CC BY
68
УДК 579.26
Е.В. Пименова
Пермская государственная сельскохозяйственная академия
Г.А. Козлова, М.В. Буркова
Пермский национальный исследовательский политехнический университет
ОЦЕНКА МИКРОБНОЙ ДЕТОКСИКАЦИИ ГЕРБИЦИДА ТОРНАДО НА ОСНОВЕ ГЛИФОСАТА МЕТОДОМ ФИТОТЕСТИРОВАНИЯ
Исследована способность ряда штаммов бактерий к биодеструкции препарата торнадо - гербицида на основе глифосата, проведена оценка детоксикации среды в ходе роста микроорганизмов методом фитотестирования.
Одним из важных элементов интенсивных технологий, без которых невозможно получение высоких и стабильных урожаев практически ни одной сельскохозяйственной культуры, являются пестициды [1].
Препараты на основе глифосата (К-фосфонометилглицин) более 30 лет применяются как высокоэффективные малотоксичные гербициды общеистребительного действия. Однако в последние годы применение глифосата вызывает обоснованную тревогу у экологов, что обусловлено противоречивостью данных о влиянии данного соединения на все компоненты, а также об его устойчивости в почве.
Глифосат является активным компонентом различных препаративных форм, таких как раундап, торнадо, глиалка, глипер, глисол, гли-тан, глифопин, глифоген, глицел, граунд, мамба, нитосорг, свип, утал, форсат, фосулен, цидокор, ураган форте и др., выпускаемых многими отечественными и зарубежными фирмами-производителями. Кроме так называемого «активного» или действующего вещества (д.в.), каждая препаративная форма пестицида содержит так называемые инертные ингредиенты, которые нужны для облегчения использования продукта и увеличения его эффективности. Так, раунадап, кроме основного действующего вещества - глифосата, содержит десять инертных компо-
нентов. Независимые исследования, проведенные в ряде европейских стран, Японии и США, показали, что из-за «инертных» компонентов формула раундапа более токсична, чем сам глифосат [2].
В связи с этим возникает все более острая необходимость учета негативных экологических последствий антропогенной пестицидной нагрузки на биосферу [3]. При этом определение остаточных количеств действующих веществ и их метаболитов, а также инертных компонентов химическими и физико-химическими методами очень сложно и связано с использованием дорогостоящей аппаратуры.
В последние годы для оценки интегральной токсичности различных объектов окружающей среды используется более доступный, простой и быстрый метод - биотестирование. Так, для оценки токсичности почвы, загрязненной глифосатом, после проведения ее биоремедиации, были использованы такие показатели, как фитотоксичность в отношении овса, токсичность по отношению к дафниям, дегидрогеназная активность [4].
Цель данной работы - исследование биодеструкции гербицида торнадо на основе глифосата путем оценки изменения токсичности среды в ходе роста микроорганизмов методом фитотестирования в лабораторных условиях.
Материалы и методы исследования. Объектом исследований служили 5 изолятов бактерий, ранее выделенных из почвы поля Пермской ГСХА, подвергавшейся воздействию пестицидов, и сохранивших способность к росту на среде с гербицидом после продолжительного хранения под слоем вазелинового масла.
Культуры выращивали на ацетатно-минеральной среде в колбах объемом 250 мл на качалке при 30 °С и 140 об/мин на синтетической минеральной среде следующего состава, г/л: NH4NO3 - 2; MgSO4 • 7 H2O -
0,2; Na2CO3 - 0,1; CaCl2 • 7 H2O - 0,01 г. К 100 мл основной среды стерильно добавляли 5 мл буферного раствора, г/л: KH2PO4 - 2; Na2HPO4 - 3; и 0,1 мл раствора микроэлементов по Пфенингу [5]. Источник углерода -коммерческий препарат торнадо с содержанием глифосата 360 мг/мл -вносили в концентрациях, указанных ниже, в отсутствие и в присутствии дополнительного субстрата - ацетата натрия.
Интенсивность роста определялась по величине оптической плотности исследуемого раствора на КФК-2 (À, = 670 нм, толщина слоя 5 мм, раствор сравнения - ацетатно-минеральная среда без добавления гербицида).
В качестве фитотест-объекта для оценки интегральной токсичности среды и процесса деградации пестицида использовали редис сорта Красный с белым кончиком. Семена редиса - перспективный биотест, удовле-
творяющий основным требованиям к биотестам - сильная энергия прорастания семян и высокая чувствительность к токсическим веществам.
Интегральную токсичность среды, загрязненной глифосатом, до и после культивирования штамма бактерий, оценивали по изменению всхожести семян редиса на третьи сутки и средней длине корней проростков [6].
Отбирались семена, близкие по величине и цвету. Отобранные семена раскладывались в стерильные чашки Петри с кружками фильтровальной бумаги или соприкасающимися ватными дисками, в которые вносили по 10 мл анализируемой пробы (чашки Петри стерилизовались в сушильном шкафу при температуре +120 °С в течение 2 ч). В каждую чашку помещались 50 семян тремя пропорциями по 10 семян, которые равномерно распределялись по поверхности чашки. Контролем служили семена, замоченные в том же объеме стерильной водопроводной воды или питательной среды без источника углерода. Эксперименты проводились при комнатной температуре.
