CC BY
74
УДК 579.26
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ БИОРАЗНООБРАЗИЕ ПОЧВЕННЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ПРИ ВНЕСЕНИИ ОРГАНИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ*
М.В. Горленко, О.С. Якименко, М.В. Голиченков, Н.В. Костина
Изучено влияние органических субстратов различной природы (подстилочный навоз, гу-мат натрия, дизельное топливо и глифосат) на параметры функционального биоразнообразия, оцененные методом мультисубстратного тестирования, биологическую активность дерново-подзолистой почвы и почвогрунта при инкубировании в модельном эксперименте. Показано, что навоз и нефтепродукты улучшали параметры биоразнообразия и усиливали дыхание и азотфиксацию в почве, особенно в почвогрунте. Влияние гумата и глифосата было менее выраженным и в большей степени зависело от дозы внесения.
Ключевые слова: функциональное биоразнообразие, мультисубстратное тестирование, биологическая активность, нефтепродукты, гумат, глифосат.
Введение
Почвенные микробные сообщества являют собой центральный элемент преобразования органического вещества в наземных экотопах. Естественные природные микробные сообщества — это обычно сбалансированные системы, в нормальных условиях служащие идеальным процессором материи, энергии и информации в биосферных циклах. Однако усиление антропогенного дисбаланса, обусловленного появлением новых органических соединений, регулярно и в значительных количествах попадающих в почву, может радикально изменить свойства почвенных микробных сообществ. Это проявляется в нарушении пропорций между параметрами структурного и функционального биоразнообразия микробной системы почв, снижающем эффективность ее функционирования вплоть до коллапса.
Функциональное биоразнообразие является основополагающим свойством почвенного микробного сообщества, характеризующим образ действия микробной системы на биосферном уровне и определяющим способ трансформации органических веществ почвой в рамках глобальных циклов углерода и азота.
Оценка воздействия внесения органических веществ в почву — классическая задача микробиологии, которую поставил еще С.Н. Виноградский [1]. Однако изучение этих влияний традиционно проводилось ограниченной обоймой методов, таких, как прямой учет, газохроматографические методы и др. Появление мультипараметрических методов оценки структурного и функционального состояния микробного сообщества (РЬБА, БЮЬОО, мультисубстрат-ное тестирование) открывает новые перспективы в исследованиях такого рода.
Цель данной работы — определение специфики изменения функционального биоразнообразия
микробных систем естественных и искусственных почвенных объектов под влиянием внесения органических соединений различной моды действия и генезиса с использованием метода мультисубстратного тестирования (МСТ), оценки эмиссии СО2 и азот-фиксации методами газовой хроматографии. В модельном эксперименте в качестве органических веществ, предположительно стимулирующих почвенную биоту, использовали подстилочный навоз и гумат натрия, а в качестве угнетающих — нефтепродукты и пестициды.
Объекты и методы исследования
Эксперимент проводили в лабораторных условиях. В качестве почвенных субстратов использовали гумусо-аккумулятивный горизонт дерново-подзолистой почвы (г. Москва), а также модельный почво-грунт (МПГ), приготовленный промышленным способом в соответствии с международным стандартом ИСО 11268-1. Состав МПГ: каолин — 20%, переходный торф — 10, строительный песок — 70%.
Исследуемые почвенные субстраты обладают слабокислой реакцией среды (рН 4,6 в МПГ и 6,2 в почве), высокими содержанием гумуса (5,8 и 10,3% соответственно) и обеспеченностью азотом и фосфором.
Влияние органических удобрений на параметры биоразнообразия почвенного микробного сообщества оценивали на примере подстилочного навоза КРС. Дозы его внесения в опыте соответствовали 50, 100 и 250 т/га.
В качестве гуминового удобрения использовали препарат «Гуми-90» — гумат натрия, получаемый промышленным способом из бурого угля и позиционируемый производителями в качестве почвенного кондиционера и стимулятора роста растений. Препа-
* Работа выполнена по проекту РФФИ 10-04-01681а.
рат вносили в виде раствора в концентрациях, эквивалентных 0,1; 0,5 и 1,0 г/кг.
