CC BY
14
CV
со
us
и ш u
ж ш
и
Ассоциированные с полом и метаболическими нарушениями изменения в уровне матриксных металлопротеиназ в экзосомах при колоректальном раке
Н.В. Юнусова, Е.А. Замбалова, М.Р. Патышева, А.А. Димча, О.В. Черемисина, С.Г. Афанасьев, И.В. Кондакова
НИИ онкологии ФГБНУ«Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН»; Россия, 634009 Томск, Кооперативный переулок, 5
Контакты: Елена Анатольевна Замбалова etugutova@mail.ru
Цель исследования — оценить содержание матриксных металопротеиназ (ММР) ММР9 и ММР2, а также их индуктора EMMPRIN в циркулирующих экзосомах больных колоректальным раком (КРР) в связи с клиническо-морфологическими параметрами, а также с наличием метаболического синдрома для поиска перспективных экзосомальных маркеров, связанных с инвазией, метастазированием и метаболическими нарушениями.
Материалы и методы. В исследование были включены 40 больных КРР (T2—4N0—2M0—1) и 10 пациентов контрольной группы. Экзосомы плазмы крови выделены методом ультрафильтрации с ультрацентрифугированием. Уровни ММР9, ММР2, а также их индуктора EMMPRIN оценивали с помощью проточной цитометрии.
Результаты и заключение. Экспрессия ММР9 в образцах экзосом была значимо выше у больных КРР по сравнению с больными с колоректальными полипами. Доля ММР9-отрицательных образцов латексных частиц, содержащих экзосомы, и образцов с положительной экспрессией ММР9/ММР2/EMMPRIN, наоборот, была выше у пациентов с полипами по сравнению с больными КРР. Образцы латексных частиц, содержащих экзосомы, экспрессирующие ММР9 и отрицательные по 2 другим маркерам, преобладали как у больных КРР, так и у пациентов контрольной группы. Не выявлено значимых различий в экспрессии ММР и EMMPRIN в образцах экзосом плазмы крови больных КРР в зависимости от возраста, стадии, степени дифференцировки и локализации опухолевого процесса. Выявлены гендерные различия в экспрессии ММР и EMMPRIN в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы у больных КРР. Не обнаружено взаимосвязей экспрессии ММР и EMMPRIN в экзосомах и наличия метаболического синдрома, антропометрических параметров, уровней общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности и липопротеинов высокой плотности. Однако выявлены связи экспрессии образцов латексных частиц, содержащих экзо-сомы, экспрессирующих ММР9 и отрицательных по ММР2 и EMMPRIN (r = 0,51 и r = —0,56 соответственно;p <0,05), а также экспрессирующих ММР9 и EMMPRIN и отрицательных по ММР2 (r = —0,60 и r = 0,57соответственно; p <0,05), с уровнями триглицеридов и глюкозы в сыворотке крови. Необходимы дальнейшие исследования по изучению характеристик экзосом, ассоциированных с метаболическими нарушениями, и возможности их использования в качестве диагностических, прогностических или предикторных маркеров.
Ключевые слова: экзосома, член семейства матриксных металлопротеиназ, ММР2, ММР9, колоректальный рак, метаболический синдром
Для цитирования: Юнусова Н.В., Замбалова Е.А., Патышева М.Р. и др. Ассоциированные с полом и метаболическими нарушениями изменения в уровне матриксных металлопротеиназ в экзосомах при колоректальном раке. Успехи молекулярной онкологии 2019;6(3):28-36.
DOI: 10.17650/2313-805X-2019-6-3-28-36
Changes of exosomal matrix metalloproteinases level in colorectal cancer associated with sex and metabolic disturbance
N. V. Yunusova, E.A. Zambalova, M.R. Patysheva, A.A. Dimcha, O. V. Cheremisina, S.G. Afanas'ev, I. V. Kondakova
Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences; 5Kooperativny Pereulok, Tomsk 634009, Russia
The objective is to evaluate the contents of matrix metalloproteinases (MMP) MMP9, MMP2, as well as their inducer EMMPRIN in circulating exosomes of patients with colorectal cancer in relation with clinical and morphological parameters, as well as with the presence of metabolic syndrome to search for promising exosomal markers associated with invasion, metastasis and metabolic disorders. Materials and methods. The study included 40 patients with colorectal cancer (T2—4N0—2M0—1) and 10 control patients. Exosomes of blood plasma were isolated by ultrafiltration with ultracentrifugation. The level of MMP9, MMP2 and their inducer EMMPRIN in exosomes was evaluated by flow cytometry.
