CC BY
12
© 1Манжалм Е. Г., Кондратюк В. 6., 2Фалалеева Т. М., 2Вiрченко О. В., 2Голишюн Д. В. УДК 616.36-004+615.917+612.821.5
1Манжалiй Е. Г., 1Кондратюк В. €., 2Фалалеева Т. М., 2В'рченко О. В., 2Голишюн Д. В. ПОКРАЩЕННЯ МОДЕЛЮВАННЯ ТА Д1АГНОСТИКИ
ПЕЧ1НКОВО1 ЕНЦЕФАЛОПАТП У ЩУР1В
1Нацiональний медичний ушверситет iм. О. О. Богомольця МОЗ УкраГни (м. КиГв) 2КиГвський нацiональний унiверситет iменi Тараса Шевченка МОН УкраГни (м. КиГв)
elinam@ukr.net
Робота виконана в рамках науково-дослщно! теми № 11БФ036-01 «Мехаызми реал!заци адаптацмно-компенсаторних реакцм орган1зму за умов розвитку р1зних патолог1й» (2011-2015 рр., № державно! ре-естрацИ 0111Ш04648) ННЦ «1нститут б1ологИ» Ки!в-ського нацюнального ун1верситету 1мен1 Тараса Шевченка.
Вступ. Захворювання печ1нки е серйозною ме-дико-соц1альною проблемою, осктьки 60% хворих, що страждають вщ ц1е! патологИ, складають особи працездатного в1ку [1]. Серед патолог1й печ1нки од-н1ею з актуальних I складних проблем е д1агностика ускладнень у хворих на цироз печ1нки (ЦП), особливо печЫково! енцефалопатИ (ПЕ) [6]. Р1зкому збтьшен-ню к1лькост1 хворих на ЦП сприяло зростання р1вня захворюваност1 в1русними I токсичними (алкоголь-ними) ураженнями печ1нки. Алкогольний цироз роз-виваеться приблизно в 15-20% ос1б, як1 зловживають алкогольними напоями впродовж 5-20 роюв, частше в чолов1к1в [7]. До 40% хворих на ЦП протягом трива-лого часу не висловлюють н1яких скарг, у них збер1га-еться безсимптомний переб1г захворювання. Проте, як ттьки розвиваються ускладнення захворювання: ПЕ, асцит, кровотеч1 з варикозно розширених вен (ВРВ) стравоходу та шлунка, прогресивне пог1ршен-ня стану стае неминучим [2,4]. Серед ускладнень ЦП найб1льш загрозливими для життя е не т1льки крово-теч1 з верхн1х в1дд1л1в шлунково-кишкового тракту, а й енцефалопат1я - дистроф1чна зм1на тканини головного мозку, що призводить до порушення функцИ цього органу [8]. Важкють основних кл1н1чних прояв1в ЦП, як правило, визначае прогноз I тактику л1кування.
У хворих на ЦП ПЕ зустр1чаеться у 50-80% хворих, з яких виражен кл1н1чн1 ознаки невролопчних I псих1ч-них порушень зустр1чаються т1льки у 40-46%, а ¡нша частина мае латентну (кгмычно приховану) форму патологИ [5,9]. ПЕ е найбтьш частим та виснажливим ускладненням захворювання печ1нки незалежно вщ його ет1ологИ, що серйозно впливае на життя пац1-ент1в та !х оп1кун1в. Прогрес в д1агностиц1 та л1куванн1 захворювання обмежуеться складн1стю патогенезу захворювання, механ1зми якого ще не повн1стю роз-крит1 [3].
