CC BY
32
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ LABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIES
DOI: 10.21294/1814-4861-2020-19-2-49-61 УДК: 616.19-006.6+577.112+57.088.2
Для цитирования: Тутанов О.С., Бакакина Ю.С., Проскура К.В., Гоигорьева А.E., Сяхович В.Э., Беляев С.А., Рябчикова Е.И., Центалович Ю.П., Лактионов П.П., Тамкович С.Н. Поиск протеомных маркеров рака молочной железы в составе суммарных экзосом крови. Сибирский онкологический журнал. 2020; 19(2): 49-61. - doi: 10.21294/18144861-2020-19-2-49-61.
For citation: Tutanov O.S., Bakakina Y.S., Proskura K.V., Grigoryeva А.E., Syakhovich V.E., Beliaev S.A., Ryabchikova E.I., Tsentalovich Y.P., Laktionov P.P., Tamkovich S.N. Search for breast cancer proteomic markers in total blood exosomes. Siberian Journal of Oncology. 2020; 19(2): 49-61. - doi: 10.21294/1814-4861-2020-19-2-49-61.
ПОИСК ПРОТЕОМНЫХ МАРКЕРОВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В СОСТАВЕ СУММАРНЫХ ЭКЗОСОМ КРОВИ
О.С. Тутанов1, Ю.С. Бакакина23, К.В. Проскура14, Ä.E. Григорьева1, В.Э. Сяхович2, С.А. Беляев2, Е.И. Рябчикова16, Ю.П. Центалович5, П.П. Лактионов1, С.Н. Тамкович16
ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук, г Новосибирск, Россия1
Россия, 630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8. E-mail: s.tamk@niboch.nsc.ru1
УЗ «Национальная антидопинговая лаборатория», Минский район, аг. Лесной, Республика Беларусь2
Республика Беларусь, 223040, Минский район, аг Лесной, 312
Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси, г. Минск, Республика Беларусь3
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 273
ГБУЗ Новосибирской области «Новосибирский областной клинический онкологический диспансер», г. Новосибирск, Россия4
Россия, 630108, г. Новосибирск, ул. Плахотного, 24
ФГБУН Институт «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской
академии наук, г. Новосибирск, Россия5
Россия, 630090, г. Новосибирск, ул. Институтская, 35
ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», г. Новосибирск, Россия6
Россия, 630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 26
Аннотация
Актуальность. Актуальной задачей повышения эффективности ранней диагностики онкологических заболеваний является поиск высокоспецифичных опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма. Значительная часть экзосом ассоциирована с поверхностью форменных элементов крови, однако белковый спектр таких экзосом ранее не исследовался. Использование суммарных экзосом крови (экзосом плазмы и экзосом, ассоциированных с поверхностью клеток крови) может не только значительно повысить специфичность и чувствительность существующих методов, но и выявить новые онкомаркеры для жидкостной биопсии. Цель работы - поиск кандидатных белковых онкомаркеров рака молочной железы (РМЖ) путем сравнения 20-протеомных карт суммарных экзосом крови здоровых женщин и больных РМЖ. Материал и методы. Экзосомы выделены из крови здоровых женщин и больных РМЖ методом ультрафильтрации с последующим ультрацентрифугированием и охарактеризованы при помощи трансмиссионной электронной микроскопии и иммуноцитохимии. Концентрацию белка в экзосомах определяли при помощи коммерческого набора NanoOrange Protein Quantitation kit (Invitrogen). Протеом экзосом исследован с помощью 20-электрофореза с последующей идентификацией белков методом масс-спектрометрии. Результаты. Получены высокоочищенные препараты микровезикул суммарной крови размером не более 100 нм, на поверхности которых иммуноцитохи-мически были выявлены специфические для экзосом маркеры (CD63, CD9 и CD24). Сравнительный анализ протеомных карт экзосомальных белков здоровых женщин и больных РМЖ, полученных с помощью 2D-электрофореза, позволил установить значимые различия в уровне экспрессии и наборе белков в норме и патологии. Методом пептидного фингерпринта идентифицировано 11 перспективных протеомных маркеров РМЖ, из них LRG и у-цепь FGB выявлены в составе экзосом впервые (согласно
Тамкович Светлана Николаевна, s.tamk@niboch.nsc.ru СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2020; 19(2): 49-61
базе Ехоса|1а). Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии идентифицировано 99 белков в препаратах экзосом крови здоровых женщин и больных РМЖ, из них 35 % выявлены в составе экзосом впервые (согласно базе Ехоса|1а). В составе суммарных экзосом крови онкологических больных выявлено 17 (53 %) белков, ассоциированных с РМЖ. Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что суммарные экзосомы крови являются перспективным источником диагностического материала для поиска протеомных маркеров РМЖ. Идентифицированные протеомные онкомаркеры в их составе требуют дальнейшей валидации.
Ключевые слова: экзосомы, трансмиссионная электронная микроскопия, масс-спектрометрия, протеомные маркеры, рак молочной железы.
SEARCH FOR BREAST CANCER PROTEOMIC MARKERS IN TOTAL BLOOD EXOSOMES
O.S. Tutanov1, Y.S. Bakakina23, K.V. Proskura14, А.E. Grigoryeva1, V.E. Syakhovich2, S.A. Beliaev2, E.I. Ryabchikova16, Y.P. Tsentalovich5, P.P. Laktionov1, S.N. Tamkovich16
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia1
8, Lavrentiev Ave., Novosibirsk, 630090, Russia. E-mail: s.tamk@niboch.nsc.ru1 National Anti-Doping Laboratory, Minsk reg., Belarus2 31, Lesnoy str., Minsk reg., 223040, Belarus2
Institute of Biophysics and Cell Engineering, National Academy of Sciences of Belarus, Minsk, Belarus3
27, Academicheskaya str., Minsk, 220072, Belarus3
Novosibirsk Regional Oncological Dispensary, Novosibirsk, Russia4
2, Plakhotnogo str., Novosibirsk, 630108, Russia4
Institute «International Tomografic Center», Novosibirsk, Russia5
3, Institutskaya str., Novosibirsk, 630090, Russia5 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia6 2, Pirogova str., Novosibirsk, 630090, Russia6
Abstract
To improve early detection of cancer, search for tumor markers in biological fluids is of great importance. A significant portion of exosomes is associated with the surface of blood cells, however, the protein spectrum of such exosomes has not been previously studied. The use of total blood exosomes (plasma exosomes and exosomes associated with the surface of blood cells) can not only significantly increase the specificity and sensitivity of existing methods, but also suggest new tumor markers for liquid biopsy. Objective. Search for candidate protein tumor markers of breast cancer by comparing 2D-proteomic maps of total blood exosomes of healthy females (HFs) and breast cancer patients (BCPs). Methods. Exosomes were isolated from plasma and total blood of HFs and BCPs by ultrafiltration followed by ultracentrifugation and were characterized using transmission electron microscopy (TEM) and immunocytochemistry. Protein concentration in exosomes was determined using the NanoOrange Protein Quantitation kit (Invitrogen) commercial kit. Proteomes of exosomes were studied using 2D electrophoresis followed by protein identification by mass spectrometry. Results. Highly purified samples of vesicles from plasma and total blood of no more than 100 nm in size were obtained, on the surface of which markers specific for exosomes were detected by monoclonal antibodies CD9. A comparative analysis of the proteomic maps of exosomal proteins of the HFs and BCPs obtained by 2D-electrophoresis allowed us to establish significant differences in the expression level and protein set in normal and pathological conditions. The 11 proteomic markers of breast cancer were identified by the peptide fingerprint method, of which LRG u y-chain FGB were detected in the composition of exosomes for the first time (according to the Exocarta database). Using MALDI-TOF mass spectrometry, 99 proteins were identified in the exosome preparations of the blood of HFs and BCPs, of which 35% were detected in the composition of the exosomes for the first time (according to the Exocarta database). 17 (53%) proteins associated with breast cancer were detected in total blood exosomes of cancer patients. Conclusion. The results obtained indicate that total blood exosomes are a promising source of diagnostic material for the search for proteomic markers of breast cancer. The identified proteomic tumor markers require further validation.