Results and conclusion. The level of MMP9-positive exosomes was significantly higher in patients with colorectal cancer compared with patients with colorectal polyps. The proportion of MMP9-negative and triple positive MMP9 +/MMP2+/EMMPRIN+ exosomes, on the contrary, was higher in patients with polyps compared with patients with colorectal cancer. Mixed subpopulation of MMP9+/MMP2-/EMMPRIN-exosomes
prevailed both in patients with colorectal cancer and in control patients. There were no significant differences in the subpopulations ofMMP and EMMPRIN in the exosomes of colorectal cancer patients depending on the age, stage, grade and localization. Gender differences in the occurrence of a triple-positive exosome subpopulation in colorectal cancer patients have been revealed. No relationship was found between the expression of MMP and EMMPRIN in exosomes and the presence of the metabolic syndrome, anthropometric parameters, the level of total cholesterol, low density lipoprotein cholesterol, high density lipoprotein cholesterol. However, the relationships between MMP9+/MMP2-/EMMPRIN-, MMP9+/MMP2-/EMMPRIN- and the level of triglycerides and glucose in blood serum were revealed. Further studies are needed to study the characteristics of exosomes associated with metabolic disorders and the possibility of their use as diagnostic, prognostic, or predictor biomarkers.
Key words: exosome, the member of matrix metalloproteinases family, MMP2, MMP9, colorectal cancer, metabolic syndrome
For citation: Yunusova N. V., Zambalova E.A., Patysheva M.R. et al. Changes of exosomal matrix metalloproteinases level in colorectal cancer associated with sex and metabolic disturbance. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2019;6(3):28—36.
cv
CS
Введение
Колоректальный рак (КРР) в настоящее время является одним из наиболее распространенных видов злокачественных новообразований и занимает 2-3-е место в структуре онкологической заболеваемости в России и большинстве развитых стран.
В настоящее время большое значение в процессах инвазии и метастазирования опухолей придают секре-тируемым внеклеточным везикулам, которые представлены экзосомами (30—100 нм) и микровезикулами (100—1000 нм). Они обнаружены во многих биологических жидкостях, таких как плазма, сыворотка крови, моча, слюна, грудное молоко, спинномозговая жидкость, асцит [1]. Тетраспанины CD9, CD63, CD81 являются экзосомальными биомаркерами и составляют около 12 % всех белков экзосом [2, 3]. Показано, что экзосомы несут различные протеазы, их активаторы и ингибиторы. В процессах опухолевой инвазии и метастазирования наибольшее значение отводят тетраспа-нинассоциированным протеазам, к которым относят, главным образом, А0АМ10, АОАМ17 и матриксные металопротеиназы (ММР) [3]. Секретируемые (ММР1, ММР2, ММР3, ММР7, ММР9, ММР10, ММР13) и мембраносвязанные (ММР14, ММР24, ММР25) ММР выявлены в экзосомах, однако наиболее изучены ММР2 и ММР9. Также в экстраклеточных везикулах выявлен индуктор ММР EMMPRIN (CD147), а также ингибиторы ММР Т1МР1, Т1МР2 и Т1МР3 [4]. Как незрелые, так и зрелые формы ММР2, ММР9, ММР 14, имеющие протеолитическую активность, выявлены в экстраклеточных везикулах, в том числе и в экзосомах, происходящих от опухолевых клеточных линий, включая клеточные линии КРР, а также нетрансфор-мированных клеточных линий. Необходимо отметить, что зрелые формы ADAM-протеаз преимущественно находятся в экзосомах [5, 6]. Субстратами для ММР являются коллаген 4-го типа, эластин, фибронектин и ламинин, а также белки клеточной поверхности — Е-кадгерин, фибрин и интерлейкин 1. Таким образом, они модулируют взаимодействие клеток и внеклеточного матрикса [7]. Высокая внеклеточная активность ММР способствует росту опухоли, тканевой инвазии, ангиогенезу и метастазированию [8]. Перенос экзосомами ММР2, ММР3 и ММР9 увели-
чивает их содержание в отдаленных от первичнои опухоли участках, в частности в лимфатических узлах и ткани легкого [9].
