo6 в одной реакции. Оценка отношения количества мРНК Fas к количеству мРНК FasAexo6 (Fas/FasAexo6) может быть использована для исследования степени активации лимфоцитов периферической крови при различных заболеваниях.
Список литературы
1. Carlile G.W., Smith D.H., Wiedmann M. A non-apoptotic role for Fas/FasL in erythropoiesis // FEBS Letters. 2009. V. 583. P. 848-854.
2. O’ Reilly L.A., Tai L., Lee L. et al. Membrane-bound Fas ligand only is essential for Fas-induced apop-tosis // Nature. 2009. V. 461. P. 659-663.
3. Liu C., Cheng J., Mounts J.D. Differential expression of human Fas mRNA species upon peripheral blood mononuclear cell activation // Biochem. J. 1995. V. 310. P. 957- 963.
4. Kotlajich M.V., Hertel K.J. Death by Splicing: Tumor Suppressor RBM5 Freezes Splice-Site Pairing // Molecular Cell. 2008. V. 32. P. 162-164.
5. Cascino I., Fiucci G., Papoff G., Ruberti G. Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing // J. Immunol. 1995. V. 154. P. 2706-2713.
6. Bracco L., Kearsey J. The relevance of alternative RNA splicing to pharmacogenomics // Trends Biotech-nol. 2003. V. 21. P. 346-353.
7. Голенков А.К., Митина Т.А., Новиков В.В. и др. Клиническое значение растворимых молекул адгезии (sCD50-ICAM-3), апоптоза (sCD95) и sHLA класса I при лимфопролиферативных заболеваниях //
Российский биотерапевтический журнал. 2002. Т. 1. № 1. С. 60-64.
8. Кравченко Г.А., Новиков Д.В., Птицина Ю.С., Новиков В.В. Сывороточный уровень растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы у носителей маркеров вирусного гепатита G // Вопросы вирусологии. 2005. № 6. C. 19-22.
9. Lebedev M.J., Ptitsina J.S., Vilkov S.A. et al. Membrane and soluble forms of Fas (CD95) in peripheral blood lymphocytes and in serum from burn patients // Burns. 2001. V. 27. Р. 669-673.
10. Chomszynskii P., Sacchi N. Single - step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyonate -phenol-chloroform extraction // Analytical biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.
11. Новиков Д.В., Лебедев М.Ю., Уткин О.В. и др. Метод сравнительной оценки экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas антигена с использованием ПЦР в реальном времени // Матер. III Московского междунар. конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», Москва, 2005 г. С. 195-195.
12. Cikos S., Bukovska A., Koppel J. Relative quantification of mRNA: comparison of methods currently used for real-time PCR data analysis // BMC Molecular Biology. 2007. V. 113. № 8. P. 1-14.
13. Новиков Д.В., Новиков В.В. Новый метод детекции мРНК мембранной и доминирующей растворимой формы Fas протеина // Матер. II Московского междунар. конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», Москва, 2003 г. С. 71-72.
14. VanGuilder H.D., Vrana K.E., Freeman W.M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis // BioTechniques. 2008. V. 44. P. 619-626.
15. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A. et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments // Clinical Chemistry. 2009. V. 55. P. 611-622.
16. Farre L., Bittencourt A.L., Silva-Santos G. et al. Fas-670 promoter polymorphism is associated to susceptibility, clinical presentation, and survival in adult T cell leukemia // J. Leukocyte Biology. 2008. V. 83. P. 220222.
POLYMERASE CHAIN REACTION FOR DETECTION AND QUANTITATIVE COMPARISON OF SPLICING VARIANTS OF HUMAN FAS MRNA
D.V. Novikov, M. Yu. Lebedev, N.A. Sakharnov, O.V. Utkin, E.A. Balmusova, A V. Alyasova
A technique for detection and quantitative comparison of splicing variants of human Fas mRNA has been developed. The detection of splicing variants is based on the classical RT-PCR method. Quantitative comparison between mRNA Fas and mRNA FasAexo6 was performed using real-time PCR in one tube.
Keywords: apoptosis, human Fas mRNA, polymerase chain reaction (PCR), primer, nucleotide sequence.
