CC BY
32
УДК 631.46
ОЦЕНКА МИКРОБНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ АЗОТА И УГЛЕРОДА
В УСЛОВИЯХ НЕФТЯНОГО И РАДИОАКТИВНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ
А.Л. Степанов, О.Б. Цветнова, С.Н. Паников
В натурных условиях радиоактивно загрязненных почв Брянского Полесья установлены особенности изменения всех показателей биологической активности почвы (интенсивность дыхания, активность азотфиксации и денитрификации), а также структуры микробного сообщества. В модельных экспериментах исследована микробная трансформация азота и углерода при сочетанном влиянии нефтяного и радиоактивного загрязнения почв.
Ключевые слова: радиоактивное загрязнение, 13^, нефтяное загрязнение, биологическая активность почв, микробная трансформация.
Введение
Интенсивное развитие промышленного производства, транспорта, внедрение новых технологий, в том числе на основе ядерного синтеза, неизбежно сопровождается загрязнением окружающей среды. В таких условиях обычным явлением становится сочетанное загрязнение природной среды и прежде всего почвенного покрова поллютантами органической и неорганической природы. Несомненно, что при любых антропогенных воздействиях на почвенный покров первыми на них реагирует почвенная биота.
В настоящее время одним из наиболее распространенных загрязнителей окружающей среды является нефть и продукты ее переработки. Часто экотоксикантами являются и техногенные радионуклиды, поступающие в природную среду в результате технологических и аварийных выбросов объектов ядерно-топливного цикла, в первую очередь атомных электростанций (АЭС). Воздействие нефтяного и радиоактивного загрязнения на микробное сообщество и биологическую активность почв изучено достаточно хорошо [5—9, 12]. Известно, что степень воздействия этих экотоксикантов различна. Наибольшее влияние на биологическую активность почв оказывают нефть и нефтепродукты, воздействие радионуклидов при плотностях загрязнения, отмечаемых на современном этапе, менее значимо. Вместе с тем в современных условиях глобального загрязнения природной среды экотоксикантами разного происхождения особый интерес представляют исследования, направленные на изучение эффекта их сочетанного воздействия, поскольку при комплексном загрязнении природных сред нефтью, нефтепродуктами и радионуклидами высока вероятность проявления различного воздействия (синергизм, антагонизм) экотоксикантов на почвенную биоту и показатели биологической активности почв. В связи с этим цель наших исследований — оценка изменений микробного сообщества и биологической активности почв при сочетанном загрязнении почвы техногенными радионуклидами (137Cs) и нефтепродуктами.
Объекты и методы исследования
Оценку микробной трансформации азота и углерода в условиях сочетанного нефтяного и радиоактивного загрязнения почв проводили на основании модельных экспериментов: в природных биогеоценозах с разным уровнем радиоактивного загрязнения оценивали радиоэкологическую обстановку и отбирали почвенные образцы; впоследствии в лабораторных условиях моделировали ситуации сочетанного загрязнения почв радионуклидами и нефтепродуктами (НП).
Исследования проводили в 2007 г. в Брянской обл. на контрольных участках лесных экосистем c разным уровнем радиоактивного загрязнения.
Участок 1 заложен на территории, принятой по уровню радиоактивного загрязнения за условно фоновую (Стародубский р-н, Стародубский сельский лесхоз). По данным на 1986 г., плотность радиоактивного загрязнения почв здесь по 137Cs в среднем составляла 81,4 кБк/м2 [2, 17]. Участок расположен в посадках сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) 60-летнего возраста, почва — подзол песчаный на флювиогляциальных отложениях.
Участок 2 заложен на территории, подвергшейся наиболее сильному радиоактивному загрязнению в результате аварии на ЧАЭС (Красногорский р-н, Красногорское лесничество). По данным на 1986 г., плотность радиоактивного загрязнения почв данного участка по 137Cs составляла более 1480 кБк/м2 [2]. Фи-тоценотические условия аналогичны участку 1 — сос-няк-зеленомошник 60-летнего возраста на подзоле песчаном на флювиогляциальных отложениях.