Влияние нефтепродуктов изучали на примере дизельного топлива — наиболее низколетучей фракции перегонки нефти, состоящей в среднем на 75% из насыщенных углеводородов (парафины и цикло-парафины) с длиной углеродной цепи С10—С15 и на 25% — из ароматических углеводородов. В опыте минимальная нагрузка нефтепродуктов на почву составляла 2 ПДК (1 г/кг), использовали дозы 10 и 20 ПДК (5 и 10 г/кг соответственно).
Влияние пестицидов оценивали на примере широко применяющегося гербицида «Раундап». Действующее вещество препарата — глифосат, М-фосфо-нометильное производное аминокислоты глицина — нарушает синтез аминокислот, необходимых для роста и жизнедеятельности растений. «Раундап» является системным неселективным гербицидом сплошного действия по активно вегетирующим сорным растениям, применяется для борьбы против однолетних и многолетних двудольных в период вегетации; широко используется как в сельском хозяйстве, так и в городских условиях — в парках, на газонах и обочинах дорог. Основная опасность для окружающей среды связана с потенциальной возможностью загрязнения почв глифосатом в виду его высокой сорбиру-емости почвами. Согласно гигиеническим нормативам содержания пестицидов в объектах окружающей среды (ГН 1.2.1323-03), ПДК остаточного содержания глифосата в почве составляет 0,5 мг/кг. Эту концентрацию использовали в опыте как минимальную нагрузку, прочие дозы составляли 10 и 100 ПДК (5 и 50 мг/кг).
Методика проведения модельного опыта. Навески почв массой 0,5 кг помещали в объемный сосуд, добавляли воды до достижения влажности 60% от ППВ (100 и 125 мл для почвы и МПГ соответственно) и тщательно перемешивали. Дизельное топливо вносили пипеткой в объемах, соответствующих дозам внесения по массе в соответствии со схемой опыта, навоз — по массе в соответствии со схемой опыта, затем снова перемешивали.
«Раундап» и гумат натрия предварительно растворяли в объеме воды, необходимом для достижения почвами влажности 60% от ППВ (100 и 125 мл для почвы и МПГ соответственно), так, чтобы концентрация действующего вещества гербицида или гу-мата в растворах составляла величину, эквивалентную дозам внесения. Полученные растворы добавляли к сухим навескам почв и тщательно перемешивали.
Полученную смесь помещали в вегетационные сосуды объемом 1000 см3 и инкубировали при комнатной температуре. Влажность субстратов поддерживали постоянной, доливая воду в соответствии с потерей их массы. Через 20 и 45 сут. инкубирования из каждого сосуда микробуром отбирали смешанные почвенные пробы для последующих анализов методом МСТ. Пробы для определения дыхания и азот-
фиксации газохроматографическими методами брали через 45 сут.
Проведение мультисубстратного тестирования. Метод МСТ — стандартный метод почвенной микробиологии и выполняется в соответствии с Методикой выполнения измерений [8]. Пробы почв массой 0,7 г помещали в центрифужный стаканчик, заливали дистиллятом (1: 50) и полученную суспензию обрабатывали в течение одной минуты на шейкере типа Vortex для отделения бактериальных клеток от минеральных частиц почвы, которые впоследствии осаждали центрифугированием. К выделенной фракции микробного сообщества добавляли индикатор потребления субстратов (соль тетразолия), перемешивали и раскапавали по 200 мкл в 96-луночный планшет «Эко-Лог©», содержащий набор из 47 тест-субстратов и минеральной основы в двух повторностях. Используемые тест-субстраты включали сахара, аминокислоты, полимеры, нуклеозиды, соли органических кислот, спирты. Планшеты инкубировали в термостате при 28° до появления визуально регистрируемой окраски ячеек (72 ч), вызванной развитием микроорганизмов, восстанавливающих трифенилтетразолий в формазан, придающий среде в ячейке красное окрашивание. Концентрация формазана и обусловленная им оптическая плотность ячейки определяются интенсивностью роста группы микроорганизмов, способных потреблять тест-субстрат, содержащийся в данной ячейке. После окончания инкубации осуществляли фотометрическое считывание оптической плотности ячеек в диапазоне 510 нм программно-аппаратным комплексом «Эко-Лог©» (Горленко, 2009).
Массив данных, полученный в результате фотометрического измерения значений оптической плотности по всем ячейкам (всем субстратам), представляет собой спектр потребления субстратов (СПС) для данного почвенного микробного комплекса. На основании СПС при помощи программного обеспечения «Эко-Лог©» вычисляли массив коэффициентов функционального биоразнообразия исследуемого микробного сообщества, являющихся характеристическими признаками его состояния.