Key words: exosomes, transmission electron microscopy, mass-spectrometry, proteomic markers, breast cancer.
Введение
Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди онкологических заболеваний женщин. Заболеваемость и смертность от него продолжают неуклонно возрастать во всех странах мира, в связи с чем проблема рака молочной железы приобретает социальное значение. Применение современных методов лечения позволяет в 96 % добиться 5-летней выживаемости при РМЖ I стадии [1]. Однако у значительного числа больных диагностируется распространенный рак молочной железы. В ряде исследований продемонстрирована эффективность маммографии при раннем выявлении РМЖ, однако критики метода указывают на высокую частоту ложнонегативных и ложнопози-тивных результатов [1]. Таким образом, актуальной проблемой молекулярной медицины является разработка раннего неинвазивного диагностического метода, обеспечивающего выявление РМЖ на асимптоматичной стадии.
В настоящее время ведутся разработки новых методов ранней диагностики рака, в том числе на основе анализа содержимого циркулирующих в крови экзосом [2]. К экзосомам относят внеклеточные везикулы диаметром 30-100 нм, секрети-руемые различными клетками во внеклеточное пространство [3]. В биологических жидкостях экзосомы являются стабильными структурами, при этом они несут уникальные белковые маркеры продуцирующих их клеток [2, 3], что определяет интерес к этим везикулам как к источнику диагностической информации [2, 4]. Действительно, анализ белкового состава циркулирующих в крови онкологических больных экзосом является перспективным направлением поиска опухоле-специфических маркеров злокачественных новообразований [5]. Несомненным преимуществом исследования протеома экзосом является возможность удалить мажорные белки плазмы крови и повысить концентрацию опухолеспецифических белков, в том числе и мембранных. Белки экзосом составляют менее 0,01 % общего протеома плазмы [6], и этого достаточно как для составления протеомных карт, так и для идентификации эк-зосомальных протеомных маркеров при помощи масс-спектрометрии.
Поскольку ранее было показано, что для осуществления межклеточной коммуникации экзо-сомы связываются с поверхностью клеток [7], мы предположили, что экзосомы могут быть связаны и с форменными элементами крови. Действительно, в пилотном исследовании нами получены данные о наличии экзосом на поверхности форменных элементов крови [8].
Целью исследования явился поиск канди-датных белковых онкомаркеров рака молочной железы путем сравнения 2D-протеомных карт суммарных экзосом крови здоровых женщин и больных РМЖ.
Материал и методы
Образцы крови 6 здоровых женщин, средний возраст 44 ± 4 года, были получены из Центральной клинической больницы СО РАН и 8 первичных больных РМЖ T1-2N0M0 - из Новосибирского областного онкологического диспансера (табл. 1). Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан. Образцы крови после забора путем венепункции в вакутейнеры, содержащие K3EDTA, хранили при 4 °C и обрабатывали в течение ближайшего часа.
Суммарные экзосомы выделяли из крови здоровых женщин и больных РМЖ путем ультрафильтрации с последующим ультрацентрифугированием. В частности, к образцу крови объемом 4,5 мл добавляли равный объем буфера, элюирую-щий экзосомы, ассоциированные с форменными элементами [9], и инкубировали на ротационной мешалке 10 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Форменные элементы осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 290 g и 4 °C, супернатант повторно центрифугировали в течение 20 мин при 1 200 g и 4 °C. Для удаления клеточного дебриса образцы плазмы центрифугировали при 17 000 g 4°C в течение 20 мин. Для удаления везикул размером более 100 нм супернатант разводили в 3 раза фосфатно-солевым буфером (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, рН 7,5) (ФБ) и фильтровали через фильтр с диаметром пор 100 нм (Minisart high flow, 16553-K, Sartorius). Экзосомы осаждали ультрацентрифугированием (100 000 g, 90 мин, 4 °C), осадок ресуспендировали в 10 мл ФБ и дважды ультрацентрифугировали при тех же условиях. Экзосомы ресуспендировали в 200 мкл ФБ, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 °С.
Для негативного контрастирования экзосомы сорбировали на медные сетки с формваровой подложкой, стабилизованной углеродом, в течение
1 мин и 10 сек контрастировали 2 % раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты.
Для выявления специфических маркеров к 10 мкл суспензии экзосом добавляли 10 мкл 0,5 % бычьего сывороточного альбумина в ФБ, вносили по 3 мкл (100 мкг/мл) моноклональных антител к рецептору CD9 (Abcam) и инкубировали в течение 18 ч на шейкере Elpan 358S, затем сорбировали на сетки. Далее сетки промывали ФБ и инкубировали
2 ч с конъюгатом белка А и наночастиц золота во влажной камере при комнатной температуре, затем промывали ФБ в течение 2 мин и контрастировали фосфорно-вольфрамовой кислотой в течение 10 сек.
Подготовленные сетки изучали в просвечивающем электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Japan) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Изображения получали с помощью цифровой фотока-
меры Veleta (ЕМ SIS, Germany). Размеры структур измеряли на мониторе цифровой фотокамеры с помощью программы iTEM (ЕМ SIS, Germany).
Для оценки концентрации белка экзосом использовали коммерческий набор NanoOrange Protein Quantitation kit (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя.
