CC BY
32
Экзосомальные протеазы при колоректальном раке
Е.А. Замбалова1, М.Р. Патышева1, А.А. Димча1, С.Н. Тамкович2, 3, А.Е. Григорьева2, Е.С. Колегова1, И.В. Кондакова1, С.Г. Афанасьев1, Н.В. Юнусова1, 4
1НИИ онкологии ФГБНУ«Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН»; Россия, 634009 Томск, пер. Кооперативный, 5; 2ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН»; Россия, 630090 Новосибирск, пр-т акад. Лаврентьева, 8; ФГАОУВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»; Россия, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2; 4ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; Россия, 634050 Томск, Московский тракт, 2
Контакты: Елена Анатольевна Замбалова [email protected]
Цель исследования — оценить уровень протеаз ADAM10 и ADAM17 (a disintegrin and metalloproteinase), а также 20S-nротеасом в экзосомах плазмы крови больных колоректальным раком.
Материалы и методы. В исследование были включены 60 больных колоректальным раком (T2—4N0—2M0—1) и 10 пациентов контрольной группы. Материалом для исследования послужила 3-замещенная калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) плазма крови. Экзосомы плазмы крови выделены методом ультрафильтрации с ультрацентрифугированием. Уровень тетраспанин-ассоциированных (ADAM10 и ADAM17) и тетраспанин-неассоциированных (20S-протеасомы) протеаз оценивали с помощью проточной цитометрии и вестерн-блоттинга.
Результаты. Дважды негативная субпопуляция (ADAM10-/ADAM17-) преобладала как в экзосомах плазмы крови больных колоректальным раком, так и в экзосомах пациентов контрольной группы. Обнаружены статистически значимые различия в уровне ADAM10+/ADAM17— экзосом у пациентов контрольной группы по сравнению с больными колоректальным раком. Не выявлено значимых различий между субпопуляциями ADAM10/ADAM17 и уровнем 20S-протеасом экзосом в зависимости от пола, возраста и степени дифференцировки опухоли. У пациентов с метастатическим колоректальным раком с гематогенными метастазами выявлено снижение субпопуляции ADAM10+/ADAM17— экзосом по сравнению с пациентами с местно-распространенным колоректальным раком (T2—4N1—2M0) и 20S-протеасом по сравнению с пациентами с T2—4N0M0. В экзосомах больных колоректальным раком с наличием метаболического синдрома выявлено снижение ADAM10—/ADAM17+ экзосом и уровня 20S-протеасом по сравнению с больными без метаболических нарушений.
Ключевые слова: экзосома, 20S-протеасома, члены семейства ADAM-протеаз, ADAM10, ADAM17, колоректальный рак, метаболический синдром
Для цитирования: Замбалова Е.А., Патышева М.Р., Димча А.А. и др. Экзосомальные протеазы при колоректальном раке. Успехи молекулярной онкологии 2018;5(4):117—26.
cv
CS
и ш u
ж ш
и
DOI: 10.17650/2313-805X-2018-5-4-117-126
Exosomal proteases in colorectal cancer
E.A. Zambalova1, M.R. Patysheva1, A.A. Dimcha1, S.N. Tamkovich2,3, A.E. Grigor'eva2, E.S. Kolegova1, I.V. Kondakova1, S.G. Afanas'ev1, N.V. Yunusova'4
'Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of Russian Academy of Sciences; 5 Kooperativnyy Pereulok, Tomsk 634009, Russia; 2Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences; 8 Akad. Lavrent'eva Rpospekt, Novosibirsk 630090, Russia; 3Novosibirsk National State Research University; 2 Pirogova St., Novosibirsk 630090, Russia; 4Siberian State Medical University; 2 Moskovskiy Tract, Tomsk 634050, Russia
The objective is to evaluate the level of ADAM'0 and ADAM'7 (a disintegrin and metalloproteinase) proteases, as well as 20S-proteasomes in blood plasma exosomes of patients with colorectal cancer.
Materials and methods. The study included 60 patients with colorectal cancer (T2—4N0—2M0—') and '0 control patients. The material for the study was EDTA blood plasma. Exosomes of blood plasma were isolated by ultrafiltration with ultracentrifugation. The level of tet-raspanin-associated (ADAM'0 and ADAM'7) and tetraspanin-non-associated (20S-proteasome) proteases was evaluated by flow cytometry and Western blotting.
Results. A twice negative subpopulation (ADAM'0—/ADAM'7—) predominated in blood plasma exosomes of colorectal cancer patients and control patients. The level of ADAM'0+/ADAM'7— exosomes was significantly higher in the exosomes of the plasma of control patients. There were no significant differences between the ADAM'0/ADAM'7subpopulations and the 20S-proteasome level, depending on sex, age
CV
es
and tumor grade. A decrease in the ADAM10+/ADAM17— subpopulation was found in patients with metastatic colorectal cancer with hematogenous metastases compared with patients with T2—4N1—2M0 and 20S-proteasome compared to T2—4N0M0. A decrease in ADAM10—/ ADAM17+ exosomes and 20S-proteasomes level was found in exosomes of patients with colorectal cancer with a metabolic syndrome in comparison with patients without metabolic disorders.
Key words: exosome, 20S-proteasomes, the members of ADAMs family, ADAM10, ADAM17, colorectal cancer, metabolic syndrome
For citation: Zambalova E.A., Patysheva M.R., Dimcha A.A. et al. Exosomalproteases in colorectal cancer. Uspekhi molekulyarnoy onko-logii = Advances in Molecular Oncology 2018;5(4):117—26.
и
Ш
u
X ш
и
Введение
Колоректальный рак (КРР) — один из наиболее распространенных видов опухолей желудочно-кишечного тракта и занимает 2-3-е место в структуре онкологической заболеваемости в большинстве стран мира как у мужчин, так и у женщин. Особенностью является то, что почти в 20 % случаев КРР изначально манифестирует как метастатический. Примерно у трети пациентов с локализованными формами КРР возникают рецидивы опухоли или гематогенные метастазы (чаще в печень) в течение 3 лет [1]. Поэтому важен поиск молекулярных предикторов гематогенного мета-стазирования у пациентов с локализованным и местно-распространенным КРР в целях персонализации адъ-ювантной терапии.