В данной работе мы использовали следующие параметры: процент потребленных субстратов как мера относительного функционального биоразнообразия сообщества — N = (N/N^^ • 100), где ^макс — общее число тест-субстратов (47); метаболическая работа микробного сообщества — W; коэффициент рангового распределения Горленко спектров потребления субстратов d как мера дестабилизации, или возму-щенности системы; интегральный параметр общего благополучия системы как отношение биоразнообразия к нестабильности — G = N/d.
В изученных нами ранее микробных системах наиболее информативным оказался коэффициент d, отражающий нестабильность сообщества. Варьируя в изученных нами природных и модельных системах от 0,01 до 2,0, он позволяет оценить благополучие
и стабильность микробных сообществ. На основании экспериментов можно ввести следующую шкалу: в благополучных избыточных системах, имеющих максимальный запас прочности, с1 принимает значения от 0,01 до 0,4 (состояние отличное); в устойчивых стабильных системах — от 0,4 до 0,6 (состояние хорошее); системам с истощенными ресурсами или находящимся под обратимым воздействием какого-либо нарушающего фактора характерны значения с1 от 0,6 до 0,8 (состояние угнетенное); кризисным дестабилизированным системам соответствуют значения 0,8—1,0 (состояние кризисное); значения с1 >1 характерны для необратимо нарушенных систем, потерявших исходную функциональную целостность (состояние катастрофическое) [2, 3].
Хроматографические методы анализов. Активность эмиссии углекислого газа определяли методом газовой хроматографии [9, 10]; эмиссию углекислого газа — на газовом хроматографе «М-3700» с детектором по теплопроводности; активность азотфиксации — ацетиленовым методом [9, 11, 12] на газовом хроматографе «Кристалл-2000» с пламенно-ионизационным детектором.
Результаты и их обсуждение
роорганизмов и наличия доступной органики, эффект от дополнительного внесения органических соединений оказался менее выражен. Стимулирующий эффект прослеживался только при добавлении нефтепродуктов в промежуточных концентрациях. С другой стороны, ни один из используемых субстратов не демонстрировал заметного угнетающего эффекта на дыхательную активность почв.
Все исследуемые органические субстанции либо не оказывали существенного влияния на активность азотфиксации в контрольной почве (гумат, глифо-сат), либо ее стимулировали (навоз, нефтепродукты). Максимальная нитрогеназная активность отмечалась в почве при добавлении нефтепродуктов. Это можно объяснить увеличением анаэробных зон в почве
Таблица 1
Эмиссия СО2 и интенсивность азотфиксации из почв вариантов опыта
Биотические параметры исследуемых объектов. Все внесенные вещества оказали определенное влияние на величину эмиссии углекислого газа как при инкубировании с почвой, так и с МПГ (табл. 1). Из полученных данных следует, что активность эмиссии СО2 из интакт-ных образцов почвы почти в 2 раза превышала таковую модельного поч-вогрунта. Это различие обусловлено, по всей видимости, изначально низким содержанием в МПГ микроорганизмов и недостатком доступных органических субстратов. Именно поэтому при добавлении к почвогрунту органических соединений его дыхательная активность существенно повышалась. По увеличению эмиссии углекислого газа косвенно можно судить о степени доступности вводимого субстрата для ассимиляции микробоценозом. Наиболее отчетливо этот процесс прослеживается при добавлении к модельному почвогрунту нефтепродуктов и навоза в высокой и промежуточной концентрациях.
В почве, вероятно, в силу изначально большей численности мик-
Вариант опыта Доза внесения Эмиссия СО2, мкмоль СО2/г • сут. Интенсивность азот-фикации, нг С2Н4Д • ч
среднее стандартное откл. среднее стандартное откл.