Примерно у 55—60 % больных КРР возникает на фоне метаболического синдрома. В соответствии с нашими ранее опубликованными данными метаболиче-скии синдром обнаружен примерно в 60 % случаев у больных КРР со стадиями II—III и менее распространен при метастатическом КРР [10, 11]. Показано, что экзосомы несут комплекс маркеров, связанных с ожирением и резистентностью к инсулину, а экзосомы, секретируемые адипоцитами, богаты ММР3 и способствуют метастазированию [12, 13]. В настоящее время своиства экзосом при КРР, связанные с ожирением или метаболическим синдромом, не описаны. Однако с учетом распространенности синдрома у больных с локализованными формами КРР представляется актуальным поиск таких экзосомальных маркеров, которые, возможно, будут полезны для диагностики КРР. У трети пациентов с локализованными формами КРР в течение 3 лет возникают рецидивы или развиваются гематогенные метастазы в печень [6]. Поэтому важен поиск молекулярных предикторов гематогенного мета-стазирования у пациентов с локализованным и местно-распространенным КРР в целях персонализации адъ-ювантнои терапии.
Цель исследования — оценка уровня содержания ММР9, ММР2, а также их индуктора EMMPRIN в циркулирующих экзосомах больных КРР и определение возможнои ассоциации протеаз с клиническими и морфологическими параметрами, а также с наличием метаболического синдрома для поиска перспективных экзосомальных маркеров, связанных с инвазией, мета-стазированием и метаболическими нарушениями.
Материалы и методы
Образцы крови пациентов группы контроля (n = 10; возраст 45,3 ± 4,1 года) и больных КРР (n = 40; возраст 58,6 ± 1,6 года) с различными стадиями (T2—4N0—2M0—1) получены в НИИ онкологии ТНИМЦ (г. Томск). В контрольную группу были включены 10 пациентов, обследованных в условиях поликлинического отделения НИИ онкологии ТНИМЦ, у которых при обследовании, в том числе видеоколоноскопии, выявлены
и ш u
ж ш
и
CV
со
us
и ш u
ж ш
и
колоректальные полипы, исключена злокачественная опухоль толстой и прямой кишки, а также другая онкологическая патология. Критериями исключения при формировании группы КРР явились первично-множественные формы КРР, стадия Ia (T1N0M0), а также рак прямой кишки с поражением средне- и нижнеам-пулярного отдела.
Все пациенты с КРР были разделены на 2 подгруппы в зависимости от наличия метаболического синдрома: с метаболическим синдромом (n = 24) и без метаболического синдрома (n = 16). Критерием включения в группу с метаболическим синдромом с учетом рекомендаций Международной федерации диабета (2005) было наличие абдоминального типа ожирения (окружность талии >94 см для мужчин и >80 см для женщин) в сочетании, по крайней мере, с 2 из 4 дополнительных критериев: повышение уровня триглице-ридов в сыворотке крови >1,7 ммоль/л или лечение дислипидемии; снижение уровня холестерина (ХС) липо-протеинов высокой плотности (ЛПВП) <1,03 ммоль/л для мужчин и <1,29 ммоль/л для женщин; высокое артериальное давление (систолическое >135 мм рт. ст. или диастолическое >85 мм рт. ст., или терапия артериальной гипертонии); повышение уровня глюкозы крови натощак >5,6 ммоль/л или выявленный сахарный диабет 2-го типа. Дополнительно у всех больных рассчитывали индекс массы тела по стандартной формуле, соотношение талии и бедер (waist-hip ratio), отражающее тип распределения жира. Уровень общего ХС определяли на биохимическом анализаторе. Клинические и гистологические параметры пациентов представлены в табл. 1. Исследование было одобрено локальным комитетом по медицинской этике НИИ онкологии ТНИМЦ.
Выделение экзосом. Экзосомы плазмы крови выделяли методом ультрафильтрации с ультрацентрифугированием [5]. Выделенные экзосомы ресуспендиро-вали в 350 мкл PBS. Аликвоты экзосом замораживали в жидком азоте и хранили при температуре —80 °С.