В настоящее время большое значение в процессах инвазии и метастазирования опухолей придают секре-тируемым внеклеточным везикулам, которые представляют собой экзосомы (средний размер 30—100 нм) и микровезикулы (средний размер 100—1000 нм). Они обнаружены во многих биологических жидкостях, таких как плазма, сыворотка крови, моча, слюна, грудное молоко, спинномозговая жидкость, а также при патологических выпотах (например, асцит) [2]. Тетраспа-нины CD9, CD63, CD81 являются экзосомальными биомаркерами [3, 4]. Около 32 % белкового состава экзосом составляют ферменты [5].
Важную роль в функциональной активности внеклеточных везикул играют протеазы, ферменты класса гидролаз. Показано, что экзосомы несут различные протеазы и их активаторы. Выделяют тетраспанин-ас-социированные, тетраспанин-неассоциированные протеазы, а также протеазы с неизвестной локализацией в экзосомах [4].
Тетраспанин-ассоциированные протеазы ADAM10 и ADAM17 (a disintegrin and metalloproteinase) представляют собой трансмембранные «молекулярные ножницы», которые осуществляют шеддинг — примем-бранный протеолиз белков, что приводит к расщеплению внеклеточного домена трансмембранных белков [6]. Субстратами шеддаз являются рецепторы факторов роста (EGFR1, HER2, TGFp-IIIR), рецепторы адгезии (CD44 и L1CAM), рецептор апоптоза Fas-L. В результате шеддинга происходит модификация клеточных рецепторов с изменением сигналинга от рецепторов факторов роста и адгезии, а также появление растворимых форм рецепторов в биологических жидкостях:
sCD44, sEGFR1, sHER2, sШFp-ШR, sFas-L [7]. Первоначальный протеолиз CD23, L1CAM и CD44, опосредованный АОАМЮ, может происходить в мульти-везикулярных тельцах внутри клеток. Этот процесс также происходит в экзосомах, высвобождаемых из опухолевых клеток, как показано при исследовании RPMI 8866 В-клеточной линии хронического миело-идного лейкоза, OVMz и SKOV3ip — клеточных линий карциномы яичников [8].
К тетраспанин-неассоциированным экзосомальным протеазам относятся такие белки, как 20S-протеасомы и металлопротеиназа РАРР-А [9, 10]. 20S-протеасома представляет собой цилиндрический мультикаталити-ческий комплекс, состоящий из 2 внутренних р-колец, фланкированных 2 внешними а-кольцами. Протеомные исследования выявили 7а- и 7р-цепей 20S-протеaсом в экзосомах, высвобождающихся из мезенхимальных стволовых клеток [11]. В клетках и экзосомах 20S-про-теасомы неспособны распознавать и связывать поли-убиквитинированные белки, однако эти протеасомы деградируют некоторые поврежденные и чужеродные белки по аденозинтрифостфат- и убиквитин-независи-мым механизмам [12].
Цель исследования. С учетом важной роли экзосо-мальных протеаз в регулировании передачи сигналов от рецепторов факторов роста и рецепторов адгезии, подвижности клеток и фолдинга белков целью исследования явилась оценка уровня содержания протеаз АОАМЮ и АОАМ17, а также 20S-протеaсом в циркулирующих экзосомах больных КРР. Кроме того, задачей исследования было определение возможной ассоциации протеаз с клиническими и гистологическими параметрами, а также с наличием метаболического синдрома для поиска перспективных экзосомальных маркеров, связанных с инвазией, метастазированием и метаболическими нарушениями при КРР.
Материалы и методы
Образцы крови пациентов контрольной группы (КП) (средний возраст 44,3 ± 3,1 года) и больных КРР с различными стадиями заболевания (средний возраст 58,6 ± 1,6 года) получены в НИИ онкологии ТНИМЦ.
Пациенты контрольной группы (п = 10) были обследованы в условиях поликлинического отделения НИИ онкологии ТНИМЦ. При обследовании, в том числе при видеоколоноскопии, у них исключена
злокачественная опухоль толстой и прямой кишки, а также другая онкологическая патология.
Критериями исключения при формировании группы КРР явились первично-множественные формы КРР, рак стадии Ia (T1N0M0), а также рак прямой кишки с поражением средне- и нижнеампулярного отдела.
Все пациенты с КРР (n = 60) были разделены на 2 подгруппы: с метаболическим синдромом (n = 33) и без метаболического синдрома (n = 27). Критерием включения в группу с метаболическим синдромом с учетом рекомендаций Международной федерации диабета (2005) было наличие абдоминального типа ожирения (окружность талии >94 см для мужчин и >80 см для женщин) в сочетании, по крайней мере, с 2 из 4 дополнительных критериев: повышение уровня триглицеридов в сыворотке крови >1,7 ммоль/л или лечение дислипидемии; снижение уровня липопроте-инов высокой плотности <1,03 ммоль/л для мужчин и <1,29 ммоль/л для женщин; высокое артериальное давление (систолическое >135 мм рт.ст. или диастоли-ческое >85 мм рт.ст., или терапия артериальной гипертонии); повышение уровня глюкозы в крови натощак >5,6 ммоль/л или выявленный сахарный диабет 2-го типа. Клинические и гистологические параметры для пациентов представлены в табл. 1. Исследование было одобрено локальным комитетом по медицинской этике НИИ онкологии ТНИМЦ. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Выделение экзосом. Экзосомы плазмы крови выделяли с помощью ультрафильтрации с ультрацентрифугированием. Венозную кровь (18 мл) от КП и больных КРР собирали в пробирки с 3-замещенной калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (BD Vacutainer Plus Tubes, Великобритания). Форменные элементы крови осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 1200g (бакет-ротор, Labofuge 400R, Thermo Fisher Scientific, США) и температуре 4 °C. Для удаления клеточного дебриса образцы плазмы центрифугировали при 17 000g (угловой ротор, центрифуга 5415R, Eppendorf) и температуре 4 °С в течение 20 мин. Для удаления везикул более 100 нм супернатант разбавляли в 5 раз PBS (10 мМ фосфатным буфером; 0,15 М NaCl, pH 7,5) и пропускали через фильтр размером пор 100 нм (Minisart high flow, 16 553-K, Sartorius). Для осаждения экзосом фильтрат центрифугировали при 100 000g (бакет-ротор, Optima XPN 80, Beckman Coulter, США) и температуре 4 °C в течение 90 мин, осадок ресуспендировали в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и дважды центрифугировали при тех же условиях. Выделенные экзосомы ресуспендировали в 350 мкл PBS. Аликвоты экзосом замораживали в жидком азоте и хранили при температуре —80 °С.