Почва — контроль 3,89 1,35 1087 263
Почва + навоз 50 т/га 3,68 0,07 н/о н/о
100 т/га 1,96 0,36 то же то же
250 т/га 2,59 0,46 1260 143
Почва + гумат 0,1 г/кг 3,89 0,32 н/о н/о
0,5 г/кг 3,57 0,22 то же то же
1 г/кг 3,12 0,96 971 166
Почва + нефтепродукт 1 г/кг 3,42 0,32 н/о н/о
5 г/кг 5,65 1,07 то же то же
10 г/кг 3,89 0,47 1378 101
Почва + глифосат 0,5 мг/кг 3,40 0,38 н/о н/о
5 мг/кг 3,07 0,57 то же то же
50 мг/кг 3,91 0,11 1038 239
МПГ — контроль 1,83 0,50 16 13
МПГ + навоз 50 т/га 2,12 0,44 н/о н/о
100 т/га 2,85 0,53 то же то же
250 т/га 3,08 0,29 774 131
МПГ + гумат 0,1 г/кг 2,43 1,08 н/о н/о
0,5 г/кг 1,91 0,24 то же то же
1 г/кг 1,28 0,26 224 22
МПГ + нефтепродукты 1 г/кг 3,06 0,31 н/о н/о
5 г/кг 4,22 0,26 то же то же
10 г/кг 5,76 0,47 492 45
МПГ + глифосат 0,5 мг/кг 1,31 0,74 н/о н/о
5 мг/кг 2,17 0,33 то же то же
50 мг/кг 1,38 0,11 29 8
Примечание: н/о — не определено.
за счет образования нефтепродуктами пленок вокруг микроагрегатов, содержащих азотфиксирующие микроорганизмы, а нитрогеназа — фермент, чувствительный к присутствию кислорода.
Внесение в МПГ органических соединений в целом активировало азотфиксацию. Наиболее благотворное действие оказывал навоз, добавляемый к поч-вогрунту. Увеличение азотфиксирующей активности в данном случае можно объяснить не только поступлением большого количества доступных органических соединений, но и активацией пула микроорганизмов, изначально содержавшихся в навозе. Из органических веществ наименьшим стимулирующим действием по отношению к азотфиксации обладал гумат, а внесение глифосата не оказывало достоверного влияния на активность азотфиксации в МПГ.
Результаты МСТ. Сводные данные по параметрам биоразнообразия, полученные методом МСТ через 20 и 45 сут. инкубирования органических веществ с почвой и МПГ, представлены в табл. 2, 3.
Контрольные образцы: почва и модельный поч-вогрунт. Позиционируя экспериментальные данные в пространстве основных параметров функционального биоразнообразия, изначально МПГ проявляет себя как закритичная дестабилизированная система с минимальным разнообразием и работой. Почва, напротив, проявляет себя как стабильная, разнообразная и мощная система. Это легко объясняется ее естественным происхождением, в отличие от модельного искусственного субстрата, представляющего со-
бой смесь торфа, песка и каолинита. Однако с течением сукцессии происходит адаптация микрофлоры, и модельная система несколько стабилизируется, переходя из закритичного в субкритичное состояние, значительно прибавив себе биоразнообразия и метаболического потенциала, видимо, за счет ресурсов биоразнообразия и органических веществ торфа, входящих в ее состав.
Естественная почва в процессе инкубации, напротив, несколько снижает свое качество и деградирует в связи с выработкой ресурсов, несколько теряя биоразнообразие и дестабилизируясь, несмотря на колоссальную разницу вначале; системы приходят к финишу в сходном субкритическом состоянии (й около 0,8).
Внесение навоза. Навоз как естественное органическое удобрение сочетает в себе как богатую органическую, так и микробиологическую составляющую. Метод МСТ был ранее опробован для контроля качества агроэкосистем и влияния органических удобрений [7]. На обоих сроках инкубирования он оказывал позитивное воздействие, улучшая качество системы по всем учтенным параметрам биоразнообразия в объектах (табл. 1, 2). Внесение навоза на 20-е сут. делает эти системы практически идеальными (й < 0,4), оптимизируя как почву, так и МПГ. Сходная динамика проявляется и для параметров Ш и N. Оптимальной является доза, соответствующая 100 т/га, которая сохраняет эффективность и на поздних сроках, и даже для модельной почвы.
Таблица 2
Параметры функционального разнообразия почвенных микробных сообществ, по данным МСТ, в почве через 20 и 45 сут. инкубирования
Вариант Доза внесения Параметры МСТ
биоразнообразие (N) метаболическая работа (W ) неустойчивость (d ) состояние микробной системы
20 сут. 45 сут. 20 сут. 45 сут. 20 сут. 45 сут. 20 сут. 45 сут.