Для характеристики радиационной обстановки на участках измеряли мощность экспозиционной дозы (МЭД) гамма-излучения радиометром ДРГ-01Т в 10-кратной повторности на поверхности почвы и высоте 1 м. Для определения удельной активности почв по 137Cs и постановки модельного эксперимента закладывали почвенные разрезы, из которых равномерно по всей толще гумусо-аккумулятивного горизонта отбирали образцы массой 5 кг, что обес-
печивало проведение модельного эксперимента в разных вариантах и необходимой повторности. Для более детальной характеристики плотности радиоактивного загрязнения и вертикальной миграции техногенных радионуклидов (137С8) в почвах отбирали пробы и в микропрофилях по отдельным 0—1 (2—5)-сантиметровым слоям до глубины значимого проникновения радионуклида. Образцы почв высушивали на воздухе и тщательно размалывали до гомогенной массы. Удельную активность 137С8 определяли на сцинтилляционном гамма-спектрометре с МаЬдетектором. Амплитудный спектр импульсов обрабатывали с помощью программы ПРОГРЕСС. Относительная погрешность определения радионуклидов составляла 10—25%.
Для постановки модельного эксперимента по определению показателей биологической активности и характеристики микробного сообщества в условиях сочетанного нефтяного и радиоактивного загрязнения образцы почв высушивали при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния, тщательно перемешивали, выбирали из них растительные остатки и примеси. Из подготовленного таким образом материала отбирали по три пробы массой 100 г, каждую помещали в стеклянные флаконы емкостью 500 мл и имитировали различные сочетания нефтяного и радиоактивного загрязнения по схеме, представленной в табл. 1.
В качестве загрязнителя выбрали дизельное топливо (ДТ) — нефтепродукт, наиболее приближенный по составу к сырой нефти.
В пробах (повторность опыта 3-кратная) измеряли уровень базального дыхания, азотфиксации и денит-рификации почв по стандартным методикам [10]. Отбор проб для определения этих показателей биологической активности проводили по стандартным методикам через 1, 10, 20, 30 дней после начала эксперимента [10, 15].
Для характеристики микробного сообщества применяли метод газовой хроматографии масс-спектро-метрии (ГХ-МС) [15].
Таблица 1
Схема постановки модельного эксперимента по имитации радиоактивного и нефтяного загрязнения
Результаты и обсуждение
Натурные наблюдения показали, что радиоэкологическая обстановка в лесных экосистемах, где расположены исследуемые участки, разная. Так, в лесных экосистемах Страродубского лесхоза (уч. 1) значения МЭД в зависимости от топографических условий местности варьируют от 0,009 до 0,013 мР/ч, что находится в диапазоне колебаний естественного фона. При этом средние значения МЭД на поверхности почвы и высоте 1 м значимо не различаются (табл. 2). В то же время в радиоактивно загрязненных лесных экосистемах Красногорского лесничества (уч. 2) показатели МЭД закономерно выше и значимо различаются на поверхности почвы и на высоте 1 м. Естественная радиоактивность здесь превышает фоновый уровень почти в 40 раз.
Отмеченные различия в величинах МЭД связаны с разной плотностью загрязнения почв исследуемых участков. По средним показателям плотность загрязнения почв по 137С8 территории Красногорского лесничества (уч. 2) (данные 2007 г.) составляет 5395,51, Стародубского лесхоза (данные 2006 г.) — 3,33 кБк/м2 [14].
Гамма-спектрометрический анализ проб выявил присутствие в почвах лесных экосистем на диагностируемом уровне такие радионуклида:, как 40К, 232ТИ, 22(^ и 137С8 (табл. 3). Удельная активность естественных радионуклидов в почвах и фоновых (уч. 1), и загрязненных (уч. 2) территорий в целом невелика и находится на уровне их фоновых среднемировых концентраций [4]. Основным дозообразующим радионуклидом здесь является 137С8, его удельная активность в среднем составляет 0,182 (уч. 1— фоновый уровень) и 12,72 (уч. 2) кБк/кг.