Электронная микроскопия экзосом. Для негативного контрастирования образцы экзосом сорбировали на медные сетки с формваровой подложкой,
Таблица 1. Клинические и гистологические параметры больных КРР Table 1. Clinical and histological characteristics of patients with CRC
%
Пол: Sex: мужской male
женский female
Возраст, лет: Age, years:
<59 >59
Стадия: Stage:
T2-4N0M0 (локализованный КРР) T2-4N0M0 (localized CRC) T2—4N1—2M0 (местно-распростра-ненный КРР)
T2-4N1-2M0 (locally advanced CRC) TanyNanyM1 (метастатический КРР) TanyNanyM1 (metastatic CRC)
Степень дифференцировки: Differentiation grade:
G, ,
29 31
18 42
27 25
G
Наличие метаболического синдрома:
Presence of metabolic syndrome: есть yes нет no
Примечание. КРР — колоректальный рак.
Note. CRC — colorectal cancer.
53 7
33 27
48,3 51,7
30,0 70,0
45,0 41,6
13,4
88,3 11,7
55,0 45,0
стабилизованной углеродом, в течение 1 мин и 10 с и контрастировали 2 % раствором фосфорно-вольфра-мовой кислоты. Сетки были изучены с использованием просвечивающего электронного микроскопа Jem 1400 (Jeol, Япония), изображения получены с помощью цифровой камеры Vëleta (Olympus Corporation, Япония).
Количественная оценка белка в экзосомах. Для оценки концентрации белка в экзосомах применяли набор количественного определения NanoOrange Protein (Molecular Probes, США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Проточная цитометрия. Альдегид-сульфатные ла-тексные частицы диаметром 4 мкм (Thermo Fisher Scientific, США) инкубировали с антителами против CD9 (ab134 375, Abcam) или CD24 (bsm-50 424M, Bioss) при комнатной температуре в течение 14 ч при осторожном перемешивании. Аликвоты экзосом (около 30 мкг экзосомального белка) инкубировали с комплексами антитело-латексные частицы в 100 мкл PBS при температуре 4 °С в течение 14 ч при осторожном
CV
CS
и ш u
X ш
и
n
8
CV
us
и ш U
ж ш
и
перемешивании. Реакцию блокировали 0,2 M глицином в течение 30 мин при температуре 4 °С. Комплексы «экзосомы—антитело—латексные частицы» дважды отмывали промывочным буфером (PBS с добавлением 2 % бычьей сыворотки, деплетированной от экзосом), инкубировали с блокирующим иммуноглобулином G (IgG) (BD BioSciences, США) при комнатной температуре в течение 10 мин, отмывали, затем проводили инкубацию с FITC-конъюгированными антителами против тетраспанинов (CD63, CD81, CD9, CD24) (BD BioSciences, США) при температуре 4 °C в течение 50 мин. Комплексы отмывали дважды промывочным буфером и исследовали образцы на цитометре FACS Canto II (BD BioSciences, США), данные анализировали с использованием программного обеспечения FACS Diva 6.1. Медиана интенсивности флуоресценции экзосом была проанализирована по сравнению с изотипическим контролем (BD BioSciences, США) и отрицательным контролем.
Анализ субпопуляций ADAM10/ADAM17 экзосом. Аликвоты экзосом (около 30 мкг экзосомального белка) инкубировали с 3 х 105 анти-CD9 латексными частицами в 150 мкл PBS при температуре 4 °С в течение ночи при осторожном перемешивании и блокировали в 0,2 M глицине в течение 30 мин, затем окрашивали анти-ADAMlO (CD156c) — PE (5 мкл на тест; BioLegend, США) и анти-ADAM17/TACE (разведение 1:10; LifeSpan BioSciences, США) в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем комплексы окрашивали вторичным антителом IgG, Alexa Fluor 488 (разведение 1:3000; Thermo Fisher Scientific, США). Проточная ци-тометрия выполнена на цитометре Cytoflex (Becman Coulter, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения CytExpert 2.0.
Вестерн-блоттинг. Аликвоты экзосом (30 мкл, У мкг экзосомального белка) были инкубированы в течение 90 мин на льду с У мкл лизис-буфера (125 мМ Трис-HCl; pH У—8; У50 мМ NaCl; 0,5 % SDS; 5 % Triton X-100) с добавлением 3 мкл протеазного коктейля (1,3 мМ апротинина (Sigma, США), 0,33 мМ пепстатина А (ICN, США), 1 мкг/мл лейпептина (ICN, США)). Образцы лизированных экзосом инкубировали с sample-буфером при температуре 95 °С в течение У мин и центрифугировали при 13 000g в течение 5 мин. Супернатанты образцов наносили на 13 % ПАА-гель для SDS-PAGE электрофореза по Lemmli. После электрофореза белки переносили на PVDF-мембрану (Immobylon, Millipore, США). Мембрану блокировали раствором 1X iBind (Invitrogen, США). Связывание с первичным антителом к 20S-протеасомам (анти-Proteasome 20S-альфа+бета ab22 6У3; Abcam, Великобритания); 1:2000), промывку, связывание со вторичным антителом (IgA-HRP антитело, Santa Cruz Biotechnology, 1:5000) проводили с использованием автоматизированного устройства iBind Western Device (Thermo Fisher Scientific, США). Далее мембрану инкубировали с раствором детекции Amersham ECL
(Amersham, США). Визуализация была выполнена в системе ChemiDoc Touch (Bio-Rad, США). Плотность полос оценивали с использованием компьютерной программы ImageLab. Результаты были стандартизированы с учетом уровня CD63 в экзосомах и выражены в условных единицах от уровня 20S-протеасом в экзосомах у КП.
Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 10.0. Данные проанализированы на соответствие выборки нормальному распределению с использованием критерия Ша-пиро—Уилка. Все данные выражены как медианы с межквартильным размахом или как средние со стандартными ошибками. Достоверность различий оценивали с помощью U-критерия Манна—Уитни и критерия Крускала—Уоллиса. Различия считали достоверными при значенияхр <0,05.
Результаты
Характеристика экзосом плазмы. Принадлежность выделенных везикул к классу экзосом была подтверждена методом трансмиссионной электронной микроскопии. В препаратах экзосом, выделенных из плазмы крови КП и больных КРР, обнаружены четко структурированные частицы чашеобразной формы низкой электронной плотности с сохранной мембраной (рис. 1). Выявлено, что их морфология не отличается от экзосом больных с другими злокачественными новообразованиями [13]. В препаратах также присутствовали частицы, не соответствующие экзо-сомам по морфологии [14].
Выделенные экзосомы также охарактеризованы методом проточной цитометрии на наличие экзосо-мальных маркеров (CD9, CD24, CD63 и CD81). Сочетание конъюгированных и неконъюгированных антител позволяет идентифицировать различные субпопуляции экзосом. По снижению медианы интенсивности флуоресценции субпопуляции экзосом распределялись следующим образом: CD24 D9/СD81>CD24/CD63>CD9/CD63 (экзосомы плазмы крови КП); СD9/CD81>CD9 / CD63>CD24/CD 9>CD24 / CD63 (экзосомы плазмы крови больных КРР). Таким образом, субпопуляционный состав эк-зосом из плазмы крови КП и больных КРР различен (табл. 2).
Статистически значимых различий в уровне экзо-сомального белка между препаратами от КП и больных КРР не обнаружено.
Анализ субпопуляций ADAM10/ADAM17 экзосом плазмы крови. Фенотипирование экзосом методом проточной цитометрии подразумевает анализ экзосом с использованием латексных частиц, покрытых антителом. Согласно результатам, полученным на предыдущем этапе нашей работы, мы использовали ла-тексные частицы с антителами против CD9 для обнаружения субпопуляций ADAM10/ADAM17 экзосом в плазме КП и больных КРР (рис. 2а).
О
ml
|
\
г
оо
о
Рис. 1. Общий вид препаратов экзосом, полученных из плазмы крови пациента контрольной группы (а), больного колоректальнымраком (б) (электронная микроскопия, негативное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой). На вставках изображены экзосомы. Стрелки указывают на экзосомы, эллипсы - «невезикулы». Размер шкалы соответствуют 100 нм
Fig. 1. General appearance of exosome samples isolated from plasma of a control patient (а), patient with colorectal cancer (б) (electron microscopy, negative contrast with phosphorous-wolfram acid). Panels show exosomes. Arrows point at exosomes, ellipses - at non-vesicles. Scale 100 nm
Распределение субпопуляций ADAM10/ADAM17 у КП и больных КРР оказалось сходным (рис. 2б—г). Субпопуляция ADAM10—/ADAM17— преобладала в обеих группах (у больных КРР - 88,0 ± 4,4 %, у КП - 77,0 ± 3,85 %; р >0,05) по сравнению с другими субпопуляциями экзосом. Выявлены статистически значимые различия в уровне ADAM 10+/ADAM17- экзосом у КП по сравнению с больными КРР: 12,0 ± 0,6 и 7,0 ± 0,35 % соответственно (р <0,05) (рис. 2г). Статистически значимое снижение уровня ADAM10+/ADAM17-экзосом обнаружено у пациентов с метастатическим КРР по сравнению с пациентами с распространенностью процесса T2-4N1-2M0, т. е. при отсутствии отдаленных метастазов (рис. 3). Не выявлено значимых различий между субпопуляциями ADAM10/ADAM17 экзосом в зависимости от пола, возраста и степени дифференцировки.
Уровень 20S-npoTeacoM экзосом плазмы крови. Анализ вестерн-блоттинг показал, что уровень 20S-проте-асом в экзосомах плазмы больных КРР в 1,8 раза выше, чем в экзосомах КП (рис. 4а). Максимальный уровень
Таблица 2. Экспрессия CD9, CD24, CD63 и CD81 на поверхности экзосом плазмы крови пациентов контрольной группы и больных колоректальным раком, m ± M
Table 2. CD9, CD24, CD63 and CD81 expression on the surface of plasma exosomes of control patients and patients with colorectal cancer, m ± M
Экспрессия Пациенты контрольной группы Control patients Больные колорек-
CD9- ™^<iJlbIIbI<;3K3()C0M^1
CD63 513 ± 76 720 ± 84
CD81 645 ± 97 1020± 105*
CD24 -положительные экзосомы
CD9 1048 ± 120 680 ± 85*
CD63 523 ± 75 500 ± 71
*Значимые различия по сравнению с экзосомами контрольных пациентов.
*Significant differences compared to exosomes of control patients.
20S-протеасом в экзосомах плазмы крови выявлен у больных КРР с локализованным процессом (Т2— 4^М0). Значительные различия обнаружены в уровне 20S-протеасом между этими пациентами (Т2— 4^М0) и больными с КРР при наличии гематогенных метастазов: 2,31 ± 0,11 и 1,45 ± 0,07 усл. ед. соответственно (р <0,05) (рис. 46). Значимых различий в уровне 20S-протеасом в зависимости от пола, возраста и степени дифференцировки не выявлено.