Почва, гор. А1 0 85 81 1041 781 0,33 0,76 отличное угнетенное
Почва + навоз 50 т/га 87 70 1054 729 0,11 0,93 то же кризисное
100 т/га 91 87 1304 925 0,20 0,39 - и - отличное
250 т/га 94 74 1200 716 0,05 0,60 - и - хорошее
Почва + гумат 0,1 г/кг 74 49 1301 609 0,28 1,54 — il — катастрофическое
0,5 г/кг 89 85 1118 967 0,21 0,60 - ii - хорошее
1 г/кг 89 81 1282 812 0,06 0,88 - ii - кризисное
Почва + нефтепродукт 1 г/кг 85 85 947 850 0,27 0,52 - ii - хорошее
5 г/кг 91 85 1034 832 0,04 0,65 - ii - угнетенное
10 г/кг 89 66 1061 636 0,27 1,53 - ii - катастрофическое
Почва + глифосат 0,5 мг/кг 94 79 1032 789 0,06 0,57 - ii - хорошее
5 мг/кг 94 77 990 821 0,35 0,34 - ii - отличное
50 мг/кг 89 85 1011 943 0,48 0,17 хорошее то же
Таблица 3
Параметры функционального разнообразия почвенных микробных сообществ, по данным МСТ в МПГ, через 20 и 45 сут. инкубирования
Вариант Доза внесения Параметры МСТ
биоразнообразие (М) метаболическая работа (Ж) неустойчивость (Л) состояние микробной системы
20 сут. 45 сут. 20 сут. 45 сут. 20 сут. 45 сут. 20 сут. 45 сут.
МПГ 0 81 55 896 722 0,89 0,83 кризисное кризисное
МПГ + навоз 50 т/га 89 49 933 693 0,16 0,51 отличное хорошее
100 т/га 89 83 959 1039 0,36 0,05 то же отличное
250 т/га 87 70 1030 653 0,17 0,96 — и — кризисное
МПГ + гумат 0,1 г/кг 70 64 756 768 0,55 0,99 хорошее то же
0,5 г/кг 64 68 701 780 1,22 0,92 катастрофическое — и —
1 г/кг 79 38 732 615 1,02 2,44 то же катастрофическое
МПГ + нефтепродукты 1 г/кг 70 60 803 666 0,99 1,24 кризисное то же
5 г/кг 81 72 911 774 0,35 1,12 отличное — и —
10 г/кг 81 70 807 742 0,13 0,85 то же кризисное
МПГ + глифосат 0,5 мг/кг 60 72 736 822 0,80 0,58 угнетенное хорошее
5 мг/кг 51 68 708 930 1,17 0,77 катастрофическое угнетенное
50 мг/кг 70 68 703 872 0,70 1,15 угнетенное катастрофическое
Однако максимальная использованная доза (250 т/га) вводит систему в состояние кризиса, особенно на поздних сроках инкубации. Эти данные согласуются со сходными исследованиями [14, 15], где показано, что функциональное биоразнообразие, исследованное с помощью системы БЮЬОО, возрастает при внесении навоза.
Внесение гумата. Гуминовые вещества оказывают разностороннее положительное влияние на свойства почв и почвенной биоты. В предварительных исследованиях было выявлено, что коммерчески доступные гуминовые препараты также оказывают выраженное действие на параметры функционального биоразнообразия почвенной микробиоты [6, 18].
Внесение гумата в почву на раннем сроке инкубации приводило к некоторому увеличению метаболической работы и снижению неустойчивости системы, так что величина Л линейно снижалась с дозой от 0,33 до 0,06 (табл. 2). Доза 0,5 г/кг на позднем сроке инкубации также улучшала состояние микробного сообщества, и система переходила из угнетенного состояния в хорошее. Однако на 45-е сут. инкубации наблюдался парадоксальный токсический эффект малых доз для концентрации 0,1 г/кг, когда биоразнообразие и метаболическая работа снижались, а величина Л достигала 1,5.
Инкубирование гумата с МПГ в дозах 0,5 и 1 г/кг вводило систему в кризисное и катастрофическое состояние на обоих сроках инкубации (табл. 3).
Исключение составляет вариант с низкой концентрацией гумата на 20-е сут. наблюдения, когда состояние системы улучшалось и переходило из кризисного в хорошее.