Для гель-электрофоретического разделения белки экзосом осаждали смесью хлороформа с метанолом (1:4). Для этого к 100 мкл экзосом добавляли 300 мкл деионизированной воды, 400 мкл метанола, 100 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и центрифугировали при 14 000 g в течение 1 мин. Затем верхнюю водно-метанольную фазу отделяли, вносили 400 мкл метанола, тщательно перемешивали и центрифугировали при 20 000 g в течение 15 мин. Осадок высушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли в буфере для 2D-электрофореза [8].
Для получения протеомных карт экзосом использовали метод 2D-электрофореза [10]. Разделение белков методом 2D-электрофореза проводили с использованием стрипов с иммобилизованным градиентом (IPG-стрипы, 7 см), pH 4-7 (Bio-Rad Laboratories, США), как было описано ранее [8]. В качестве стандартной смеси белков для определения масс и pI использовали набор маркеров для 2D-электрофореза «Markers for Two Dimensional Electrophoresis» (1789 кДа, pI-спектр 7,6-3,8, Sigma). Визуализацию белковых пятен в гелях после завершения второго направления 2D-электрофореза осуществляли методом окрашивания нитратом серебра тиосульфатом натрия [11].
Для анализа окрашенные серебром гели сканировали с разрешением 300 точек на дюйм при помощи калибровочного денситометра GS-800 (Bio-Rad Laboratories, США) и статистически анализировали c использованием программного обеспечения PDQuest (version 8.0, Bio-Rad Laboratories, США). Анализ белковых пятен состоял из следующих этапов: вычисление относительного объема белковых пятен, рассчитанного как отношение выраженной в пикселях интенсивности пятна к суммарной интенсивности всех пятен на геле; выравнивание гелей; сопоставление белковых пятен. Достоверность полученных результатов оценивали по t-критерию Стьюдента при p<0,05.
Для масс-спектрометрической идентификации белков экзосом, по которым наблюдались отличия между исследуемыми группами, проводили их подготовку: вырезание из геля, деокрашивание от нитрата серебра, восстановление дисульфидных связей в молекуле белка и алкилирование остатков цистеина, расщепление белков на пептиды трипсином непосредственно в геле, экстракция пептидов из геля, очистка от солей и детергентов и концентрирование пептидов с помощью технологии ZipTip (фирмы «Milipore», США) согласно протоколу фирмы-производителя. Раз-
деление полученных в результате триптического гидролиза пептидов проводили методом ВЭЖХ с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent 1290 Infinity LC System (фирмы «Agilent Technologies», Inc., США). Масс-спектрометрическую детекцию осуществляли на квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре высокого разрешения Agilent 6550 iFunnel Q-TOF (фирмы «Agilent Technologies», Inc., США).
Для определения первичной последовательности экзосомальных белков, препаративные количества белков разделяли при помощи 10-20 % SDS-диск электрофореза и окрашивали при помощи Кумасси R-250 (Sigma, USA). Фрагменты ПААГ, содержащие исследуемые белки, отмывали от Кумасси R-250 и SDS и подвергали трипсино-лизу, как было описано ранее [12]. Пептидные фрагменты белков экстрагировали из геля, концентрировали и обессоливали на микроколонках C18 ZipTips (фирмы «Milipore», США). Смесь пептидов элюировали с микроколонки на мишень приборной пластины насыщенным раствором матрикса.
Получение и регистрацию масс-спектров производили на тандемном времяпролетном масс-спектрометре MALDI-TOF autoflex speed series LIFT («Bruker Daltonics», ФРГ). Идентификацию белков проводили путём поиска соответствующих кандидатов в аннотированных базах данных NCBI и SwissProt с использованием программы Mascot (Matrix Science Ltd., London, www.matrixscience. com/search_form_select.html), как было описано ранее [12]. Анализ идентифицированных белков проводили по методике Q. Yang et al. [13].
Результаты
Для поиска кандидатных белковых онкомарке-ров РМЖ на первом этапе работы были сформированы группы клинически здоровых женщин и первичных больных РМЖ, выделены и охарактеризованы суммарные экзосомы крови.
Для подтверждения экзосомальной природы выделенных микровезикул «Обществом по изучению внеклеточных везикул» рекомендованы оценка размера и выявление экзосомальных мембранных или цитозольных белков [14]. Сочетание ультрафильтрации и двойного ультрацентрифугирования позволяет получить препараты везикул без примесей частиц более 100 нм, а форма и размер этих везикул соответствуют характеристикам экзосом, выделенных из других биологических жидкостей [15, 16]. В полученных нами препаратах основная часть везикул из крови здоровых женщин и онкологических больных имела размеры 40-100 нм и морфологические характеристики экзосом (рис. 1). Содержание везикул с поврежденной мембраной в препаратах не превышало 10 %, доля микровезикул (размером менее 30 нм) составила не более 15 %.
Для характеризации экзосом в текущей работе были использованы антитела к рецепторам семей-
ства тетраспанинов CD9, которые опосредуют адгезию экзосом на поверхности клетки-реципиента и являются обязательным структурным компонентом мембраны экзосом [14]. Практически все суммарные экзосомы крови связывались с антителами к CD9, частицы золота выявлялись на их поверхности (рис. 1).
Для сравнительного анализа протеома суммарных экзосом крови здоровых женщин и больных РМЖ были получены 2D-протеомные карты (по три 2D-электрофореграммы/образец) (рис. 2). Было установлено, что в составе экзосом присутствуют белки с молекулярной массой от 10 до 250 кДа. Наиболее значимые различия между протеомными картами суммарных экзосом крови здоровых женщин и больных РМЖ были найдены в одиннадцати областях электрофоретической карты. Выявленные различия заключались в появлении/ исчезновении белков и изменении экспрессии
присутствующих в норме белков. В частности, наблюдалось появление белковых пятен (области 2, 9) и исчезновение пятна (область 1 (II)) при РМЖ. Белковые пятна (области 1 (I), 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11) имели больший относительный объем на протеомных картах больных РМЖ по сравнению с контрольной группой (рис. 2).
Идентифицированные при помощи пептидного фингерпринта экзосомальные белки наиболее отличающихся 11 областей протеомных карт представлены в табл. 2. Ранее в составе экзосом методом масс-спектрометрии уже были обнаружены 11 из 13 (85 %) идентифицированных нами белков, они аннотированы в базе данных Exocarta (www. exocarta.org). Лейцин-богатый y-2-гликопротеин (LRG) и a-цепь фибриногена (FGB) обнаружены нами в составе экзосом впервые.