Вместе с тем при оценке радиоэкологической обстановки и для постановки модельного эксперимента важное значение имеют особенности распределения
Вариант опыта, участок Имитация нефтяного загрязнения Тип пробы
1 — уч.1 (фоновый) 60% ПВ контроль
2 —уч.2 (радиоактивно загрязненный)
3 —уч.1 (фоновый) 60% ПВ + 5 мл ДТ/ 100 г почвы зона стресса
4 —уч.2 (радиоактивно загрязненный)
5 —уч.1 (фоновый) 60% ПВ + 30 мл ДТ/ 100 г почвы зона гибели
6 —уч.2 (радиоактивно загрязненный)
Таблица 2
Мощность экспозиционной дозы (МЭД) гамма-излучения, мР/ч (п = 10)
Место обследования На поверхности На высоте 1 м
Участок 1 (сосняк) 0,014 0,011
Участок 2 (сосняк) 0,433 0,302
Таблица 3 Средние показатели содержания радионуклидов в гумусо-аккумулятивном (0—5) слое почв, Бк/кг
Место обследования Техногенные радионуклиды Естественные радионуклиды
137Св 40К 232ТИ 226Яа
Участок 1 182 96 0,7 11
Участок 2 12720 287 28 —
137Cs в почве. При первичных радиоактивных выпадениях данный радионуклид сначала аккумулируется в верхних органогенных горизонтах [1, 17, 19]. В настоящее время, как свидетельствуют результаты наших исследований, абсолютный максимум активности в почвах уч. 2 находится в гумифицированном подгори-зонте подстилки и 0—5-сантиметровом минеральном слое (рис. 1). Это говорит о том, что загрязнение использованных нами в модельном эксперименте образцов 0—5-сантиметрового гумусо-аккумуля-тивного слоя обеспечивает создание максимальных нагрузок на микробное сообщество, обусловленное в основном 137Cs.
Проведенные нами ранее исследования различных показателей биологической активности почв в условиях максимальных радиационных нагрузок при варьировании уровня удельной активности почв по 13^ от 15 до 70 кБк/кг (V = 40%) показали, что радиоактивное загрязнение почв в наибольшей степени сказывается на таких показателях биологической активности, как интенсивность дыхания, процессы азотфиксации и денитрификации. Рост удельной активности почв по 13^ в исследуемых интервалах приводит к усилению интенсивности дыхания примерно на 30%, а также к увеличению активности азот-фиксации и денитрификации [16]. На наш взгляд, это обусловлено гибелью нерезистентной части микробной биомассы почв и развитием на продуктах лизиса устойчивых микробных популяций (фумигационный эффект). Аналогичные результаты были получены и другими исследователями при моделировании загрязнения радионуклидами почв, различных по содержанию органического вещества [18]. При этом доля N2O в газообразных продуктах денитрификации возрастает в этих условиях из-за снижения активности редуктазы закиси азота, что может сопровождаться отрицательными экологическими последствиями (аккумуляция парниковых газов). Влияние удельной активности почв по 13^ на активность метаноген-ных архебактерий незначительна, что может быть интерпретировано как их большая устойчивость к условиям повышенной радиации и УФ-излучения на начальных этапах эволюции [16].
Для более глубокого анализа полученных результатов и оценки изменения исследуемых показателей биологической активности почв нами был проведен
Рис. 1. Распределение 137Cs в микропрофиле почв уч. 2 (относительные единицы, %)
анализ микробного сообщества при различных уровнях радиоактивного загрязнения и имитировании различных вариантов нефтяного и радиоактивного загрязнения (см. раздел «Объекты и методы исследования»).
Анализ структуры микробного комплекса показал, что в условиях радиоактивного загрязнения почв (уч. 2) происходит перестройка микробного комплекса по сравнению с незагрязненными территориями (уч. 1). Так, наблюдается некоторое сокращение микробного разнообразия за счет уменьшения численности представителей родов Rhodococcus, Aeromonas, Pseudomonas, типичных для сапротрофного комплекса почв, и роста численности микобактерий, больше характерных для неблагоприятных местообитаний (пустынные и засоленные почвы).
Сопоставление структуры микробного сообщества на фоновом участке с таковой при различных уровнях нефтяного загрязнения показывает рост численности псевдомонад (Pseudomonas), родококков (Rhodococcus) и представителей рода Aeromonas, т.е. преимущественно тех бактерий, которые способны к деструкции углеводородов. Обращает на себя внимание значительное увеличение биомассы грибов, что, по нашему мнению, можно объяснить их интенсивным развитием на продуктах лизиса микробной биомассы, не принимающей участия в разложении углеводородов дизельного топлива. Это актинобак-терии Sphingobacterium spiritovorum, коринебактерии (Corynebacterium) и цитофаги (Cytophaga), обладающие высокой целлюлолитической активностью, с деятельностью которых связывают разложение целлюлозы в почве [3, 11]. Дальнейшее увеличение концентрации ДТ приводит к значительному снижению численности микроорганизмов, что соответствует зоне гибели.