Тот факт, что используемый гумат не оказывал существенного положительного влияния на микробное сообщество, вероятно, обусловлен тем, что за счет низких доз его внесения содержание органических субстратов в обеих почвенных разностях не увеличивалось. Ожидаемой активизации деятельности микрофлоры не наблюдалось, что подтверждает отсутствие значимых изменений в интенсивности дыхания и азотфиксации.
Внесение нефтепродуктов. Нефтепродукты являются серьезными поллютантами. По литературным данным, дизельное топливо обладает выраженным токсическим действием по отношению к почвенной биоте, хотя при относительно низком содержании его в почве наблюдается всплеск микробиологической активности за счет селективного развития микроорганизмов, потребляющих углеводороды в качестве питательного субстрата. На сегодняшний день существуют данные о влиянии нефтепродуктов на спектры ассимиляции субстратов системой БЮЬОО [13], однако таковых о количественном изменении функционального биоразнообразия нет. Возможность индикации загрязнения почв углеводородами с использованием метода МСТ продемонстрирована ранее [4, 5].
Дизельное топливо оказало выраженное стимулирующее действие на микрофлору исследуемых почвенных разностей во всем диапазоне проверенных концентраций на ранних сроках инкубации (табл. 1,2). Отмечены его парадоксальное подавляющее действие в минимальной концентрации на МПГ на всех сроках инкубации, а также суперстимуляция дыхания и азотфиксации. Вероятно, это вызвано перестройкой сообщества на преимущественное потребление углеводородов, которые в данном варианте опыта являются превалирующим источником доступных органических субстратов.
На ранних этапах воздействие нефтепродуктов не ухудшало категорийную оценку почвенной системы, согласно которой состояние для обоих объектов классифицировалось как хорошее. К концу эксперимента микробное сообщество почвы показало линейное угнетение и повышение категории опасности (хорошая—угнетенная—катастрофическая) с возрастанием концентрации поллютанта (табл. 2). Модельный почвогрунт демонстрировал крайнее угнетение микробного сообщества в рамках диапазона категорий кризисная—катастрофическая на всем диапазоне концентрации и отсутствие буферности к нефтяному загрязнению.
Внесение «Раундапа». Остатки пестицидов в почве также относятся к загрязняющим веществам и допустимые пределы их содержания регламентируются, но их влияние собственно на параметры функционального биоразнообразия изучено мало.
Гербицидный препарат комплексного состава «Раундап» с основным действующим веществом — глифосатом показывает выраженное стимулирующее действие и повышает функциональное биоразнообразие микробного сообщества по всем используемым параметрам на сроке 20 сут. для почвы и проявляет неоднозначное действие на МПГ. На поздних сроках инкубирования сохраняется эффект стимуляции для обеих почвенных разностей, кроме варианта с максимальной концентрацией для МПГ. Вероятно, «Раун-
дап» может действовать на почвенные водоросли, убирая конкуренцию с бактериями, и сам по себе используется как питательный субстрат. Параметры дыхания и азотфиксации достоверно не изменяются.
Сходные эффекты стимуляции микробного сообщества данным гербицидом описаны в ряде работ [16, 17, 19—22]. Объяснение этому факту, вероятно, следует искать в химической структуре глифосата, который представляет собой производное аминокислоты глицин. Последняя может высвобождаться при гидролизе глифосата в почве и метаболизироваться микроорганизмами.
Таким образом, исследованные почвенные системы по-разному реагируют на внесение гербицида «Раундап». Микробное сообщество почвы в течение эксперимента не обнаружило выраженной негативной реакции на поллютант во всем диапазоне концентраций, и состояние системы оценивается как хорошее на всех этапах сукцессии с тенденцией к ее стимулированию, что указывает на использование гербицида как питательного субстрата полноценным микробным сообществом естественной почвы (табл. 3). МПГ, напротив, показывает линейное угнетение состояния системы согласно градиенту концентраций и варьирует от хорошего через угнетенное к катастрофическому. Видимо, редуцированное сообщество модельного почвогрунта не справляется с утилизацией глифосата. Таким образом, микробные сообщества разного генезиса по-разному реагируют на внесение данного загрязнителя, что необходимо учитывать при оценке его экотоксичности.