Ранее методом MALDI-TOF масс-спектрометрии были идентифицированы 54 и 45 белков в препара-
Рис. 1. Морфологическая характеристика суммарных экзосом, выделенных из крови здоровых женщин (а) и больных РМЖ (б). Экзосомы мечены антителами к рецептору CD9. Длина масштабной линии соответствует 100 нм. Трансмиссионная электронная микроскопия, негативное контрастирование фосфорно-
вольфрамовой кислотой Fig. 1. Morphological characteristics of total exosomes isolated from the blood of healthy women (a) and patients with breast cancer (b). Exosomes are labeled with antibodies to the CD9 receptor. The length of the scale line corresponds to 100 nm. Transmission electron microscopy, negative contrast with phosphoric tungsten acid
Рис. 2. Типичные протеомные карты суммарных экзосом крови здоровых женщин (а) и больных раком молочной железы (б). Двумерная электрофореграмма окрашена серебром. По оси абсцисс - изоэлектрическое фокусирование, по оси ординат -SDS-ПААГ-электрофорез. Молекулярные массы белков в кДа приведены слева. В окружности заключены белки, по относительному объему и наличию которых наблюдались отличия между исследуемыми группами Fig. 2. Typical proteomic maps of the total blood exosomes of healthy women (a) and patients with breast cancer (b). Two-dimensional electrophoregram is painted silver. The abscissa axis is isoelectric focusing, the ordinate axis is SDS-PAGE electrophoresis. Molecular weights of proteins in kDa are given on the left. In the circle are proteins, according to the relative volume and presence of which differences were observed between the studied groups
Таблица 1/Table 1
Характеристика больных РМЖ Characteristics of patients with breast cancer
Параметр/Parameter Количество больных/ Number of patients
Люминальный подтип/Luminal subtype 6 (75 %)
Трижды-негативный подтип/ Triple negative subtype 2 (25 %)
Ki67 10-15 % 8 (100 %)
T1 4 (50 %)
Стадия/ T2 4 (50 %)
Tumor stage N0 8 (100 %)
M0 8 (100 %)
Степень злокачественности/ Tumor grade II 8 (100 %)
Экзосомы крови ЗЖ Экзосомы больных РМЖ
Рис 3. Диаграмма Венна - Эйлера идентифицированных
белков суммарных экзосом крови Fig. 3. Venn-Euler diagram of identified proteins of total blood exosomes
P02787 P02647 P02671 P04259 095613 043399 P02765 P02750 P00738 P00739 P06727 P10909 P02679 P02760 P02790 P02766 P69905
5/9
3/1
1/0
1/0
3/2
0/1
6/6 TF APOA1 FGA KRT6B PCNT 2/0 TPD52L2 AHSG LRG1 HP HPR AP0A4 CLU FGG AMBP HPX TTR 2/2 HBA2
P02768 4/5 0/3 8/2 2/3 6/7 1/2 0/1 2/2 3/5 1/4 2/0 3/0 1/0 0/1 1/0 2/1 1/0 2/6 1/1 2/3 5/0
10/6
1/2
2/1
1/3
3/2
1/2
5/4
3/7
P02787 2/2 0/1 6/8 2/1 6/6 P02647 1/7 2/1 5/4 1/4
ЯНЕ!
ИИИИ1/0
2/1 2/0 El
P02671 (t/i Q14005
P02538 mm
P04259 095613 043399 ?2/0 Q9NZU7 Q15024 014543 Q1432011 /0 Q16775 Q13424 P16233
P02765 1/1 BBS
P02750 1/2 1/0 4/0 1/1 0/1 P00738 3/0 0/2 4/5 3/3 10/6
Р00739 m ■ ШЙ
P06727 0/1 0/2 2/1
P10909 2/0 0/1 3/1 1/3 1/3 P02679 2/0 1/0 3/1 1/0 3/2
октанам
2/3 0/2 5/4 1/00/1
шммш
m
Wl/1 i/o; Ш
mm
ш 1/0
P02760 0/2 0/1 0/1 1/2
P02790 1/1 4/1 2/1. 1/1 5/4 P02766 1/1 0/1 3/3 0/2 3/7 P00738 3/0 0/2 4/5 3/3 10/6 P69905 Ц 4/4 ^H 2/2 3/0 0/1 1/0 1/2 0/1 0/1
1/0 1/0 2/0 5/0 1/0
0/2ШШН 0/1 1/0 1/0 1/3 1/1 1/1 ■ Щ1/1 4/0 2/1 0/1 1/1 0/1 ■ 2/2 1/1 lit 1/1 4/1 1/3 ИШ2/0 10/0
i- та
0) с
u £
с о
tu OI ф <D
та
и
я .Ü и
" ¿ и
о in i_
с пз пз
£ о ^
Е о
я я и я и с л и и U U U ü U ti * -=
= о
в) и
го а а* I
— ч> пз го в) .У U
m 8 J £ £ £ fu «
1Л и
iD
£ с Jë та з U U -g
'о
0/1 3/0
1/3 1/0 3/2
ИНМ2/5
2/0
m
1/0
■■■ 1/0 1/2
■■|1 0/2 1/1
И
a/о
о/1.Щ
m
ш
вм
№
1Ш1Ш 1/0
1/0 1/0 1/0 1/0 ш т
1/0
ÍÜ1/1 1/1 IS
0/1 1/0 1/1 2/2:0/2 I
2/3 1/1 ¡0/2 1/0
1/0 2/0 0/1
1/3 1/0 2/1 2/0
1/1 4/0 0/1
1/1 № Iff; 0/2 1/0
2/5 0/1 1/0 1/1 1/0
та
та
U >. = с Ф - U
"то
Е Е
° I *
& г «
Е .Е >, та m
та та та с ~
и и и ц и
L_ L_
та О) и та
"Ч "D <и У
-о <и с "О та < ■о го
ж
е)
та «л
Е Е
Г) 1/1 V)
.— гота
g "о. "а
-Е о о
С О) <ъ
® Z 2
S i- (D
-S .§
ALB TF APOA1 FGA IL16 KRT6A KRT6B PCNT TPD52L2 CABP1 EXOSC7 SOC53 FAM50A HAG H SNTA1 PNLIP AHSG LRG1 HP HPR APOA4 CLU FGG AMBP HPX TTR HP
0/1 HBA2 та
E о ■о
ь..