В условиях радиоактивного загрязнения добавление в почву ДТ также сопровождается ростом численности микроорганизмов, разлагающих углеводороды. Важно отметить, что с ростом дозы ДТ увеличивается численность псевдомонад (Pseudomonas), родококков (Rhodococcus), Aeromonas, т.е. представителей именно тех бактерий, которые были угнетены при радиоактивном загрязнении почв. Таким образом, можно заключить, что внесение ДТ (и, вероятно, других доступных для микробного разложения природных полимеров) в некоторой степени снимает отрицательное влияние радионуклидов на микробное сообщество, тем самым приближая почву к исходному или фоновому состоянию.
Изменения в структуре микробного комплекса, как было отмечено в наших предшествующих исследованиях и работах других авторов, сопровождаются изменением и биологической активности почвы [13, 16].
При имитировании сочетанного радиоактивного и нефтяного загрязнения влияние радионуклидов на интенсивность дыхания почвы прослеживается во всех вариантах опыта и во все сроки наблюдения (рис. 2).
120
1 2 3 4 5 6 Вариант опыта
И 1-е сут. Ш8 Ю-е сут.
^20-е сут. Щ 30-е сут.
Рис. 2. Интенсивность дыхания почвы в различных вариантах опыта. (Условные обозначения здесь и на рис. 3 и 4.)
Вопреки ожидаемому эффекту снижения показателей биологической активности при сочетании разных типов поллютантов оказалось, что при внесении ДТ в почву, загрязненную радионуклидами (варианты опыта 3 и 4), отмечается возрастание интенсивности дыхания, а дальнейшее увеличение его концентрации приводит к резкому снижению этого процесса. Важно отметить, что в данных условиях наблюдается возрастание потока СО2 в варианте 6 (радиоактивное загрязнение + 30 мл ДТ/100 г почвы), что подтверждает сделанный ранее вывод о том, что при внесении доступного для микробного окисления ДТ негативное воздействие радионуклидов на микробное сообщество почвы в определенной степени нивелируется.
Исследование цикла азота в условиях модельного эксперимента показало, что активность азотфиксации слабо меняется в присутствии радионуклидов (рис. 3), однако внесение ДТ до 5 мл /100 г почвы приводит к ее росту. Дальнейшее увеличение концентрации подавляет процесс азотфиксации пропорционально по-
1 2 3 4 5 6 Вариант опыта
Рис. 3. Азотфиксирующая активность почвы в различных вариантах опыта
вышению степени загрязнения почвы ДТ. Активность азотфиксации так же, как интенсивность дыхания, возрастает в вариантах с радиоактивно загрязненными образцами на фоне максимальной дозы ДТ.
В условиях модельного эксперимента показано, что с ростом дозы ДТ до 5 мл /100 г почвы наблюдается активный процесс денитрификации по сравнению с фоном и вариантом с радиоактивно загрязненным образцом (варианты опыта 1 и 2). Это обусловлено совпадением оптимальных условий для функционирования нитрогеназы и ферментов анаэробного нитратного дыхания (денитрификации).
Характер динамики денитрифицирующей активности почвы (рис. 4) совпадает с изменением нитрогеназной активности почвы под воздействием поллютантов в различных дозах.
Выводы
• В условиях радиоактивного загрязнения отмечается изменение всех показателей биологической активности почвы (интенсивности дыхания, активности азотфиксации и денитрификации), а также структуры микробного сообщества. Наблюдается общее снижение численности представителей родов Pseudomonas, Rhodococcus, Aeromonas, наиболее чувствительных к радиоактивному загрязнению, и возрастание численности микобактерий.
• Загрязнение почв дизельным топливом в небольших концентрациях (5 мл/100 г почвы) сопровождается возрастанием численности углеводородокис-ляющих микроорганизмов и приводит к усилению интенсивности дыхания, азотфиксирующей и денитрифицирующей активности почвы. Значительное превышение этой дозы (30 мл/100 г почвы) приводит к сокращению численности непрофилированной части микробного сообщества (гибели целлюлолитических бактерий) и, как следствие, снижению всех показателей биологической активности.
• Сочетанное загрязнение почв нефтепродуктами (дизельное топливо) и радионуклидами приводит к
35
1 2 3 4 5 6 Вариант опыта
Рис. 4. Денитрифицирующая способность почвы в различных вариантах опыта
уменьшению негативного воздействия последних на микробный пул и способствует возвращению микробного сообщества ближе к исходному (фоновому) состоянию как по структуре микробного комплекса, так и по уровню биологической активности. Такой
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алексахин Р.М., Нарышкин МЛ. Миграция радионуклидов в лесных биогеоценозах. М., 1977.