Кластерный анализ. Результаты кластерного анализа (Эвклид—Вард) спектра потребления субстратов исследованных образцов на 20-е сут. представлены на рисунке. Для МПГ характерно четкое разделение по характеру воздействия субстратов. Резко выделяются варианты с внесением навоза, что объяснимо наличием в нем активной микрофлоры. Варианты с гуматом и глифосатом составляют отдельный кластер, подтверждая физиологическую активность этих
мпг
Почва
9000
ф I 8000
к е 7000
о
о со 6000
о.
ф о 5000
^
о ф 4000
т
^ 3000
о
X о 2000
о
1 1000
0
и
о о
ю о
СМ т-
I I
со со
< <
X X
ю ю ё о
е
О Ю Т-
о~ о"
I I
1= п.
ю
I
е
Ч- Ю О -О
1 I -г— Г-
с С т § I I С р.
I
о
2,5Е7
ф
3
§ 2,0Е7
о о
03
« 1.5Е7
1.0Е7
2 о
8 0,5Е6
I Л Ь г^Г
о о
о ю
V- СМ
I I
оо со
< <
X X
"7 ю ю С о" о"
I_ I I
■-ре
ю ю
е I
о о ю ю
.а
$ 4 I
I X
-1- о
Результаты кластерного анализа спектра потребления субстратов в МПГ и почве: ГП — гуминовый препарат, ГФ — глифосат, НП — нефтепродукты, НАВ — навоз; цифры — концентрация (см. текст)
веществ. Нефтепродукты в испытанных концентрациях не модифицируют существенно микробное сообщество МПГ на 20-е сут. При добавлении в почву наблюдается парадоксальный эффект малых концентраций для гумата в дозе 0,1 г/кг, который существенно модифицирует микробное сообщество. Выделяются также варианты с внесением навоза и гумата в максимальной концентрации. Специфика других вариантов четко не выявлена.
Выводы
По характеру воздействия на почвенные микробные сообщества исследуемые органические субстанции разделились на две группы. Навоз и нефтепродукты, вносимые в концентрациях порядка единиц—десятков г/кг, выступают главным образом в качестве питательных субстратов для микроорганизмов и за счет этого оптимизируют параметры функционального биоразнообразия и биологической активности. Так, внесение навоза, сочетающего наличие легкодоступных органических веществ и богатую микрофлору, улучшало показатели биоразнообразия, метаболической работы и устойчивости системы в обеих поч-
венных разностях. Нефтепродукты проявили сходные тенденции воздействия, особенно заметные в МПГ, обедненном органическим веществом и микрофлорой. Токсическое действие в изученных концентрациях используемыми методами выявить не удалось.
Другую группу составили вещества, вносимые в концентрациях миллиграмм на килограмм — гумат и глифосат. За счет низких доз они не могут служить источником доступных углерода и азота для микробного сообщества, а воздействуют на микроорганизмы за счет других механизмов. Так, внесение гумата не оказало существенного влияния на состояние сообщества микроорганизмов МПГ. При инкубировании с почвой выявлено положительное воздействие лишь в отдельных вариантах опыта. Глифосат, оказывающий токсическое действие на высшие растения, токсичности по отношению к сообществу почвенных микроорганизмов не продемонстрировал. Отмечен факт значительного различия в реакции микробных сообществ разных объектов на внесение одних и тех же субстанций, что необходимо учесть при разработках схем удобрений и критериев оценки токсичности для разных типов почв.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. Проблемы и методы. Пятьдесят лет исследований. М., 1952.
2. Горленко М.В., Кожевин П.А. Дифференциация почвенных микробных сообществ с помощью мультисуб-стратного тестирования // Микробиол. 1994. Т. 63, вып. 2.
3. Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. М., 2005.
4. Горленко М.В., Сопрунова О.Б., Шадрина О.И., Терехов А. С. Комплексная оценка эффективности ремедиации нефтезагрязненных почв интродуцированным цианобак-териальным сообществом // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2006. № 1.
5. Горленко М.В., Терехов А.С., Марченко С.А. и др. Индикация загрязнения почвы полициклическими ароматическими углеводородами по функциональной реакции почвенного микробного комплекса // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2003. № 1.
6. Горленко М.В., Якименко О. С. Влияние промышленных гуматов на функциональное разнообразие почвенного микробного сообщества // Гуминовые вещества и фитогормоны в сельском хозяйстве. Днепропетровск, 2010.
7. Коростелева Л.А., Горленко М.В. Возможности метода МСТ при микробиологическом мониторинге состояния агроэкосистемы // Агроэкологический мониторинг в земледелии Краснодарского края (Труды КубГАУ). Краснодар, 2008.