Электронная микроскопия экзосом и количественная оценка белка в экзосомах. Для негативного контрастирования образцы экзосом сорбировали на медные сетки с формваровой подложкой, стабилизованной углеродом, в течение 1 мин и 10 с и контрастировали 2 % раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты. Сетки были изучены с использованием просвечивающего электронного микроскопа Jem 1400 (Jeol, Япония), изображения получены с помощью цифровой камеры Veleta (Olympus Corporation, Япония).
Для оценки концентрации белка в экзосомах использовали набор количественного определения Na-noOrange Protein (Molecular Probes, США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Проточная цитометрия. Для выполнения проточной цитометрии 10 мкл (3 х 105 альдегид-сульфатных ла-тексных частиц диаметром 4 мкм (4 %, A37304, Invitro-gen)) отмывали дважды по 100 мкл 0,1 M MES-буфером
Таблица 1. Клинические и гистологические параметры больных КРР Table 1. Clinical and histological parameters ofpatients with CRC
Параметр Parameter n %
Пол, n (%):
Gender, n (%):
мужской 19 47,5
male
женский 21 52,5
female
Возраст, лет:
Age, years:
<59 12 30
>59 28 70
Стадия:
Stage:
неметастатический КРР: 18 45,0
non-metastatic CRC:
T2-4N0M0 17 42,5
T2—4N1—2M0
метастатический КРР 5 12,5
metastatic CRC
Степень дифференцировки:
Differentiation grade:
G1-G2 35 87,5
G3 5 12,5
Метаболический синдром:
Metabolic syndrome:
есть 22 55
present
нет 18 45
absent
Примечание. КРР — колоректальный рак. Note. CRC — colorectal cancer.
(pH 5,5; 3000g, 15 мин) и ресуспендировали в 25 мкл MES-буфера. Затем к 12,5 мкл частиц вносили по 3 мкг моноклональных антител против CD9 (ab134375, Abeam) при комнатной температуре в течение 14 ч при осторожном перемешивании. Аликвоты экзосом (около 30 мкг белка) инкубировали с комплексами антитело — латексные частицы в 100 мкл PBS при температуре 4 °С в течение 14 ч при осторожном перемешивании. Реакцию блокировали 0,2 М глицином в течение 30 мин при 4 °С. Комплексы экзосомы — антитело — латексные частицы дважды отмывали промывочным буфером (PBS с добавлением 2 % бычьей сыворотки, деплетированной от экзосом), инкубировали с блокирующим иммуноглобулином G (BD Biosciences, США) при комнатной температуре в течение 10 мин, отмывали, затем проводили инкубацию с FITC-конъюгированными антителами против тетрас-панинов (CD63, 557288, BD Biosciences, США; CD81, 551108, BD Biosciences, США, CD24, 555427, BD Biosciences, США) при температуре 4 °C в течение 50 мин. Комплексы отмывали дважды промывочным буфером и исследовали образцы на цитометре Cytoflex (Becman
Coulter, США), данные анализировали с помощью программы CytExpert 2.0 Software. Медиана интенсивности флуоресценции (MFI) экзосом была проанализирована по сравнению с изотипическим контролем (BD Bioscience, США) и отрицательным контролем.
Анализ экспрессии ММР и EMMPRIN в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы. Аликвоты экзосом (около 30 мкг белка) инкубировали с 3 х 105 анти-CD9-латексными частицами в 150 мкл PBS при температуре 4 °С в течение ночи при осторожном перемешивании и блокировали в 0,2 М глицине в течение 30 мин, затем окрашивали anti-EMMPRIN (CD147) - APC (5 мл на тест, MAB5047, Abnova, США), anti-MMP2-PE (0,3-0,5 мг на тест, ABIN6170380, Antibodies-online, Германия) и anti-MMP9-FITC (1 мг на тест, ABIN2482809Antibodies-online, Германия, США) в течение 20 мин при комнатной температуре. Проточная цитометрия выполнена на цитометре Cytoflex (Bec-man Coulter, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения CytExpert 2.0.
Статистический анализ. Статистическая обработка данных проведена в программе Statistica 10.0. Данные проанализированы на соответствие выборки нормальному распределению с использованием критерия Шапиро-Уилка. Все данные выражены как средние со стандартными ошибками. Достоверность различий была оценена с помощью U-критерия Манна-Уитни и критерия Краскела-Уоллиса. Различия считались достоверными прир <0,05. Рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена (r). При анализе учитывали только статистически значимые корреляционные связи (p <0,05).