Велика поширен1сть ЦП, прогред1ентний переб1г захворювання, недостатня ефективн1сть сучасних метод1в д1агностики, розвиток важких ¡нвалщизуючих ускладнень визначае високу медичну I соц1ально-еко-
ном1чну значущ1сть вивчення ЦП. Досягнуто пом1тних усп1х1в у д1агностиц1 та л1куванн1 ЦП, однак ще бага-то питань залишаеться без вщповщ. Це потребуе подальшого дослщження механ1зм1в патогенезу ПЕ у хворих на ЦП р1зно! ет1ологИ I пошуку нових метод1в д1агностики, диференц1ально! д1агностики. У сучасн1й науков1й л1тератур1 наведен! експериментальн1 досл1-дження та накопичений фактичний матер1ал щодо моделей ПЕ при захворюваннях печ1нки. Але точний прототип моделювання ПЕ вщсутнм в зв'язку, зокре-ма, 1з значною смертн1стю тварин в результат! ускладнень ЦП. Нин! дослщники використовують модель ПЕ, де в якост! х!м!чно! сполуки використовують чотири-хлористий вуглець (СС14) в поеднанн з вазелЫовою ол!ею у стввщношены 1:1, що вводиться одноразово щотижня протягом 4-6 тижыв. ПЕ д!агностуеться за наявнютю вираженого дистроф!чного процесу ге-патоцит!в, в судиннм систем! ! жовчних протоках пор-тальних траклв. ЗмЫи функцюнування мозку були вивчен на модел! формування умовного харчового рефлексу: було виявлено збтьшення часу проб!жки щурами до харчового пщкртлення на вщстань 30 см до 100-150 с по прямм л1нп (патент Я11 2363990). Але за дано! модел! вивчення ПЕ не зрозумто, чи доб1-гання щур!в до !ж! пов'язане з порушенням мислення, чи ¡з загальною загальмованютю мозкових процеЫв та зниженою руховою активнютю. Тому актуальним е розробка модел! д!агностики ПЕ, в яюй врахову-ються змЫи показниюв основних когытивних функцм у щур!в: мислення, навчання та пам'ятк Бтьш того, застосування дано! модел! в наших експериментах призводило до значного р!вня летальност! серед ла-бораторних тварин, що ускладнювало планування дослщжень. В зв'язку з цим ми звернули увагу на модель внутршньочеревинного (в/о) введення 0,75 мл/ кг 15%-розчину СС14 за ЫИиа та ствавт. (2015) [10]. В данм робот! введення тетрахлорметану для викли-кання ЦП здмснювали впродовж 8 тижыв, що сутте-во збтьшуе тривалють експерименту. Тому лопчним було незначне збтьшення дози та частоти введення, щоб моделювати патолопю за коротший час з м1н1-мальною летальнютю тварин в ход! експерименту.
Отже, з огляду на вищезазначене, метою роботи було уточнення моделювання ПЕ у щур!в з гепатитами та ЦП та оцЫка розвитку ц!е! патолог!! на основ! вивчення харчового умовного рефлексу в Т-под1бному
лабiринтi з урахуванням оцЫки мислення, навчання та пам'ятк
Об'ект i методи дослiджень. Дослщження про-веденi на 14 щурах-самцях згiдно нормативiв бвро-пейсько! конвенцп про захист хребетних тварин, як використовуються для експериментальних та шших наукових цiлей, загальних етичних принцитв екс-периментiв на тваринах, ухвалених Першим нац^ ональним конгресом УкраТни з бiоетики (вересень 2001 року), Ыших мiжнародних угод та нацюналь-ного законодавства у цiй галузк Тварин утримували в умовах акредитованого вiварiю згiдно зi «Стан-дартними правилами по упорядкуванню, устатку-ванню та утриманню експериментальних бюлопч-них кгмнк (вiварiIв)».
Тварини були роздтеы на 2 групи по 7 щурiв в кожнiй: I - Ытакты тварини, II - дослщнк Для моде-лювання експериментально! ПЕ, II груп тварин вводили в/о 1 мл/кг 15% розчину CCl4 в оливковм ол^ чотири рази на тиждень впродовж 4 тижыв [10]. Всi тварини мали втьний доступ до води та ixi. Пiсля закiнчення введення CCl4 дослiджували порушення роботи мозку (розвиток печЫково! енцефалопатiI) на моделi вироблення харчового умовного рефлексу, мислення, навчання та пам'ятк
Харчовий умовний рефлекс дооглджували в Т-по-дiбному лабiринтi у тварин, схема якого зображена на рисунку 1.