8. Методика выполнения измерений интенсивности потребления тест-субстратов микробными сообществами почв и почвоподобных объектов фотометрическим методом: ФР.1.37.2010.08619; ПНД ФТ 16.1.17-10. М., 2010.
9. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1991.
10. Степанов А.Л., Лысак Л.В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии. Уч.-метод. пособие. М., 2002.
11. Сэги Й, Муромцев Г.С. Методы почвенной микробиологии. М., 1983.
12. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.,
1986.
13. Bundy Ja.G, Paton G.I., Campbell C.D. Combined microbial community level and single species biosensor responses to monitor recovery of oil polluted soil // Soil Biol. Bio-chem. 2004. Vol. 36.
14. Guanghua W, Junjie L., Xiaoning Q. et al. Effects of fertilization on bacterial community structure and function in a black soil of Dehui region estimated by Biolog and PCR-DGGE methods // Acta Ecologica Sinica. 2008. Vol. 28, N 1.
15. Parham J.A., Deng S.P., Da H.N. et al. Long-term cattle manure application in soil. II. Effect on soil microbial populations and community structure // Biol. Fertil. Soils. 2003. Vol. 38.
16. Pereira J.L., Picanco M.C., Silva et al. Effects of glyphosate and endosulfan on soil microorganisms in Soybean crop // Planta Daninha. 2008. Vol. 26, N 4.
17. Stenroed M, Charnay M, Benoit P., Eklo O. Spatial variability of glyphosate mineralization and soil microbial characteristics in two Norwegian sandy loam soils as affected by surface topographical features // Soil Biol. Biochem. 2006. Vol. 38.
18. Terekhova V., Yakimenko O, Gorlenko M. Comparative Sensitivity of Standard Test-Organisms to Commercial Humates of Different Origin // 1st Intern. Conf. on Humics-based Innovative Technologies «Natural and Synthetic Poly-functional Compounds and Nanomaterials in Medicine and Biomedical Technologies». Moscow. November 4—8, 2010.
19. Wardle D.A., Parkinson D. Effects of three herbicides on soil microbial biomass and activity // Plant and Soil. 1990. Vol. 122.
20. Wardle D.A., Parkinson D. Relative importance of the effect of 2,4-D, glyphosate, and environmental variables on the soil microbial biomass // Plant and Soil. 1991. Vol. 134.
21. Weaver M.A., Krutz L. J., Zablotowicz R., Reddy K.N. Effects of glyphosate on soil microbial communities and its
mineralization in a Mississippi soil // Pest. Manag. Sci. 2007. Vol. 63.
22. Zobiole L.H.S., Oliveira R.S., Kremer R.J. et al. Effect of glyphosate on symbiotic N2 fixation and nickel concentration in glyphosate-resistant soybeans // Applied Soil Ecol. 2010. Vol. 44.
Поступила в редакцию 04.10.2011
FUNCTIONAL BIODIVERSITY OF SOIL MICROBIAL COMMUNITY STRUCTURE
INFLUENCED BY ORGANIC AMENDMENTS OF DIFFERENT NATURE
M.V. Gorlenko, O.S. Yakimenko, M.B. Golichenkov, N.V. Kostina
The changes in the functional biodiversity caused by organic substances amendments have been investigated using CLPP profiling and gas chromatography assays for the urban soddy-podzolic soil and artificial soil-like model substrate. Farmyard manure, sodium humate, diesel fuel and herbicide glyphosate have been used as additives in our experiments. The significant differences between acting agents have been revealed in a way of influence on functional biodiversity and biological activity of soils being investigated. The different impact of the substances used has been described for each soil.
Key words: functional biodiversity, CLPP, biological activity, oil pollution, humate, glyphosate.
Сведения об авторах
Горленко Михаил Владимирович, канд. биол. наук, науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-35-98; e-mail: gorlenko@soil.msu.ru. Якименко Ольга Сергеевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. каф. химии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-21-29; e-mail: yakim@soil.msu.ru. Голиченков Максим Владимирович, канд. биол. наук, науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-35-46; e-mail: affen@mail.ru. Костина Наталья Викторовна, канд. биол. наук, ст. препод. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-35-46; e-mail: nvkostina@mail.ru.
