CC BY
109
УДК 579.26
Г.А. Козлова
Пермский национальный исследовательский политехнический университет
Е.В. Пименова
Пермская государственная сельскохозяйственная академия
ПОИСК ШТАММОВ - ДЕСТРУКТОРОВ ГЕРБИЦИДОВ НА ОСНОВЕ ГЛИФОСАТА
Описан штамм, способный к росту на синтетической минеральной среде с раундапом в качестве единственного источника углерода. Изучены его культурально-морфологические, биохимические и деструктивные свойства. Ингибирующее действие препарата на рост микроорганизмов начинает проявляться при концентрации 0,2 об. % по действующему веществу.
Фосфорорганические соединения (ФОС) относятся к числу опасных загрязнителей окружающей среды, являются основой многих ксенобиотиков и широко используются в разных отраслях хозяйственной деятельности человека. Они входят в состав гербицидов, инсектицидов (хлорофос, афос), антибиотиков, пламегасителей, ингибиторов коррозии, отравляющих веществ (VX, зарин и зоман), используются как хе-латирующие добавки к детергентам.
Важным представителем ФОС является глифосат - К-(фосфоно-метил)-глицин, С3Н8К05Р:
который составляет основу многих гербицидов.
Одной из наиболее распространенных препаративных форм гли-фосата является раундап, который содержит 480 г/л водного раствора изопропиламиновой соли К-(фосфонометил) глицина, что эквивалентно
360 г/л глифосата. Таким образом, содержание действующего вещества (д.в.) по кислоте составляет 36 %. Данный препарат является наиболее популярным в мире гербицидом. Он широко используется в сельском хозяйстве с целью уничтожения многолетних глубоко укореняющихся и корневищных сорняков, а также древесно-кустарниковой растительности в лесном хозяйстве и на землях несельскохозяйственного пользования [1].
Глифосат отличается высокой токсичностью и устойчивостью к разложению [2].
Анализ тенденций развития исследований в области защиты окружающей среды показывает, что наряду с совершенствованием существующих физических и химических методов большое внимание уделяется биотехнологическим методам. Такие методы экологически безопасны и выгодно отличаются от других отсутствием вторичных отходов, т.е. возможностью полной минерализации химических соединений, выбрасываемых в окружающую среду в качестве промышленных отходов. Кроме того, немаловажно, что биодеструкция является естественным процессом, что делает этот способ приемлемым для общественного сознания [3].
Относительно глифосата большое количество публикаций направлено на выделение глифосатдеградирующих микроорганизмов и проведение экспериментов, направленных на выявление путей их метаболизма.
Из почвы выделены микроорганизмы различных таксономических групп - Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium и др. [4-6], способных разлагать глифосат при культивировании их на искусственных питательных средах.
Многие изоляты бактерий утилизируют глифосат как источник фосфора [6, 7]. В работе [8] приведено сравнение роста бактерий Pseudomonas fluorescens и Acetobacter sp. на различных средах с гли-фосатом (препарат Roundup®) в качестве источника углерода или фосфора (источник углерода - глюкоза), а также углерода и фосфора одновременно. Показано, что в последнем случае наблюдается наибольшая эффективность роста. Для микроорганизмов семейства Rhizobiaceae глифосат лучше используется как источник фосфора, чем источник углерода [7].
Целью данной работы является исследование микроорганизмов, способных за счет глифосата поддерживать рост и (или) использовать его в качестве единственного источника углерода.
Материалы и методы исследования. В качестве объекта исследований выбран штамм Я16, выделенный из образца почвы, взятого с территории опытного поля учхоза Липовая Гора Пермской сельхозакадемии, обрабатываемого пестицидами на основе глифосата.
Исследуемый штамм представлен грамотрицательными, бесспоро-выми, подвижными палочками. Способен к росту на синтетической минеральной среде с раундапом в качестве единственного источника углерода. Для сравнения использовали штамм Acinetobacter calcoaceticus АК 540 из коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН.
Исследование культуральных, макроморфологических и биохимических свойств микроорганизмов проводили по традиционным методикам [9, 10].
При определении источника углерода культуру высевали на среду Цукамуры [11], которая содержала минеральные вещества и вещество - источник углерода; раствор последнего стерилизовали фильтрованием и добавляли к стерилизованному в автоклаве солевому раствору с таким расчетом, чтобы конечная концентрация углеродсодержащего вещества была 0,5 %.
Для характеристики способности штамма утилизировать пестициды использовали торговые препараты (раундап, граунд, торнадо, тре-зор, хармони) в концентрации 0,1 % в пересчете на д. в.
Изучение влияния различных доз раундапа на рост двух разных культур микроорганизмов проводили в лабораторных условиях. Бактерии выращивали на синтетической минеральной среде следующего состава (г/л): (КН4)2804 - 1,0; №01 - 1,0; М^04 - 0,2; №2С03 - 0,2. В минеральную основу добавляли фосфатный буфер из расчета 10 мл на 90 мл среды и микроэлементы по Хогланду (0,1 мл на 100 мл среды). Фосфатный буфер и микроэлементы стерилизовали отдельно. Опыты проводили в пробирках. Посевной материал выращивали на мясопеп-тонном агаре (МПА), затем суспендировали его в КаС1 (0,85 %). После этого 0,1 мл суспензии, содержащей 2,7х106 кл/мл, вносили в пробирки с 5 мл ацетатно-минеральной питательной среды с различными дозами раундапа (от 2 до 2х10-4 об. % по д.в.).