2. Атлас загрязнения Европы цезием после чернобыльской аварии. М., 1998.
3. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М., 1989.
4. Вернадский В.И. Очерки по геохимии. М., 1934.
5. Деградация и охрана почв / Под ред. Г.В. Добровольского. М., 2002.
6. Денисова Т.В., Казеев К.Ш. Устойчивость микроорганизмов и биологической активности чернозема к ионизирующему излучению. Ростов н/Д, 2007.
7. Ефремов А.Л. Биологическая активность и динамика разложения аппликационных материалов в почвах лесных биогеоценозов в связи с их радионуклидным загрязнением // Почвоведение. 1999. № 10.
8. Ефремов А.Л. Динамика почвенной микрофлоры и микробных метаболитов в условиях радиоактивного загрязнения // Радиоактивность при ядерных взрывах и авариях: Тез. докл. Междунар. конф. СПб., 2006.
9. Кураков А.В., Ильинский В.В., Котоелевцев С.В., Садчиков А.П. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяном загрязнении. М., 2006.
10. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1991.
11. Микроорганизмы и охрана почв / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1989.
12. Новоселова Е.И. Экологические аспекты трансформации ферментного пула почвы при нефтяном загрязнении и рекультивации: Дис. ... докт. биол. наук. Уфа, 2008.
механизм воздействия, вероятно, можно рассматривать как подтверждение известного в микробной экологии принципа «дублирования», определяющего устойчивость микробной системы почв к неблагоприятным воздействиям.
13. Павлова Н.Н., Егорова Е.И. Изучение корреляционной зависимости между содержанием в почве Cd, Pb, Cu, 232Th, 137Cs, 40K и биологической активностью почв // Экология и биология почв: Мат-лы Междунар. науч. конф. Ростов н/Д, 2007.
14. Прудников П.В., Карпеченко С.В.. Новиков А.А., Поликарпов Н.Г. Агрохимическое и агроэкологическое состояние почв Брянской области. Брянск, 2007.
15. Степанов А.Л, Лысак Л.В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии: Учеб.-метод. пособие. М., 2002.
16. Цветнова О.Б., Паников С.Н., Степанов А.Л. Биологическая активность почв сосновых фитоценозов Брянского Полесья в условиях радиоактивного загрязнения // Актуальные проблемы лесного комплекса. Труды БГИТА. Вып. 21. Брянск, 2008.
17. Щеглов А.И., Цветнова О.Б. Пространственное распределение радионуклидов и тяжелых металлов в лесных почвах Брянского Полесья // Там же. Вып. 9. Брянск, 2004.
18. Austin E.E., Castro H.F., Sides K.E., et al. Assessment of 10 years of CO2 fumigation on soil microbial communities and function in a sweet gum plantation // Soil Biol. and Biochem., 2009. Vol. 41. Is. 3.
19. Shcheglov F.I., Tsvetnova O.B., Klyashtorin A.L. Bio-geochemical migration of technogenic radionuclides in forest ecosystems. Moscow, 2001.
Поступила в редакцию 28.02.2009
ESTIMATION OF MICROBIAL TRANSFORMATION OF NITROGEN AND CARBON COMPOUNDS UNDER INFLUENCE OF PETROL AND RADIOACTIVE POLLUTIONS
A.L. Stepanov, O.B. Tsvetnova, S.N. Panikov
In a series of fields experiments with radioactive polluted soils of Bryansk region it was found peculiarities of changes in some parameters of soil biological activities (respiration rate, denitrifying and N2-fixing activities) and in the structure of soil microbial communities. In a series of model experiments carried out an investigation of the processes of microbial nitrogen and carbon transformation under simultaneous by petrol and radioactive pollutions.
Key words: 137Cs, petrol pollution, soil biological activity, microbial transformation
Сведения об авторах
Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв; тел.: 8 495 93934-05, e-mail: [email protected]. Цветнова Ольга Борисовна, канд. биол. наук, науч. сотр. каф. радиоэкологии и экотоксикологии; тел.: 8 495 939-22-11. e-mail: [email protected]. Паников Сергей Николаевич, студент 5 курса каф. радиоэкологии и экотоксикологии; тел.: 8 495 93922-11, e-mail: [email protected]