Связь ADAM10, ADAM17 и 20S-протеасом экзосом с метаболическим синдромом у больных КРР. В данном исследовании заболеваемость метаболическим синдромом больных КРР составляла 55 %. Метаболический синдром чаще встречался у женщин (64 %), чем у мужчин (36 %). Нами обнаружено, что уровень А0АМ10—/АОАМ17 экзосом был значительно снижен у больных КРР с метаболическим синдромом по сравнению с пациентами без него: 3,97 ± 0,71 и 13,04 ± 1,34 % соответственно (р <0,05) (рис. 5а). Выявлено снижение уровня 20S-протеасом в экзосомах плазмы крови больных КРР с метаболическим синдромом по сравнению с больными КРР без метаболических нарушений: 1,98 ± 0,25 и 2,92 ± 0,42 усл. ед. соответственно (р <0,05) (рис. 5б).
Обсуждение
В настоящее время существуют противоречивые данные о количестве циркулирующих экзосом у пациентов с КРР. Ряд авторов утверждают, что нет существенной разницы в средней концентрации экзосом между препаратами крови больных и здоровых лиц [15]. Другие авторы считают, что доля экзосом при КРР статистически выше, чем у здоровых лиц. Высокий
CV
ев
и ш u
ж ш
и
а
б
CV
us
0 104
105 FSC-A
106
10+17—(11,89 %) ■ 1 10+17+(1,81 %) v'V.o.y," . .
10-17-(79,67 %) ■ ■ 1 IVÉ1 1 PITS ■ I1 -'-У;, 1 10-17+(7,43 %) клп 1 Kin i"i-i
0 1 01 102 1 03 1 04 1 05 1 06 1 07 ADAM17 FITC-A
10+17-(7,80 %) 10+17+(0,47 %)
il 'ffitSjEjjfei,. 10-17-(88,31 %) 10-17+(3,41 %) Щ ""П
0 1 01 102 1 03 1 04 1 05 1 06 1 07 ADAM17 FITC-A
И
ш u
КП
3 %
П 10—17— :..: 10+17-LI 10-17+ 10+17+
KPP 1 %
10-1710+17-10-17+ 10+17+
X ш
и
Рис. 2. Различия между субпопуляциями ADAM10/ADAM17экзосом, выделенных из плазмы крови пациентов контрольной группы (КП) и больных колоректальнымраком (КРР): а — прямое (FSC-A) и боковое (SSC-A) светорассеяние комплексов экзосом с альдегид-сульфатными латексными частицами; б, в — двойное мечение антителами против ADAM10 и ADAM17экзосом плазмы крови КП (б) и больных КРР (в); г — процентное соотношение ADAM10/ADAM17 субпопуляций экзосом плазмы крови. Проточная цитометрия плазменных экзосом
Fig. 2. Differences between ADAM10/ADAM17 exosome subpopulations isolatedfrom plasma of control patients (CP) and patients with colorectal cancer (CRC): а — direct (FSC-A) and lateral (SSC-A) light scattering of exosome complexes with aldehyde-sulfate latex particles; б, в — dual staining with antibodies against ADAM10 and ADAM17 exosomes from plasma of CPs (б) and patients with CRC (в); г — ratio between ADAM10/ADAM17 exosome plasma subpopulations in percent. Plasma exosome flow cytometry
100
80
60
40
20
M
11 Пациенты контрольной группы/Patients of the control group □ T2-4N0M0 n T2-4N1-2M0
■ Метастатический колоректальный рак/Metastatic colorectal cancer
7,87 %
2,2 %
1W
10-17- 10+17- 10-17+ 10+17+
Рис. 3. Процентное соотношение субпопуляций ADAM10/ADAM17эк-зосом плазмы крови больных колоректальным раком в зависимости от стадии заболевания. *Значимоеразличие по сравнению с больными с T2-4N1-2M0
Fig. 3. Ratio between ADAM10/ADAM17plasma exosome subpopulations in percent in patients with colorectal cancer depending on disease stage. *Significant difference compared to patients with T2—4N1—2M0
уровень экзосом в плазме пациентов с КРР коррелировал с высоким уровнем раково-эмбрионального антигена и низкой степенью дифференцировки опухоли [16]. По-видимому, это связано с различными подходами к выделению экзосом и определением белка в изолированных везикулах.
Данные о субпопуляционном составе экзосом больных КРР немногочисленны. CD147 и CD9 дабл-положительные экзосомы встречались чаще в плазме крови больных КРР, чем у здоровых доноров [17]. Субпопуляция CD9/CD81 экзосом преобладала в плазме крови больных КРР и занимала около 31,8 % [15], что соответствует нашим данным.