У тварин оцЫювали швидкють утворення харчового умовного рефлексу, який визначали за часом вщ входження в Т-подiбний лабiринт до знаходження в лiвому рукавi лабiринту та початку годiвлi. Для отри-мання вщтворюваного результату здiйснювали наступи манiпуляцi,i. За тиждень до вироблення харчового умовного рефлексу до стандартного корму щурiв додавали сир, щоб виробити звикання до цього типу ш у тварин. Пщ час дослiдження щурiв в лабiринтi тварин тримали на легкому голодi (тваринам давали корм з розрахунку 15 г комбiкорму на щура масою 250 г при нормi 20-30 г). Пiд час експерименту щура саджали у центральну частину лабiринту, оточену стiнками, та розпочинали вщлк часу. Через певний час щур знаходив вихщ з центрально! частини у п-подiбний
коридор, що мав два рукави (поворот налiво i направо). В юнц лiвого рукава знаходилася 1жа (декiлька кубiчних шматочкiв сиру загальною масою 30 г). Рее-стрували час в секундах, коли тварина знаходила сир (пщбтала до нього) та час, коли починала юти (час до харчового пщкртлення). Другий часовий показник був обраний для порiвняння. Пюля знаходження ш тварин дозволяли 1сти впродовж 30 с для зменшення негативного пiдкрiплення, пов'язаного з вилученням щура з лабiринту пюля початку годаж, що частко-во зменшувало стрес та негативы асоцацм у тварин з годiвлею в лабiринтi. Оцiнювали запам'ятовування щурiв, в якому рукавi знаходиться 1жа, за значенням помилкових поворотiв у правий рукав. Спостерта-ли за виробленням харчового рефлексу впродовж 14 дыв. ОцЫювали динамiку змiни часу вщ входження тварин обох груп в лабiринт до початку годаж, а також порiвнювали час до харчового пщкртлення у щурiв двох груп на 14 добу експерименту.
Результати дослщження та 'Гх обговорення. На початку експерименту тварини Ытактно! групи знайшли 1жу та почали 1сти через 157 ± 47 с пюля входження в центральну частину лабiринту (рис. 2). В перший тиждень вщ початку дослщу у Ытактних щурiв не було зареестровано скорочення часу до харчового пщкртлення. На 5 i 6 добу час до початку го-дiвлi навiть зростав в 1,7 (р<0,05) та 1,8 рази (р<0,05) порiвняно з першою добою. Хоча час знаходження íжi скорочувався: тварини пщб^али до íжi, по™ пе-ребiгали в правий рукав, i лише через 60-180 с починали юти. Позитивну динам^ скорочення часу до харчового пщкртлення почали вiдмiчати, починаючи iз 7 доби вщ початку експерименту. Вже на 9 добу зменшення часу харчового пщкртлення складало 58% (р<0,05) порiвняно з 6 добою вщ початку вироблення харчового умовного рефлексу. На 11 добу спостертали стмке вироблення харчового умовного рефлексу: час знаходження 'ш та годiвлi скорочувався повiльнiше. З 11 до 14 доби час до харчового пщ-кртлення зменшувався з 31 ± 5 с до 12,6 ± 2 с, або на 60% (р<0,05). Порiвняно з початком експерименту час знаходження 'ш та харчове пщкртлення змен-шувалося на 80% (р<0,05) на 11 добу експерименту
Рис. 1. Фото та схема Т-под;бного лабфинту.
450
400
350
Е 300
О 1_
О ш о
з-о. ш >; о
и
250
200
150
100
50
—т— 1нтактш щури
• ПечЫкова енцефалопа"пя
41---«...
—*
8
10 11
12 13
14
Рис. 2. Час харчового пщкртлення в динам^ при виробленш харчового умовного рефлексу за умов моделювання цирозу печшки, викликаного введенням СС14 (п=7, М±т). *р<0,05, **р<0,05, ***р<0,05 - порiвняно з показниками штактних тварин вщповщноТ доби експерименту.
та 92% (р<0,05) на 14 добу експерименту. В наступи дн1 скорочення часу знаходження ж не реестрували. Отже, за нашими даними вироблення умовного рефлексу на знаходження Тж1 становило 14 д1б.