о
А/А
Б/В
Рис. 4. Тепловая карта идентифицированных белков в составе суммарных экзосом крови больных РМЖ, ассоциированных с
развитием злокачественных новообразований (a) и РМЖ в частности (б) Fig. 4. The heat map of the identified proteins as a part of the common blood exosomes of breast cancer associated with the development of malignant neoplasms (a) and breast cancer in particular (b)
Таблица 2/Table 2
Идентифицированные при помощи пептидного фингерпринта белки суммарных экзосом крови Total blood exosome proteins identified with peptide fingerprint
Номер пятна/ Spot number Номер белка в базе Uniprot/ Protein number in Uniprot base Название белка/ Protein name Теоретический мол вес белка, Da/ Theoretical protein weight (Da) Теоретическая изоэлек-трическая точка белка/ Theoretical isoelectric point of protein
1 (I) P02768 Serum albumin 71362 5,92
1 (II) P06396 Gelsolin 86095 5,90
2 P02768 Serum albumin 71362 5,92
3 P02765 Alpha-2-HS-glycoprotein 40123 5,43
4 P02750 Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 38405 6,46
5 (I) P00738 Haptoglobin beta chain 27265 6,32
5 (I) P00739 Haptoglobin-related protein 39029 6,63
5 (II) P06727 Apolipo-protein A-IV 45398 5,28
6 P10909 Clusterin 53064 5,89
7 (I) P02679 Fibrinogen gamma chain 52138 5,37
7 (II) P02768 Serum albumin 71362 5,92
8 P02760 Alpha-1-microglycoprotein 20846 6,13
9 P00738 Haptoglobin alpha chain 15945 5,57
9 P02766 Transthyretin 13761 5,31
10 P02790 Hemopexin 52417 6,55
Таблица 3/Table 3
Идентифицированные при помощи MALDI-TOF масс-спектрометрии белки суммарных экзосом
крови здоровых женщин Total blood exosome proteins identified by MALDI-TOF mass-spectrometry in healthy women
Номер белка в базе/ Gene Name Название белка/ Protein name Аббревиатура белка/ Protein Abbreviation Наличие в базе данных Exo-Carta/ ExoCarta Database Availability
A0M8Q6 Immunoglobulin lambda constant 7 IGLC7 +
A6NCL7 Ankyrin repeat domain-containing protein 33B ANKRD33B -
ASMU93 Uncharacterized protein C17orf100 C17orf100 -
H3YGS3 Microfibrillar-associated protein 5 MFAP5 +
014S62 Interferon-inducible protein AIM2 AIM2 -
015О54 Lysine-specific demethylase 6B KDM6B +
01552О Fibroblast growth factor 10 FGF10 -
060832 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit 4 DKC1 +
095бО2 DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA1 POLR1A -
O95S31 Apoptosis-inducing factor 1 AIFM1 -
P00738 Haptoglobin beta chain HP +
P00739 Haptoglobin-related protein HPR -
P01871 Ig mu chain C region IGHM +
P02545 Prelamin-A/C LMNA +
P02679 Fibrinogen gamma chain FGG +
P02750 Leucine-rich alpha-2-glycoprotein LRG1 -
P02760 Alpha-1-microglycoprotein AMBP +
P02765 Alpha-2-HS-glycoprotein AHSG +
P02766 Transthyretin TTR +
P02768 Serum albumin ALB +
Окончание таблицы 3/End Table 3
P02787 Serotransferrin TF -
P02790 Hemopexin HPX +
P05976 Myosin light chain 1/3 MYL1 +
P06396 Gelsolin GSN -
P06727 Apolipo-protein A-IV APOA4 +
P0DOX6 Immunoglobulin mu heavy chain IGHM +
P10909 Clusterin CLU +
Plrnl Serine/threonine-protein kinase H1 PSKH1 -
P23109 AMP deaminase 1 AMPD1 -
P2б440 Isovaleryl-CoA dehydrogenase IVD -
P31327 Carbamoyl-phosphate synthase [ammonia] CPS1 +
P31749 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase AKT1 +
P48506 Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit GCLC -
P4974S Very long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase ACADVL -
P49763 Placenta growth factor PGF -
P53674 Beta-crystallin B1 CRYBB1 -
P61224 Ras-related GTP-binding protein B RAP1B +
P7S356 Phosphatidylinositol 4-kinase type 2-beta PIP4K2B -
Q0S42б Peroxisomal bifunctional enzyme EHHADH +
Q112О1 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 1 ST3GAL1 -
Q49A33 Putative zinc finger protein 876 ZNF876P -
Q49MG5 Microtubule-associated protein MAP9 -
Q4LEZ3 Alanine and arginine-rich domain-containing protein AARD -
Q504T8 Midnolin MIDN -
Qб9YQ0 Cytospin-A SPECC1L +
Q6P1J9 Parafibromin CDC73 -
QбZS02 Putative GED domain-containing protein DNM1P46 -
Q7Z553 MAM domain-containing glycosylphosphati-dylinositol anchor protein 2 MDGA2 -
Q86VE0 Myb-related transcription factor, partner of profilin MYPOP -
QSNSC0 Zinc finger protein 781 ZNF7S1 -
Q9H6Z4 Ran-binding protein 3 RANBP3 +
Q9HBI5 Uncharacterized protein C3orf14 C3orf14 -
Q9UK05 Growth/differentiation factor 2 GDF2 +
Примечание: курсивом отмечены универсальные белки. Notes: italics indicate universal proteins.
Таблица 4/Table 4
Идентифицированные при помощи MALDI-TOF масс-спектрометрии белки суммарных экзосом
крови больных РМЖ
Total blood exosome proteins identified by MALDI-TOF mass-spectrometry in patients with breast cancer
Наличие в базе данных
Номер белка в базе/ Название белка/ Аббревиатура белка/ ExoCarta/
Gene Name Protein name Protein Abbreviation Availability in ExoCarta
Database
O14543 Suppressor of cytokine signaling 3 SOCS3 -
015О5О TPR and ankyrin repeat-containing protein 1 TRANK1 +
Окончание таблицы 4/End Table 4
O43399 Tumor protein D54 TPD52L2 +
O95243 Methyl-CpG-binding domain protein 4 MBD4 -
O95613 Pericentrin PCNT -
P69905 Haptoglobin alpha chain HBA1 +
P00738 Haptoglobin beta chain HP +
P00739 Haptoglobin-related protein HPR -
P02538 Cytokeratin-6A KRT6A +
P02647 Apolipoprotein A-I APOA1 +
P02671 Fibrinogen alpha chain FGA +
P02679 Fibrinogen gamma chain FGG +
P02750 Leucine-rich alpha-2-glycoprotein LRG1 -
P02760 Alpha-1-microglycoprotein AMBP +
P02765 Alpha-2-HS-glycoprotein AHSG +
P02766 Transthyretin TTR +
P02768 Serum albumin ALB +
P02787 Serotransferrin TF -
P02790 Hemopexin HPX +
P04259 Cytokeratin-6B KRT6B +
P06727 Apolipo-protein A-IV APOA4 +
P10909 Clusterin CLU +
P16233 Pancreatic triacylglycerol lipase PNLIP -
P55199 RNA polymerase II elongation factor ELL -
P62987 Ubiquitin-60S ribosomal protein L40 UBA52 -
Q13424 Alpha-1-syntrophin SNTA1 +
Q13522 Protein phosphatase 1A PPP1R1A +
Q14005 Pro-interleukin-16 IL16 -
Q14320 Protein FAM50A FAM50A -
Q15024 Exosome complex component EXOSC7 +
Q15776 Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8 ZKSCAN8 -
Q16775 Hydroxyacylglutathione hydrolase HAGH +
Q4G0S7 Coiled-coil domain-containing protein 152 CCDC152 +
Q52M93 Zinc finger protein 585B ZNF585B -
Q5M9N0 Coiled-coil domain-containing protein 158 CCDC158 +
Q68J44 Dual specificity phosphatase DUPD1 -
Q8IUS5 Epoxide hydrolase 4 EPHX4 -
Q8IYE0 Coiled-coil domain-containing protein 146 CCDC146 -
Q8N9H8 Exonuclease mut-7 homolog EXD3 -
Q8NDD1 Uncharacterized protein C1orf131 C1orf131 -
Q8NEQ6 Steroid receptor-associated and regulated protein SRARP -
Q8WXS5 Voltage-dependent calcium channel gamma-8 subunit CACNG8 -
Q9NZU7 Calcium-binding protein 1 CABP1 +
Q9UKW4 Guanine nucleotide exchange factor VAV3 VAV3 -
Q9Y4E5 E3 SUMO-protein ligase ZNF451 ZNF451 +
Примечание: курсивом отмечены универсальные белки.