Известно, что АОАМ10 проявляет протеолитиче-скую активность в мультивезикулярных тельцах, поэтому зрелый АОАМЮ уже включен в экзосомы [18]. Включение зрелого АОАМ10 в экзосомы и его протео-литическую активность регулируют тетраспанины СО9, СО81, СО82 [19]. АОАМ17 переносится в эндо-плазматический ретикулум в неактивной, латентной форме, которая взаимодействует с неактивным белком iRHOM2. Это способствует транслокации рго-АОАМ17
б
а
в
г
0
□ КРР/CRC
КП/CP
□ T2-4N0M0
□ T2-4N1-2M0
■ Метастатический КРР/Metastatic CRC КП/СР
CV
CS
20S CD63
КП/СР КРР/CRC
20S CD63 T2-4N0M0
T2-4N1-2M0
Метастатический КРР/Metastatic CRC
Рис. 4. Анализ вестерн-блоттинг: а - уровень 20S-протеасом экзосом плазмы крови больных колоректальным раком (КРР) по сравнению с пациентами контрольной группы (КП); б - уровень 20S-протеасом экзосом в зависимости от стадии заболевания. Результаты стандартизированы с учетом уровня CD63 в экзосомах и выражены в условных единицах от уровня 20S-протеасом в экзосомах у КП
Fig. 4. Western-blotting analysis: а - exosomal 20Sproteasome level in plasma of patients with colorectal cancer (CRC) compared to control patients (CP); б - exosomal 20Sproteasome level depending on disease stage. Results normalized taking into account CD63 level in exosomes and expressed in arbitrary units of exosomal 20S proteasome level in CP
в комплекс Гольджи, где он активируется фурин-кон-вертазой [20]. На клеточных культурах (линия эпителиальных клеток альвеолярной легочной карциномы A549, клеточной линии эпителиального рака молочной железы MDA-MB-231, линии эмбриональной почки человека HEK293 и линии клеток лейкемии человека THP-1) показано выделение ADAM17 в составе экзосом [21]. Комплексный протеомный анализ выявил определенную взаимосвязь между субъединицами 20S-протеасом и рибосомными белками в опухоль-ассо-циированных макрофагах [22]. Изменения в химотрип-синоподобной активности протеасом в клетках КРР по сравнению с соответствующими нормальными тканями наблюдались в сочетании с повышенной экспрессией иммунных субъединиц и/или протеасомным активатором PA28ß, связанным с активностью 20S-протеасомы [23]. Высокий уровень 20S-протеасом в экзосомах плазмы крови больных КРР, выявленный в нашей работе, по-видимому, обусловлен увеличени-
ем экспрессии как 26S-, так и 20S-nyroB в опухолевой ткани, что необходимо для клеток-реципиентов для реализации множества протеасомных функций в опухолевых клетках и микроокружении опухоли [12]. У пациентов с метастатическим КРР с гематогенными метастазами выявлено снижение субпопуляции ADAM10+/ADAM17 — экзосом по сравнению с пациентами с местно-распространенным КРР (T2—4N1— 2MO) и 20S-протеасом по сравнению с группой T2— 4N0M0, что требует дальнейшего изучения.
КРР в настоящее время рассматривается как злокачественное новообразование, в значительной степени связанное с метаболическим синдромом [24]. Согласно нашим ранее опубликованным данным метаболический синдром обнаружен примерно в 60 % случаев КРР со стадиями II—III, что соответствуют данным литературы [25, 26]. Показано, что наличие метаболического синдрома коррелирует с увеличением количества в крови прокоагулянтных
и ш u
ж ш
и
100 п
80
60
40
20
б
10-17- 10+17- 10-17+ 10+17+
□ Нет МС/No MS ■ Есть МС/With MS
3,5
3
its 2,5
!
3 2
.2
cc 1,5
е
1
0,5
Нет МС/No MS
Есть МС/With MS
Рис. 5. Экспрессия ADAM10, ADAM17и 20S-npomeacoM в зависимости от наличия метаболического синдрома: субпопуляции ADAM10/ADAM17(в %) в экзосомах плазмы крови больных колоректальным раком (а) и уровень 20S-протеаcом (в усл. ед.) экзосом больных колоректальным раком (б). МС — метаболический синдром. *Значимые различия по сравнению с больными колоректальным раком без МС
Fig. 5. ADAM10, ADAM17 and 20S proteasome expression depending on the presence of metabolic syndrome: ADAM10/ADAM17 subpopulations (in %) in plasma exosomes of patients with colorectal cancer (а) and exosomal 20Sproteasome level (in AU) in patients with colorectal cancer (б). MS — metabolic syndrome. *Significant differences compared to patients with colorectal cancer without MS
а
3
3
2
2
0
0
а
*
0
0
CV
us
и ш U
внеклеточных везикул, экспрессирующих тканевой фактор (TF+), полученных из тромбоцитов (аннексин V/ CD41+ и CD62P+), эндотелиальных клеток (CD31+/CD41- и CD62E+) и лейкоцитов ^45+) по сравнению с здоровыми лицами [27]. Кроме того, как внеклеточные везикулы, так и экзосомы несут комплекс маркеров, связанных с ожирением и резистентностью к инсулину, а экзосомы, полученные из адипоцитов, способствуют метастазированию [28, 29]. В настоящее время свойства экзосом при КРР, связанные с ожирением или метаболическим синдромом, не описаны. Потеря ADAM17 и 20S-протеасом в экзосомах, по нашим данным, может быть связана с наличием метаболического синдрома у больных КРР. Изучение субпопуляций, связанных с тетраспа-нин-ассоциированными и тетраспанин-неассоци-ированными протеазами в экзосомах, полученных из адипоцитов, прояснило бы роль ожирения в перераспределении экзосомальных протеаз.
Заключение
Дважды негативная субпопуляция (А0АМ10—/ ADAM17—) преобладала как в экзосомах плазмы крови больных КРР, так и в экзосомах КП. Обнаружены статистически значимые различия в уровне ADAM10+/ ADAM17— экзосом у КП по сравнению с больными КРР. Не выявлено значимых различий между субпопуляциями ADAM10/ADAM17 и уровнем 20S-протеасом экзосом в зависимости от пола, возраста и степени дифференцировки опухоли. У пациентов с метастатическим КРР с гематогенными метастазами отмечено снижение уровня субпопуляции ADAM10+/ ADAM17— экзосом по сравнению с пациентами с местно-распространенным КРР (T2—4N1—2M0) и 20S-протеасом по сравнению с группой T2—4N0M0. В экзосомах больных КРР с наличием метаболического синдрома выявлено снижение ADAM10—/ADAM17+ экзосом и уровня 20S-протеасом по сравнению с больными без метаболических нарушений.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
X ш
и
1. Loree J., Kopetz S. Recent developments in the treatment of metastatic colorectal cancer. Ther Adv Med Oncol 2017;9(8):551-64.
DOI: 10.1177/1758834017714997. PMID: 28794806.