Повторность опытов 4-кратная. Результаты обрабатывались с помощью программы Excel, рассчитывалась наименьшая существенная разница при уровне вероятности 0,95 (НСР05) по методике Доспехова [7].
Результаты и их обсуждение. Первоначально была определена токсичность растворов гербицида с концентрацией от 1 до 100 мг/л на минеральной основе в присутствии ацетата натрия (табл. 1, рисунок).
Данные по определению фитотоксичности препарата в интервале концентраций от 1 до 100 мг/л по д.в. свидетельствуют о том, что самая малая концентрация гербицида (1 мг/л) на всхожесть семян практически не влияет, но значительно снижает длину корней проростков редиса. Концентрации, начиная с 10 мг/л, оказывают сильное математически доказанное ингибирующее действие и влияют как на прорастание семян, так и на длину корней проростков редиса, что подтверждает гербицидные свойства глифосата, т.е. его токсичность в отношении растений.
Таблица 1
Зависимость всхожести семян и длины корней редиса от концентрации глифосата
Концентрация гербицида, мг/л Всхожесть, % Длина корней, см
1 96,3±2,7 1,15±0,18
10 79,5±6,2 0,73±0,07
50 17,5±4,7 0,43±0,07
100 9,0±3,0 0,3±0,18
Контроль 96,5±2,70 1,93±0,22
НСР05 5,70 0,18
а
б
Рис. Всхожесть семян: а - без гербицида; б - концентрация гербицида 100 мг/л
После проведения скрининга штаммов микроорганизмов, выделенных ранее с территории, обработанной пестицидами, был выбран наиболее активный штамм-деструктор глифосатсодержащих пестицидов -М3 (при концентрации торнадо в среде 50 мг/л по д.в., удельная скорость роста 0,139 г/л-ч), с которым проводились дальнейшие исследования. В результате оценки влияния различных доз гербицида (10, 50 и 90 мг/л) на динамику роста культуры М3 на среде с ацетатом обнаружено, что величина удельной скорости роста микроорганизмов существенно уменьшается и через трое суток составляет, соответственно, 84, 65 и 54 % по отношению к контролю (среда без гербицида).
Определение деструкционной способности штамма М3 через сутки и трое суток роста на среде с торнадо (50 мг/л по д.в.) без дополнительного источника углерода показало значительное снижение фитотоксичности культуральной жидкости. Уже через сутки роста микроорганизмов всхожесть семян редиса в культуральной жидкости увеличилась с 17,5 до 75,5 %, а длина корней проростков с 0,43 до 0,88 см, а через трое суток наблюдалось практически полное отсутствие токсичности среды: всхожесть увеличилась до 95,5 %, а длина корней проростков до 1,58 см (табл. 2).
Таким образом, биотест выявил, что даже малые концентрации торнадо оказывают отрицательное влияние на длину корней проростков редиса по отношению к контролю, что является показателем токсичности при применении химических средств защиты растений. Штамм бактерий, использованный в работе, в процессе своего роста способен снизить фитотоксичность среды.
Таблица 2
Изменение токсичности среды в процессе роста культуры М3
Время культивирования Среда с пестицидом (без ацетата) Среда с пестицидом (c ацетатом)
всхожесть, % длина корней, см всхожесть, % длина корней, см
1 сут 75,5±2,65 0,88±0,13 22±3,92 0,4±0,11
3 сут 95,5±2,65 1,58±0,13 35±3,58 0,6±0,16
Контроль 96,2±1,75 1,82±0,28 96,5±2,70 1,93±0,22
Следует также отметить, что при выращивании на ацетатноминеральной среде с внесением гербицида в той же концентрации снижение токсичности по сравнению со средой без ацетата происходит намного медленнее, что может объясняться тем, что изначально микроорганизмы используют ацетат в качестве источника углерода и энергии и только затем глифосат.
Список литературы
1. Круглов Ю.В. Микрофлора почвы и пестициды. - М.: Агро-промиздат, 1991. - 128 с.
2. Микробные биотехнологии ремедиации почв, загрязненных фос-форорганическими пестицидами // Коммерческая биотехнология: интернет-журнал. - URL: http: //www.cbio.ru/modules/news/print.php?storyid=3381.
3. Лозановская И.Н., Орлов Д.С., Садовникова Л.К. Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении. - М.: Высшая школа, 1998. - 287 с.
4. Ермакова И.Т., Шушкова Т.В., Леонтьевский А.А. Микробная деструкция органофосфатов почвенными бактериями // Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 5. - С. 689-695.
5. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. - М.: Наука, 1989. - 228 с.
6. Определение суммарной токсичности почвы, корневой системы и конечной продукции при применении химических средств защиты растений: методика и результаты / В.Г. Минеев, Е.Х. Ремпе, Л.П. Воронина, Л.В. Коваленко // Вестн. сельскохоз. науки. - 1991. - № 6. - С. 63-71.
7. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта: (С основами статистической обработки результатов исследований). - М.: Колос, 1979. - 416 с.
Получено 2.06.2011