Контролем служила аналогичная среда без пестицида. Культивирование проводили без дополнительной аэрации при температуре 30 °С в термостате в течение трех суток.
О росте культуры судили по определению общей численности клеток (М), с просмотром 80 квадратов и вычислением их среднего
титра в 1 мм суспензии в камере Горяева методом прямого счета. Результаты считали достоверными при вычислении стандартных отклонений ±5 %.
Биомассу определяли измерением оптической плотности суспензии клеток на приборе ФЭК-56 М.
Результаты исследования и их обсуждение. В процессе изучения культуральных признаков нового штамма R16 было установлено, что через трое суток роста на МПА он образует округлые, гладкие, не-пигментированные колонии, слизистой консистенции, не врастающие в агар. На агаризованной минеральной среде с раундапом (0,1 об. % по д.в.) образуются точечные, блестящие, бесцветные колонии. Следует отметить, что диаметр колоний, выросших на плотной синтетической среде с раундапом, намного меньше, чем на богатой питательной среде.
Изучение морфологических особенностей клеток в световом микроскопе МБИ-3 с использованием фазово-контрастной приставки КФ-4 показало, что рост R16 на среде с пестицидом не приводит к уменьшению или увеличению размеров клеток или появлению инво-лютивных форм, как это возможно при неблагоприятных условиях роста культуры бактерий.
При использовании фазово-контрастной микроскопии обнаружена способность штамма колонизировать капли раундапа, что характерно для штаммов, скорость роста которых не зависит от растворимости препарата в воде. Возможно, данный микроорганизм образует соединения, которые повышают растворимость препарата в воде.
В связи с тем, что бактерии могут изменять свою форму в процессе роста и развития, для выявления цикла развития и предварительной идентификации проводили последовательное микроскопическое наблюдение за культурой разного возраста (6-24-48-72 ч, 5-7 сут). Бактерии выращивали на двух синтетических минеральных средах, в одной из которых источником углерода был ацетат, а в другой - ра-ундап. На протяжении всего времени наблюдения клетки оставались палочковидными, подвижными. Нитевидных форм или скоплений при росте штамма R16 на жидких средах не отмечается. Установлено, что в старых культурах в клетках имеются включения. Деление простое -путем перетяжки. Совокупность изученных свойств штамма R16 представлена в табл. 1.
По совокупности всех изученных характерных признаков бактерии R16 близки к роду Pseudomonas [9, 12].
Характерные признаки штамма R16
Признак Результат Признак Результат
Окраска по Г раму - Цитрат Ка -
Форма клеток Палочки 2,4-Д +
Подвижность + Ацетат Ка +
Диаметр клеток, мкм 0,5-1 Метанол -
Оксидаза + Этанол +
Каталаза + Источник азота:
Уреаза - КН4+ +
Аргинингидролаза + КОз- +
Оринтиндекарбоксилаза - КО2- +
Лизин декарбоксилаза - Денатрификация -
Образование индола - О/Б - тест 0
Образование Н2Б - Рост при г 37 °С -
Источник углерода: Рост при г 30 °С +
сахароза Рост при г 5 °С +
лактоза - Способность к росту на пестицидах:
глюкоза + раундап +
манноза + граунд +
маннит + торнадо +
инозит + хармони +
малонат Ка + трезор +
Бактерии представляют собой прямые подвижные палочки размером (0,5-1,0)х(1,5-5,0) мкм. Грамотрицательные, спор не образуют, облигатные аэробы; метаболизм чисто дыхательного типа с использованием кислорода в качестве конечного акцектора электронов.
Бактерии R16 растут на простой минеральной среде с ацетатом, фенолом, пестицидами, оксидазо- и каталазоположительные, устойчивы к стрептомицину и канамицину, умеренно чувствительны к тетрациклину и левомицетину и высоко чувствительны к мономицину, пенициллину и эритромицину.
Судя по литературным данным, бактерии рода Pseudomonas привлекают пристальное внимание исследователей своей способностью к деструкции многих токсичных веществ, в том числе многих пестицидов [3], относящихся к различным классам органических соединений. Так, в работе [13] изучена утилизация 20 фосфонатов (среди которых много пестицидов) глифосатутилизирующим штаммом Pseudomonas
sp GS, в патенте [13] предложен способ микробного разложения фос-фоновых или фосфиновых соединений штаммом Pseudomonas.
Для прогнозирования скорости микробиологической трансформации или деструкции пестицидов в почве и управления этими процессами необходимо знать факторы и условия, прямо или косвенно определяющие взаимодействие почвенных микроорганизмов и экотоксикантов. В этой связи представляется важным, в частности, выявить пределы концентраций пестицидов, не оказывающих ингибирующего действия на микроорганизмы, а следовательно, не нарушающих их функции. В связи с этим были проведены эксперименты, направленные на изучение влияния различных доз раундапа на рост штамма R16 и сопоставление его ростовых характеристик с ростом музейного штамма Ac. calcoaceticus АК 540.