2. Li W., Li C., Zhou T. et al. Role of exo-somal proteins in cancer diagnosis. Mol Cancer 2017;16(1):145. DOI: 10.1186/ s12943-017-0706-8. PMID: 28851367.
3. Yunusova N.V., Tamkovich S.N., Stakhe-eva M.N. et al. The characterization of exosome from blood plasma of patients with colorectal cancer. AIP Conference Proceedings 2016;1760, № 020070.
4. Юнусова Н.В., Тугутова Е.А., Тамко-вич С.Н. и др. Роль тетраспанинов
и протеаз экзосом в опухолевой прогрессии. Биомедицинская химия 2018;64(2):123-33. DOI: 10.18097/ PBMC20186402123. [Yunusova N.V., Tugutova E.A., Tamkovich S.N. et al. The role of exosomal tetraspanins and proteases in tumor progression. Biomeditsins-kaya khimiya = Biomedical Chemistry 2018;64(2):123-33. DOI: 10.18097/ PBMC20186402123. (In Russ.)].
5. Mathivanan S., Ji H., Simpson R.J. Exo-somes: extracellular organelles important in intercellular communication.
J Proteomics 2010;73(10):1907-20. DOI: 10.1016/j.jprot.2010.06.006. PMID: 20601276.
6. Matthews A.L., Noy P.J., Reyat J.S. et al. Regulation of A disintegrin and metallo-proteinase (ADAM) family sheddases ADAM10 and ADAM17: The emerging role of tetraspanins and rhomboids. Platelets 2017;28(4):333-41.
DOI: 10.1080/09537104.2016.1184751. PMID: 27256961.
7. Lee S.B., Schramme A., Doberstein K. et al. ADAM10 is upregulated in melanoma metastasis compared with primary melanoma. J Invest Dermatol 2010;130(3):763-73. DOI: 10.1038/ jid.2009.335. PMID: 19865098.
8. Stoeck A., Keller S., Riedle S. et al. A role for exosomes in the constitutive and stimulus-induced ectodomain cleavage of L1 and CD44. Biochem J 2006;393(3): 609-18. DOI: 10.1042/BJ20051013. PMID: 16229685.
9. Юнусова Н.В., Спирина Л.В., Кондакова И.В. и др. Связь экспрессии ме-таллопротеиназы PAPP-A с экспрессией ростовых и транскрипционных факторов при раке эндометрия. Известия РАН. Серия биологическая 2013;3:284. D0I:10.7868/ S0002332913030119. [Yunusova N.V., Spi-rina L.V., Kondakova I.V. et al. Relationship between the expression levels of PAPP-A metalloprotease and growth and transcriptional factors in endometrial cancer. Izvestiya RAN. Seriya biologicheskaya = Biology Bulletin 2013;3:284. (In Russ.)].
10. Kondakova I.V., Yunusova N.V., Spirina L.V. et al. Association between intracellular proteinase activities and the content of locomotor proteins in tissues of primary tumors and metastases of ovarian cancer. Bioorg Chem 2014;40(6):681-7. PMID: 25895370.
11. Lai R.C., Tan S.S., Teh B.J. et al. Proteolytic potential of the MSC exosome pro-teome: implications for an exosome-medi-ated delivery of therapeutic proteasome.
J Proteomics 2012;12:971907. DOI: 10.1155/2012/971907. PMID: 22852084.
12. Sharova N., Zakharova L. Multiple forms of proteasomes and their role in tumor fate. Recent Patients On Endocrine, Metabolic & Immune Drug Discovery 2005;2(3):152-61.
13. Тамкович С.Н., Юнусова Н.В., Стахе-ева М.Н. и др. Выделение и характери-зация экзосом плазмы крови больных раком молочной железы и колорек-тальным раком. Биомедицинская химия 2017;63(2):165-9. DOI: 10.18097/ PBMC20176302165. [Tamkovich S.N., Yunusova N.V., Stakheeva M.N. et al. Isolation and characterization of exosomes from blood plasma of breast cancer and colorectal cancer patients. Biomeditsins-kaya khimiya = Biomedical Chemistry 2017;63(2):165-9. (In Russ.)].
14. Григорьева А.Е., Дырхеева Н.С., Брыз-гунова О.Е. и др. Контаминация препаратов экзосом, выделенных из биологических жидкостей. Биомедицинская химия 2017;63(1):91-6. DOI: 10.18097/ PBMC2017630191. [Grigorieva A.E., Dyrkheeva N.S., Bryzgunova O.E. et al. Contamination of exosome preparations isolated from biological fluids Biomedit-sinskaya khimiya = Biomedical Chemistry 2017;63(1):91-6. (In Russ.)].
15. Tian Y., Ma L., Gong M. et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano 2018;12(1):671-80. DOI: 10.1021/acsnano.7b07782. PMID: 29300458.
16. Silva J., Garcia V., Rodriguez M. et al. Analysis of exosome release and its prog-
nostic value in human colorectal cancer. Genes Chromosomes Cancer 2012;51(4):409-18. PMID: 22420032.
17. Yoshioka Y., Kosaka N., Konishi Y. et al. Ultra-sensitive liquid biopsy of circulating extracellular vesicles using ExoScreen. Nat Commun 201;5:3591. DOI: 10.1038/ ncomms4591. PMID: 24710016.
18. Mathews J.A., Gibb D.R., Chen B.H. et al. CD23 Sheddase A disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10) is also required for CD23 sorting into B cell-derived exosomes. J Biol Chem 2010;285(48):37531-41. DOI: 10.1074/ jbc.M110.141556. PMID: 20876574.
19. Arduise C., Abache T., Li L. et al. Tet-raspanins regulate ADAM10-mediated cleavage of TNF-alpha and epidermal growth factor. J Immunol 2008;181(10):7002-13. PMID: 18981120.
20. Lopez-Verrilli M.A., Picou F., Court F.A. Schwann cell-derived exosomes enhance axonal regeneration in the peripheral nervous system. Glia 2013;61(11):1795-806. DOI: 10.1002/glia.22558.