Введення СС14, що супроводжуеться токсичним ефектом на функц1онування печ1нки, призводило до суттевого пог1ршення мислення, навчання та пам'ят1 у щур1в. Послаблення когн1тивних процес1в було за-реестровано вже на першу добу пюля початку експерименту. Час до харчового п1дкр1плення становив 334 ± 50 с, що було в 2,1 рази (р<0,05) бшьше за в1д-пов1дний показник Ытактних щур1в (рис. 2). Впро-довж вс1х 14 д1б не виявлено позитивно! динамки скорочення часу в1д входження в лаб1ринт до харчо-
зоо
к
X X
ш с; с 'а. х Ч
О ш О 9 О. Л X
о сС
250
200
150
100
50
1 2
Рис. 3. Час харчового пщкртлення при виробленш харчового умовного рефлексу на 14 добу
за умов моделювання цирозу печшки, викликаного введенням СС14 (п=7, М±т).
1 - штактш щури, 2 - щури з печшковою енцефалопатieю. *р<0,05 - порiвняно з показниками штактних тварин.
вого гмдкртлення. Варто в1дм1-тити, що процесу вивчення, де знаходиться Тжа, у щур1в з СС14-¡ндукованим цирозом не в1дбу-валося. На 14 добу у цм гругм не було значущого зменшення часу харчового гмдкртлення пор1вня-но з першим днем.
Бшьш того, якщо в один день щур швидко знаходив Тжу, в на-ступний день цього могло не спостер1гатися, що свщчить про вщсутнють запам'ятовування, в якому рукав1 лаб1ринту мю-титься Тжа. Якщо ¡нтактнп щури пюля 7 доби повертали пюля виходу з центрально! частини лаб1ринту нал1во в напрямку Тж1, то щури, яким вводили СС14, часто помилялися, повертаючи в лаб1рин~п не в л1вий, а в правий рукав.
З рисунку 2 видно, що у тварин, яким вводили СС14, на 9, 10, 11, 12, 13 добу час до харчового п1дкр1плення перевищував в1дпов1дн1 по-казники Ытактних щур1в в 2,0 (р<0,05), 5,7 (р<0,01), 7,9 (р<0,01), 6,6 (р<0,01) та 11,4 раза (р<0,001). На 14 добу пюля початку вироблення харчового умовного рефлексу час до знаходження Тж1 I початку год1вл1 у щур1в з СС14чндукованим цирозом перевищував по-казники контролю в 21,4 рази (р<0,001) (рис. 3).
Отже, отриман1 дан1 св1дчать про розвиток печ1н-ково! енцефалопати у грут щур1в з СС14-1ндукованим ЦП. Дана схема моделювання ЦП та ПЕ е покраще-ною, оскшьки результати можна рееструвати вже через мюяць пюля початку введення чотирьоххло-ристого вуглецю, I при цьому досягаеться незначна смертнють (<10%). Покращення д1агностики ПЕ було досягнуто застосуванням методики формування харчового умовного рефлексу у щур1в. 1Т результати св1д-чать про значне збшьшення часу проб1жки до харчового тдкр1плення, вщсутнютю запам'ятовування та мислення у щур1в з патолопею печЫки. Описаний метод може бути рекомендований, як основний для моделювання ПЕ.
Висновки
1. Моделювання печЫковоТ енцефалопати у щур1в здмснювали шляхом внутр1шньочеревинного введення 1 мл/кг 15% розчину СС14 в оливковм олп чоти-ри рази на тиждень впродовж4 тижыв.
2. Зниження коп-мтивноТ функци у тварин, яким вводили СС14, було д1агностовано за порушенням формування харчового умовного рефлексу тварина-ми в Т-под1бному лаб1ринт1.
Перспективи подальших дослщжень. Розро-блена модель е пщфунтям для тестування нових препарат для покращення коп-мтивноТ функци в умовах розвитку печ1нковоТ енцефалопати на тл1 патологи печ1нки. Одним з перспективних напрям1в е досл1-дження ефективност1 гшатилЫу (хол1н альфосцерату) в пор1внянн1 з1 стандартним л1куванням цирозу 1з застосуванням лактулози, ларнам1ну та рифаксимЫу.
^iTepaTypa
1. Grover V. P. The why and wherefore of hepatic encephalopathy / V. P. Grover, J. M. Tognarelli, N. Massie [et al.] // International journal
of general medicine. - 2015. - Vol. 8. - P. 381-390.