Notes: italics indicate universal proteins.
тах суммарных экзосом крови здоровых женщин и больных РМЖ соответственно, из них 12 белков являются универсальными (рис. 3). Ранее в составе экзосом методом масс-спектрометрии уже были обнаружены 35 % идентифицированных нами белков, они аннотированы в базе данных Exocarta (www.exocarta.org) (табл. 3, 4). С использованием базы данных dbDEPC 3.0 (database of Differently Expressed Proteins in Human Cancer) [13] установлено, что в составе суммарных экзосом крови больных РМЖ 28 (88 %) белков ассоциировано со злокачественными новообразованиями (рис. 4а), из них 17 (53 %) - с развитием РМЖ (рис. 4б). Согласно литературным данным, из идентифицированных с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии белков, ассоциированных с развитием РМЖ, гипер-экспрессированными являются 9 (53 %) белков, гипоэкспрессированными - 6 (35 %), экспрессия не изменяется у 2 (12 %) белков.
Обсуждение
Малоинвазивная процедура взятия венозной крови представляет альтернативу традиционной биопсии. Именно поэтому на сегодняшний день анализ белкового состава циркулирующих в крови экзосом является перспективным направлением поиска опухолеспецифичных маркеров злокачественных новообразований.
Представленная работа является пилотной в поиске протеомных опухоле-ассоциированных маркеров в составе суммарных экзосом крови, пул которых формируется из экзосом плазмы и экзосом, ассоциированных с поверхностью форменных элементов. В литературе широко представлены данные по поиску протеомных опухолевых маркеров в составе экзосом плазмы [17, 18], обсуждаются достоинства использования белков экзосом плазмы по сравнению с белками плазмы [19], однако данные об ассоциированных с клеточной поверхностью экзосомах немногочисленны. На сегодняшний день известно, что экзосомы несут на своей поверхности специфические рецепторы, которые обеспечивают их взаимодействие с клетками-мишенями. В то же время клетки различных типов могут связывать и интернализовать циркулирующие экзосомы [20-23]. Пул циркулирующих в крови экзосом формируют экзосомы, секретируемые лейкоцитами, эритроцитами, тромбоцитами и эндотелиоцитами (т.е. либо форменные элементы крови или клетки, непосредственно
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. WittenM., Parker C.C. Screening mammography: recommendations and controversies. Surg Clin North Am. 2018 Aug; 98(4): 667-75. doi: 10.1016/j.suc.2018.03.003.
2. Tamkovich S.N., Tutanov O.S., LaktionovP.P. Exosomes: generation, structure, transport, biological activity, and diagnostic application. Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2016 Oct; 10(3): 163-73. doi: 10.1134/S1990747816020112.
3. Yanez-MoM., SiljanderP.R., Andreu Z., ZavecA.B., BorraF.E., Bu-zasE.I., BuzasK., CasalE., CappelloF., Carvalh o J., ColaE., SilvaA.C.,
взаимодействующие с кровью), а также тканевые клетки, такие как фибробласты, эпителиальные клетки и опухолевые клетки [24, 25].
Поскольку было обнаружено, что экзосомы, ассоциированные с поверхностью форменных элементов крови онкологических больных содержат больше опухолевой микроРНК [26], в текущей работе нами была предпринята попытка идентификации опухоле-ассоциированных белков в составе суммарных экзосом крови больных РМЖ. Использование суммарных экзосом крови без разделения на подфракции (экзосомы плазмы, экзосомы, ассоциированные с поверхностью эритроцитов, экзосо-мы, ассоциированные с поверхностью лейкоцитов) позволяет сократить время и трудозатраты при пробоподготовке образца перед анализом, а также увеличить количество анализируемого материала, что является крайне важным аспектом для дальнейшего введения разработок в практику.
В текущей работе нами было идентифицировано 99 белков в составе суммарных экзосом крови, треть из которых ранее уже обнаруживали в экзосо-мах, полученных из кондиционных сред различных линий клеток и биологических жидкостей человека (www.ExoCarta.org). Выявленные впервые 2/3 эк-зосомальных белков позволят не только расширить фундаментальные знания об ассоциированных с форменными элементами экзосомах, но и заложат базу для создания новых вариантов диагностики онкологических заболеваний и позволят создать фундаментальные предпосылки для возможной оптимизации противоопухолевой терапии.
Заключение
Сравнительный анализ протеомного спектра суммарных экзосом крови ЗЖ и больных РМЖ позволил установить значимые различия в наборе белков в норме и при патологии (12 универсальных белков из 99 идентифицированных). В составе суммарных экзосом крови онкологических больных на начальных стадиях заболевания идентифицировано 17 уникальных белков, ассоциированных с РМЖ. Выявленные потенциальные белковые онкомаркеры требуют дальнейшей валидации. Возможно практическое использование полученных знаний для разработки методов малоинвазивной диагностики опухолей на доклинических стадиях, прогнозирования течения болезни и создания фундаментальных предпосылок для возможной оптимизации противораковой терапии.