PMID: 24038411.
21. Groth E., Pruessmeyer J., Babendreyer A. et al. Stimulated release and functional activity of surface expressed metalloproteinase ADAM17 in exosomes. Biochim Bio-phys Acta 2016;1863(11):2795-808. DOI: 10.1016/j.bbamcr.2016.09.002. PMID: 27599715.
22. Zhu Y., Chen X., Pan Q.J. et al. A comprehensive proteomics analysis reveals a secretory path- and status-dependent signature of exosomes released from tumor-associated macrophages. Proteome Res 2015;14(10):4319-31. DOI: 10.1021/ acs.jproteome.5b00770.
23. Кондакова И.В., Спирина Л.В., Коваль В.Д. и др. Химотрипсинподоб-ная активность и субъединичный состав протеасом в злокачественных опухолях человека. Молекулярная биология 2014;48(3):384-9.
DOI: 10.7868/S0026898414030112. [Kon-dakova I.V., Spirina L.V., Koval V.D. et al. Chymotrypsin-like activity and subunit composition of proteasomes in human cancers. Molekulyarnaya biologiya = Molecular Biology 2014;48(3):384-9. (In Russ.)].
24. Yunusova N.V., Kondakova I.V., Kolo-miets L.A. et al. Molecular targets for
the therapy of cancer associated with metabolic syndrome (transcription and growth factors). Asia Pac J Clin Oncol 2017;14(3):134-40. DOI: 10.1111/ ajco.12780. PMID: 29115033.
25. Юнусова Н.В., Кондакова И.В., Коло-миец Л.А. и др. Адипокины и их рецепторы у больных раком эндометрия
и ободочной кишки: связь с инвазией и метастазированием. Вопросы онкологии 2015;61(4):619-23. [Yunusova N.V.,
Kondakova I.V., Kolomiets L.A. et al. Serum adipokines and their receptors in endometrial and colon cancer patients: relationship with tumor progression and metastasis. Voprosy onkologii = Problems in Oncology 2015;61(4):619-23. (In Russ.)].
26. Yunusova N.V., Spirina L.V., Frolova A.E. et al. Association of IGFBP-6 expression with metabolic syndrome and adiponectin and IGF-IR receptor levels in colorectal cancer. Asian Pac J Cancer Prev 2016;17(8):3963-9. DOI: 10.22034/ APJCP.2016.17.12.5315.
PMID: 27644646.
27. Martinez M.C., Andriantsitohaina R. Extracellular Vesicles in Metabolic Syndrome. Circ Res 2017;120(10):1674-86. DOI: 10.1161/CIRCRESA-HA.117.309419.
28. Eitan E., Tosti V., Suire C.N. et al.
In a randomized trial in prostate cancer patients, dietary protein restriction modifies markers of leptin and insulin signaling in plasma extracellular vesicles. Aging Cell 2017;16(6):1430-3. DOI 10.1111/ acel.12657. PMID: 28921841.
29. Wang J., Wu Y., Guo J. et al. Adipocyte-de-rived exosomes promote lung cancer metastasis by increasing MMP9 activity via transferring MMP3 to lung cancer cells. Oncotarget 2017;8(47):81880-91. DOI: 10.18632/onco-target.18737. PMID: 29137230.
cv
ев
и ш u
Вклад авторов
Е.А. Замбалова: выделение экзосом, проточная цитометрия, статистический анализ, обзор публикаций, написание текста рукописи;
М.Р. Патышева: проточная цитометрия, обзор публикаций;
А.А. Димча: сбор клинических данных;
С.Н. Тамкович: анализ полученных данных;
А.Е. Григорьева: трансмиссионная электронная микроскопия;
Е.С. Колегова: вестерн-блоттинг;
И.В. Кондакова: обзор публикаций по теме статьи, анализ полученных данных; С. Г. Афанасьев: разработка дизайна исследования, анализ полученных данных;
H.В. Юнусова: обзор публикаций, анализ полученных данных. Authors' contributions
E.A. Zambalova: exosome isolation, flow cytometry, statistical analysis, reviewing of publications, article writing;
M.R. Patysheva: flow cytometry, reviewing of publications;
A.A. Dimcha: collecting of clinical data;
S.N. Tamkovich: analysis of obtained data;
A.E. Grigor'eva: transmission electron microscopy;
E.S. Kolegova: western-blotting;
I.V. Kondakova: reviewing of publications, analysis of obtained data; S.G. Afanas'ev: developing the research design, analysis of obtained data; N.V. Yunusova: reviewing of publications, analysis of obtained data.
X ш
и
ORCID авторов/ORCID of authors
Е.А. Замбалова/E.A. Zambalova: https://orcid.org/0000-0003-3698-8455 М.Р. Патышева/M.R. Patysheva: https://orcid.org/0000-0003-2865-7576 А.А. Димча/A.A. Dimcha: https://orcid.org/0000-0002-9551-1908 С.Н. Тамкович/S.N. Tamkovich: https://orcid.org/0000-0001-7774-943X Е.С. Колегова/E. S. Kolegova: https://orcid.org/0000-0001-9122-3274 И.В. Кондакова/I.V. Kondakova: https://orcid.org/0000-0003-0907-4615 С.Г. Афанасьев/S.G. Afanas'ev: https://orcid.org/0000-0002-4701-0375 Н.В. Юнусова/N.V. Yunusova: https://orcid.org/0000-0003-4595-4177
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
00 Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и админист-^ рации Томской области в рамках научного проекта № 18-415-703 006.
см Financing. The reported research was funded by Russian Foundation for Basic Research and the government of the Tomsk region of the Russian Federation, grant № 18-415-703 006.
Информированное согласие. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. es Informed consent. All patients gave written informed consent to participate in the study.
И Ш
u
X ш
и
Статья поступила: 21.09.2018. Принята к публикации: 02.11.2018. Article received: 21.09.2018. Accepted for publication: 02.11.2018.