Опыты повторяли 3 раза. Оптическую плотность и общую численность клеток определяли методом прямого счета через 48 и 72 ч роста.
Культуру выращивали на ацетатно-минеральной среде, как указано выше. Дозы раундапа варьировали от 2 до 2-10"4% по д.в. Контролем служила среда аналогичного состава без внесения пестицида. Общее число клеток в 1 мл посевного материала R16 и Ac. calcoaceticus, соответственно, составляло 3,4-106 и 3,6 106. Изменение роста штамма R16 при различных дозах раундапа представлена в табл. 2.
Установлено, что раундап, внесенный в питательную среду в количестве 0,08-0,002 об. % по д.в., не оказывает отрицательного воздействия на ростовые характеристики R16 по сравнению с контролем.
Таблица 2
Изменение роста бактерий R16 при различных дозах пестицида
№ п/п Доза раундапа, об. % по д.в. Показатели процесса
М, кл/мл через Биомасса, ед. ОП через
48 ч 72 ч 48 ч 72 ч
1 2 - 3,5-105 - -
2 2 10-1 1,5 105 3,3-108 0 0,01
3 8 10-2 2,2-108 2,2-108 0,20 0,20
4 4 10-2 2,3 108 2,8-108 0,20 0,21
5 2 10-2 2,5 108 3,4-108 0,21 0,24
6 210-3 2,4-108 3,7-108 0,20 0,32
7 210-4 - 2,8-108 - 0,30
8 Контроль (без пестицида) 2,1108 2,6-108 0,18 0,28
Доза 0,2 об. % по д.в. в данном случае оказывает бактериостати-ческое действие, о чем свидетельствует образование колоний на плотной среде - возобновление роста и деления клеток.
Полная гибель клеток штамма Я16 обнаруживается лишь при максимально высокой концентрации пестицида, т.е. при дозе 2 % в данных условиях проведения эксперимента проявляется бактерицидный эффект. Сопоставление активности роста Я16 и Ас. са1соасвйст представлено на рисунке.
Рис. Активность роста штаммов бактерий при разных дозах гербицида, об. % по д.в.: 1 - контроль (без пестицида);
2 - 0,0002; 3 - 0,002; 4 - 0,02; 5 - 0,2
Как видно, музейная культура более чувствительна к воздействию раундапа. Ингибирование роста Ас. саісоасеїіст по сравнению с контролем обнаруживается при дозе гербицида 0,0002 об. % по д.в., а бактерицидный эффект наблюдается при 0,02 об. % по д.в.
Следует отметить, что способность к росту у Я16 на среде с пестицидом сохраняется и в неселективных условиях, что является необходимым условием при рассмотрении возможности его использования в биотехнологии по очистке почвы от загрязнения данными пестицидами.
Список литературы
1. Мельников H.H., Волков А.И., Короткова O.A. Пестициды и окружающая среда. - М.: Химия, 1977. - 240 с.
2. Глифосат («раундап») // Журнал пестицидной реформы Каролин кокс. -1998. - Т. 18, № 3. - URL: http: //www.forest.ru/rus/bulletin/16/ 5full.html.
3. Круглов Ю.В. Микрофлора почвы и пестициды. - М.: Агро-промиздат, 1991. - 362 с.
4. Metabolism of Glyphosate in Pseudomonas sp. Strain LBr. / G.S. Jacob [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 1988. - № 54. - P. 2953-2958.
5. Pipke R., Amrhein N. Degradation of the Phosphonate Herbicide Glyphosate by Arthrobacter atrocyaneus ATCC 13752 // Appl. Environ. Microbiol. - 1988. - № 54. - P. 1293-1296.
6. Balthazor T.M., Hallas L.E. Glyphosate Degrading Microorganisms from Industrial Activated Sludge // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. -№ 51. - P. 432- 434.
7. Liu C.M., McLean P.A., Sookdeo C.C., Cannon F.C. Degradation
of the Herbicide Glyphosate by Members of the Family Rhizobiaceae //
Appl. Environ. Microbiol. - 1991. - № 57. - P. 1799-1800.
8. Moneke A.N., Okpala G.N., Anyanwu C.U. Biodegradation of glyphosate herbicide in vitro using bacterial isolates from four rice fields African // Journal of Biotechnology. - 2010. - Vol. 9 (26). - P. 4067-4074.
9. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.: Изд-во МГУ, 1991. - 303 с.
10. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: Изд-во МГУ, 1991. - 248 с.
11. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. - М.: Колос, 1983. - 248 с.
12. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. Т. 1: пер с англ. / под
ред. Дж. Хоулта [и др.]. - М.: Мир, 1007. - 432 с.
13. In vivo utilization on N - (phosphonomethye) - anilines and related substances by Pseudomonas spec. GS / B. Albrecht, R. Weidhase, M. Stock, R. Weidhase // Journal Bacic. Microbiol. - 1991. - Vol. 31, № 6. -С. 403-411.
Получено 2.06.2011