Fais S., Falcon-Perez J.M., Ghobrial I.M., Giebel B., Gimona M., Graner M., Gursel I., Gursel M., Heegaard N.H.H., Hendrix A., Kierulf P., KokubunK., KosanovicM., Kralj-Iglic V, Kramer-AlbersE.-M, Laitinen S., Lasser S., Lener T., Ligeti E., Line A., Lipps G., Llorente A., Lotvall J., Mancek-Keber M., Marcilla A., Mittelbrunn M., Nazarenko I., Hoen E.N.M., Nyman T.A., O'Driscoll L., Olivan M., Oliveira C., Pall-inger E., del Portillo H.A., Reventos J., Rigau M., Rohde E., Sammar M., Sanchez-MadridF., SantaremN., SchallmoserK., OstenfeldM.S., Stoorvo-gel W., StukeljR., Van der Grein S.G., VasconcelosM.H., WaubenM.H.M., De Wever O. Biological properties of extracellular vesicles and their
physiological functions. J Extracell Vesicles. 2015 May; 4: 27066. doi: 10.3402/jev.v4.27066.
4. Aghebati-Maleki A., Nami S., Baghbanzadeh A., Karzar B.H., Noorolyai S., FotouhiA., Aghebati-MalekiL. Implications of exosomes as diagnostic and therapeutic strategies in cancer. J Cell Physiol. 2019 Jun. doi: 10.1002/jcp.28875.
5. Clark D.J., Fondrie W.E., Liao Z., Hanson P.I., Fulton A., Mao L., Yang A.J. Redefining the breast cancer exosome proteome by tandem mass tag quantitative proteomics and multivariate cluster analysis. Anal Chem. 2015 Oct; 87(20): 10462-9. doi: 10.1021/acs.analchem.5b02586.
6. Pant S., Hilton H., Burczynski M.E. The multifaceted exosome: biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities. Biochem Pharmacol. 2012 Jun; 83(11): 1484-94. doi: 10.1016/j.bcp.2011.12.037.
7. Koumangoye R.B., SakweA.M., Goodwin J.S., Patel T., Ochieng J. Detachment of breast tumor cells induces rapid secretion of exosomes which subsequently mediate cellular adhesion and spreading. PLoS One. 2011 Sep; 6(9): e24234. doi: 10.1371/journal.pone.0024234.
8. Tamkovich S.N., Bakakina Y.S., Tutanov O.S., Somov A.K., Ki-rushina N.A., Dubovskaya L.V., Volotovski I.D., Laktionov P.P. Proteome analysis of circulating exosomes in health and breast cancer. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2017 Jul; 43(2): 126-34. doi: 10.1134/ S1068162017020157.
9. ЛактионовП.П., Скворцова Т.Э., МорозкинЕ.С., Бондарь А.А., МилейкоВ.А., Власов В.В.; ООО «ЦСБГеномика». Способ получения суммарной фракции внеклеточных нуклеиновых кислот из крови. Патент № 2554746 РФ, МПК G01N 33/48. № 2014120562/15; Заявл. 21.05.14; Опубл. 01.06.15.
10. GorgA., Weiss W. Horizontal SDS-PAGE for IPG-Dalt. Meth Mol Biol. 1999; 112: 235-44.
11. Blum H., Beier H., Gross H.J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 1987 Feb; 8(2): 93-9. doi: 10.1002/elps.1150080203.
12. Tamkovich S.N., SerdukovD.S., Tutanov O.S., Duzhak T.G., Lak-tionov P.P. Identification of proteins in blood nucleoprotein complexes. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2015; 41(6): 617-25. doi: 10.1134/S1068162015060163.
13. Yang Q., Zhang Y., Cui H., Chen L., Zhao Y., Lin Y., Zhang M., Xie L. dbDEPC 3.0: the database of differentially expressed proteins in human cancer with multi-level annotation and drug indication. Database (Oxford). 2018; 2018: bay015. doi: 10.1093/database/bay015.
14. Théry C., WitwerK.W., AikawaE., AlcarazM.J., Anderson J.D., Andriantsitohaina R., Antoniou A., Arab T., Archer F., Atkin-Smith G.K. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MIS-EV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles 2018 Nov; 7(1): 1535750. doi: 10.1080/20013078.2018.1535750.
15. Tamkovich S.N., Yunusova N.V., Somov A.K., Afanas'ev S.G., Kakurina G.V., Kolegova E.S., Tugutova E.A., Laktionov P.P., Kondakova I.V. Comparative subpopulation analysis of plasma exosomes from cancer
patients. Biochemistry (Moscow) Supplement Series. B. Biomedical. Chemistry. 2018 Oct; 12(2): 151-5. doi: 10.1134/S1990750818020130.
16. Tamkovich S., Grigor'evaA., Eremina A., Tupikin A., KabilovM., Chernykh V., Vlassov V., Ryabchikova E. What information can be obtained from the tears of a patient with primary open angle glaucoma? Clin Chem Acta 2019 Aug; 495: 529-37. doi: 10.1016/j.cca.2019.05.028.
17. Wu A.Y., Ueda K., Lai C.P. Proteomic analysis of extracellular vesicles for cancer diagnostics. Proteomics. 2019 Jan; 19(1-2): e1800162. doi: 10.1002/pmic.201800162.
18. Cufaro M.C., Pieragostino D., Lanuti P., Rossi C., Cicalini I., Federici L., De Laurenzi V., Del Boccio P. Extracellular vesicles and their potential use in monitoring cancer progression and therapy: the contribution of proteomics. J Oncol. 2019 Jun; 2019: 1639854. doi: 10.1155/2019/1639854.
19. Boukouris S., Mathivanan S. Exosomes in bodily fluids are a highly stable resource of disease biomarkers. Proteomics Clin Appl. 2015 Apr; 9(3-4): 358-67. doi: 10.1002/prca.201400114.
20. Nazarenko I., Rana S., Baumann A., McAlear J., Hellwig A., Trendelenburg M., Lochnit G., Preissner K.T., Zoller M. Cell surface tet-raspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 2010 Feb; 70(4): 1668-78. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-2470.
21. Mathivanan S., Ji H., Simpson R.J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J Proteomics 2010 Sep; 73(10): 1907-20. doi: 10.1016/j.jprot.2010.06.006.
22. Calzolari A., Raggi C., Deaglio S., Sposi N.M., Stafsnes M., Fecchi K., Parolini I., Malavasi F., Peschle C., Sargiacomo M., Testa U. TfR2 localizes in lipid raft domains and is released in exosomes to activate signal transduction along the MAPK pathway. J Cell Sci. 2006 Nov; 119: 4486-98.
23. Clayton A., Turkes A., Dewitt S., Steadman R., Mason M.D., Hal-lett M.B. Adhesion and signaling by B cell-derived exosomes: the role of integrins. FASEB J. 2004 Jun; 18(9): 977-9.
24. Danesh A., Inglis H.C., Jackman R.P., Wu S., Deng X., Muench M.O., Heitman J.W., Norris P.J. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood 2014 Jan; 123(5): 687-96. doi: 10.1182/ blood-2013-10-530469.