2. Huang Y-W. Pathogenesis and management of alcoholic liver cirrhosis: a review / Y-W. Huang, S.-S. Yang, J.-H. Kao // Hepatic medi-
cine : evidence and research. - 2011. - Vol. 3. - P. 1-11.
3. Liu A. Advances in cirrhosis: optimizing the management of hepatic encephalopathy / A. Liu, R. B. Perumpail, R. Kumari [et al.] //
World journal of hepatology. - 2015. - Vol. 7, № 29. - P. 2871-2879.
4. Mendizabal M. Liver transplantation in acute liver failure: a challenging scenario / M. Mendizabal, M. O. Silva // World journal of
gastroenterology. - 2016. - Vol. 22, № 4. - P. 1523-1531.
5. Nand N. Clinical profile of alcoholic liver disease in a tertiary care centre and its correlation with type, amount and duration of alcohol
consumption / N. Nand, P. Malhotra, D. K. Dhoot // The Journal of the Association of Physicians of India. - 2015. - Vol. 63, № 6. -P. 14-20.
6. Rahimi R. S. Hepatic encephalopathy: how to test and treat / R. S. Rahimi, D. C. Rockey // Current opinion in gastroenterology. -
2014. - Vol. 30, № 3. - P. 265-271.
7. Wang J.-Y Prevalence of minimal hepatic encephalopathy and quality of life evaluations in hospitalized cirrhotic patients in china /
J.-Y Wang, N.-P. Zhang, B.-R. Chi [et al.] // World journal of gastroenterology. - 2013. - Vol. 19, № 30. - P. 4984-4991.
8. Yang L. Effect of allogeneic umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in a rat model of hepatic cirrhosis / L. Yang, Y Wang,
X. Wang, Y Liu // Journal of traditional Chinese medicine. - 2015. - Vol. 35, № 1. - P. 63-68.
УДК 616.36-004+615.917+612.821.5
ПОКРАЩЕННЯ МОДЕЛЮВАННЯ ТА Д1АГНОСТИКИ ПЕЧ1НКОВОТ ЕНЦЕФАЛОПАТП У ЩУР1В
Манжалш Е. Г., Кондратюк В. €., Фалалеева Т. М., Bip4eHKO О. В., Голишкш Д. В.
Резюме. Було уточнено моделювання печшково'|' енцефалопати (ПЕ) у щурiв з гепатитами та цирозом печшки та оцЫений розвиток ^e'i патологи на основi вивчення харчового умовного рефлексу в Т-подiбному лабiринтi. З огляду на дан лтератури та шляхом пщбору доз було запропоновано для оптимального моделювання ПЕ тваринам вводити внутршньочеревинно 1 мл/кг 15% розчину CCl4 в оливковм оли чотири рази на тиждень впродовж 4 тижыв. Розвиток ПЕ, а саме порушення здатност тварин до запам'ятовування, навчання та мислення, вивчали за виробленням умовного харчового рефлексу в Т-подiбному лабiрин-тк ОцЫювали динам^ зменшення часу доб^ання тварин до харчового пщкртлення в лабiринтi внаслщок запам'ятовування мюця знаходження |'жк Результати свщчать про значне збшьшення часу пробiжки до харчового пщкртлення, вщсутнютю запам'ятовування та мислення у щурiв з патолопею печЫки. Описаний метод може бути рекомендований, як основний для моделювання ПЕ.
^^40Bi слова: CCl4, цироз печЫки, печЫкова енцефалопа™, харчовий умовний рефлекс.
УДК 616.36-004 + 615.917 + 612.821.5
УЛУЧШЕНИЕ МОДЕЛИРОВАНИЯ И ДИАГНОСТИКИ ПЕЧЕНОЧНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ У КРЫС
Манжалий Э. Г., Кондратюк В. Е., Фалалеева Т. М., Вирченко А. В., Голышкин Д. В.