25. Minciacchi V.R., FreemanM.R., Di VizioD. Extracellular vesicles in cancer: exosomes, microvesicles and the emerging role of large on-cosomes. Semin Cell Dev Biol. 2015 Apr; 40: 41-51. doi: 10.1016/j. semcdb.2015.02.010.
26. Tamkovich S., Tutanov O., Efimenko A., Grigor'eva A., Ryab-chikova E., Kirushina N., Vlassov V., Tkachuk V., Laktionov P. Blood circulating exosomes contain distinguishable fractions of free and cell-surface-associated vesicles. Curr Mol Med. 2019 Mar; 19(4): 273-85. doi: 10.2174/1566524019666190314120532.
Поступила/Received 31.07.2019 Принята в печать/Accepted 19.07.2019
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Тутанов Олег Сергеевич, старший лаборант, Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск, Россия). Researcher ID (WOS): R-3938-2016. Author ID (Scopus): 56971591700.
Бакакина Юлия Сергеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, УЗ «Национальная антидопинговая лаборатория» (Минский район, аг. Лесной, Республика Беларусь). SPIN-код: 9927-9534, Author ID (Scopus) 37064346900. Проскура Ксения Викторовна, аспирант, Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск, Россия). Author ID (Scopus): 57205562492.
Григорьева Алина Евгеньевна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник, Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск, Россия). SPIN-код: 11916659. Researcher ID (WOS): I-3881-2014. Author ID (Scopus): 57189510749. ORCID: 0000-0001-9853-223X. Сяхович Виталий Эдуардович, начальник отдела исследований и разработок в допинг-контроле, УЗ «Национальная антидопинговая лаборатория» (Минский район, аг. Лесной, Республика Беларусь). SPIN-код: 7646-8360. Author ID (Scopus): 6504187425.
Беляев Сергей Александрович, директор, УЗ «Национальная антидопинговая лаборатория» (Минский район, аг. Лесной, Республика Беларусь).
Рябчикова Елена Ивановна, доктор биологических наук, заведующая группой, Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск, Россия). SPIN-код: 623-4112. Researcher ID (WOS): G-3089-2013, Author ID (Scopus): 6701791174. ORCID: 0000-0003-4714-1524.
Центалович Юрий Павлович, доктор химических наук, заведующий лабораторией, Институт «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск, Россия). Author ID (Scopus): 57193617761. Лактионов Павел Петрович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией, Институт химической биологии и
фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск, Россия). Researcher ID (WOS): G-9804-2013. Author ID (Scopus): 7003559490. ORCID: 0000-0003-4714-1524.
Тамкович Светлана Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск, Россия). E-mail: s.tamk@ niboch.nsc.ru. SPIN-код: 6462-3700. Researcher ID (WOS): G-9790-2013. Author ID (Scopus) 7801643574. ORCID: 0000-0001-7774-943X.
ВКЛАД АВТОРОВ
Тутанов Олег Сергеевич: экспериментальная работа. Бакакина Юлия Сергеевна: экспериментальная работа. Проскура Ксения Викторовна: экспериментальная работа. Григорьева Алина Евгеньевна: экспериментальная работа. Сяхович Виталий Эдуардович: статистическая обработка. Беляев Сергей Александрович: статистическая обработка.
Рябчикова Елена Ивановна: критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания. Центалович Юрий Павлович: критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания. Лактионов Павел Петрович: критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания. Тамкович Светлана Николаевна: разработка концепции научной работы, составление черновика рукописи, анализ научной работы, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Финансирование
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Новосибирской области в рамках научного проекта № 18-415-540012 р_а. Конфликт интересов
Авторы объявляют, что у них нет конфликта интересов. Благодарность
Авторы признательны В.Е. Войцицкому (Новосибирский областной онкологический диспансер, г. Новосибирск) за содействие в исследованиях.
ABOUT THE AUTHORS
Oleg S. Tutanov, Senior Assistant, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences (Novosibirsk, Russia). Researcher ID (WOS): R-3938-2016. Author ID (Scopus): 56971591700.
Yulia S. Bakakina, PhD, Senior Researcher, National Anti-Doping Laboratory (Minsk reg., Lesnoy, Belarus). Author ID (Scopus): 37064346900.
Ksenia V. Proskura, PhD-student, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences (Novosibirsk, Russia). Author ID (Scopus): 57205562492.
Alina E. Grigoryeva, Junior Researcher, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences (Novosibirsk, Russia). Researcher ID (WOS): I-3881-2014. Author ID (Scopus): 57189510749. ORCID: 0000-0001-9853-223X.
Vitaly E. Syakhovich, Head of Doping Control Research and Development Department, National Anti-Doping Laboratory (Minsk reg., Lesnoy, Belarus). Author ID (Scopus): 6504187425.
Sergey A. Beliaev, Director, National Anti-Doping Laboratory (Minsk reg., Lesnoy, Belarus).
Elena I Ryabchikova, Head of Group, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences (Novosibirsk, Russia). Researcher ID (WOS): G-3089-2013. Author ID (Scopus): 6701791174. ORCID: 0000-0003-47141524.
Yuri P. Tsentalovich, Head of Laboratory, Institute "International Tomografic Center" (Novosibirsk, Russia). Author ID (Scopus): 57193617761.
Pavel P. Laktionov, Head of Laboratory, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences (Novosibirsk, Russia). Researcher ID (WOS): G-9804-2013. Author ID (Scopus): 7003559490. ORCID: 00000003-4714-1524.
Svetlana N. Tamkovich, Senior Researcher, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences (Novosibirsk, Russia). E-mail: s.tamk@niboch.nsc.ru. SPIN-Kog: 6462-3700. Researcher ID (WOS): G-9790-2013. Author ID (Scopus): 7801643574. ORCID: 0000-0001-7774-943X.
AUTHOR CONTRIBUTION
Oleg S. Tutanov: experimental study. Yulia S. Bakakina: experimental study. Ksenia V. Proskura: experimental study. Alina E. Grigoryeva: experimental study. Vitaly E. Syakhovich: statistical analysis.
Sergey A. Beliaev: statistical analysis.
Elena I. Ryabchikova: critical revision of manuscript for important intellectual content. Yuri P. Tsentalovich: critical revision of manuscript for important intellectual content. Pavel P. Laktionov: critical revision of manuscript for important intellectual content.
Svetlana N. Tamkovich: development of study conception and design, original drafting of manuscript, data analysis and interpretation, critical revision of manuscript for important intellectual content.
Funding
This work was supported by the Russian Foundation for Basic Research and Government of Novosibirsk region of the Russian Federation, grant 18-415-540012. Conflict of interest
The authors declare that they have no conflict of interest. Acknowledgements
The authors thank V.E. Voytsitskiy (Novosibirsk Regional Oncological Dispensary) for help in research.