Резюме. Было уточнено моделирование печеночной энцефалопатии (ПЭ) у крыс с гепатитами и циррозом печени и оценено развитие этой патологии на основе изучения пищевого условного рефлекса в Т-образном лабиринте. Учитывая данные литературы и путем подбора доз было предложено для оптимального моделирования ПЭ животным вводить внутрибрюшинно 1 мл/кг 15% раствора CCl4 в оливковом масле четыре раза в неделю в течение 4 недель. Развитие ПЭ, а именно нарушение способности животных к запоминанию, обучению и мышлению, изучали по выработке условного пищевого рефлекса в Т-образном лабиринте. Оценивали динамику уменьшения времени добегания животных к пищевому подкреплению в лабиринте вследствие запоминания места нахождения пищи. Результаты свидетельствуют о значительном увеличении времени пробежки до пищевого подкрепления, отсутствии запоминания и мышления у крыс с патологией печени. Описанный метод может быть рекомендован как основной для моделирования ПЭ.
Ключевые слова: CCl4, цирроз печени, печеночная энцефалопатия, пищевой условный рефлекс.
UDC 616.36-004 + 615,917 + 612.821.5
IMPROVEMENT OF THE MODELING AND DIAGNOSIS OF HEPATIC ENCEPHALOPATHY IN RATS
Manzhalii E. G., Kondratiuk V. E., Falalyeyeva T. M., Virchenko O. V., Golyshkin D. V.
Abstract. One of the challenging problem in gastroenterology is the treatment of liver cirrhosis (LC) and hepatic encephalopathy (HE) as one of its dangerous complications. HE is the frequent disorder that hits approximately 5080% of cirrhotic patients. This pathology is associated with progressive dystrophy of brain tissue and can lead to patients' disability. Therefore, the study of the mechanisms of etiology and pathogenesis and possible strategies of treatment of HE is current issue of scientists all over the world.
Today CCl4 is used for modeling of LC and HE in rats. However, this method has some limitations namely high mortality of lab animals or high duration of LC formation. Also diagnosis of HE was made on the study of the food conditioned reflex that allowed to evaluate only locomotor activity of animals but not their ability to think and remember. That is why the aim of the study was the optimization of HE modeling and diagnose.
The modeling of HE in rats with hepatitis and liver cirrhosis was improved. Considering the literature data and selecting doses, intraperitoneally administration of 1 ml/kg 15% solution of CCl4 in olive oil four times a week for
4 weeks has been suggested for optimal simulation of HE in rats. The development of HE, namely the ability of animals to memorization, learning and thinking was studied by the formation of a food conditioned reflex in the T-shaped maze. 14 rats were divided into two groups: 1 - intact rats and 2 - rats pretreated with CCl4. The dynamic of reducing the time of getting animals to the food reinforcement in the maze as a result of remembering the location of food was estimated during 14 days.
In the first day of food conditioned reflex study it was established that intact rats reached the food in 157 ± 47 sec. Contrary, the time of getting to food of CCl4-rats was 2,1 times (p<0.05) longer that suggests the less activity and lethargy of these animals. In the next 7 days, there were not any changes in the time of getting to food in T-shape maze in the intact group as well as in the group pretreated with CCl4. Since the 7th day we have shown a steady acceleration of finding the food by intact rats. However, there were not registered data about faster food reinforcement in the group of animals that got CCl4 injection. Moreover, in the group of intact rats we have established the decrease in time of finding the food by 92% (p<0.05) as compared with the first day of experiment. Such changes were not obvious for the CCl4-group: we did not find the significant difference between the reaching food of CCl4-rats at the start and at the 14th day of experiment in the T-shaped maze. Thus, we registered that the time of finding the food in the CCl4 group was 21.4 (p<0.001) greater than in the intact group at the 14th day of study in the T-shaped maze. The impairment of food conditioned reflex formation has showed lack of remembering and thinking in rats pretreated with CCl4. This confirms the progression of liver pathology and concomitant dystrophy of brain tissue with the development of HE.
In conclusion, we have updated the scheme of modeling LC and HE by the decrease of time of the LC development and the reduction of animal mortality as result of toxic action by CCl4. The improved diagnosis of HE was achieved by using the methodology of forming a food conditioned reflex in rats. This method can be recommended as a basic for HE modeling and can be used for study new treatment strategies of this disease.
Keywords: CCl4, liver cirrhosis, hepatic encephalopathy, food conditioned reflex.
Рецензент - проф. Костенко В. О.
Стаття надшшла 01.02.2016 року