Результаты
Характеристика экзосом плазмы. Экзосомальная природа выделенных везикул была подтверждена при трансмиссионной электронной микроскопии. В препаратах, выделенных из плазмы крови контрольных пациентов и больных КРР, экзосомы визуализировались как четко структурированные частицы чашеобразной формы низкой электронной плотности с сохранной мембраной (рис. 1). В препаратах также присутствовали частицы, не соответствующие экзосомам по морфологии, их размер не превышал 100 нм. Выделенные экзосомы также охарактеризованы методом проточной цитометрии на наличие экзосомальных маркеров (CD24, CD9, CD81 и CD63). Сочетание конъюгиро-ванных и неконъюгированных антител позволяет идентифицировать различные субпопуляции экзосом (рис. 2). CD9/CD24-субпопуляция экзосом преобладала как у больных с колоректальными полипами, так и во всех подгруппах больных КРР. MFI СD9/CD24-популяции в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы больных КРР II стадии, составила 5500 ± 600, больных КРР III стадии - 2400 ± 360 (p <0,05) (рис. 3). Кроме этого, MFI СD9/CD24-популяции в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы больных КРР III
\
«
оо
О
Рис. 1. Общий вид препаратов экзосом, полученных из плазмы крови: а — здорового пациента; б — больного колоректальным раком. На вставках изображены экзосомы. Стрелки указывают на экзосомы, эллипсы — «не-везикулы». Размер шкалы соответствует 100 нм. Электронная микроскопия, отрицательное контрастирование фосфорно-вольфрамовой кислотой
Fig. 1. General appearance of exosome samples retrieved from plasma: а — control patient; б — patient with colorectal cancer. Panels show exosomes. Arrows point at exosomes, ellipses at "non-vesicles". Scale is 100 nm. Electron microscopy, negative contrast with phosphotungstic acid
стадии, была статистически значимо выше, чем у больных метастатическим КРР: 2400 ± 360 и 4000 ± 490 соответственно (см. рис. 3).
Анализ экспрессии ММР и EMMPRIN в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы плазмы крови.
Для анализа экспрессии ММР и EMMPRIN выполняли проточную цитометрию с использованием латекс-ных частиц, покрытых антителами к CD9. Стратегия гейтирования представлена на рис. 3. Поскольку наиболее часто в экзосомах больных КРР и контрольных пациентов экспрессировалась ММР9, акцент в работе сделан на изучение образцов латексных частиц, содержащих ММР9-положительные экзосомы (табл. 2). Выявлено, что ММР9-положительные экзосомы чаще встречались в плазме крови больных КРР, однако образцы частиц, содержащих экзосомы, экспресси-рующие как ММР9, так и ММР2 и EMMPRIN, чаще встречались у пациентов контрольной группы. У пациентов как с колоректальными полипами, так и с КРР
CV
CS
и ш u
ж ш
и
а
б
CV
со
us
и ш u
О
С
О
C09/CD81 МП=Ш0
10г 1J1 10* 10* 110 10' ГГГС-Я
10= 10* II*5 10* icf 1С'
CD9/CD81 MFI-1045
с
о
о 3-
m ^
ю1 in5 ю4 in5 itf m'
101 1tf 104 10s tifi 10'
S '
x ш
U
CD9/CD63 MFI=970
1 nnrq—t г г mil—гтт
ii? 1С3 iij" itf5 irf1 io' FITC-A
CD9/CD81 MFI=1010
з - .
a -
5 -
CD9/C024 MFI=2400
10= 10? 10* 105 Itf 10'
CD9/CD24 MFI=4000
102 IE»5 Iff1 Itf* Itf
Латексные частицы / Beads Латексные частицы + антитела / Beads + antibodies
IB1 Itp1 104 io' 10'
MFI = 145
3
е
103 10* 1 04 105 Itf 10' FITC-A
10= IQr3 10- 10" trf 10 FfTC-A
а
б
в
г
д
Рис. 2. Экспрессия CD63, CD81 и CD24 на CD9-положительных экзосомах плазмы крови здоровых лиц (а), больных колоректальным раком со II стадией (б), больных колоректальным раком с III стадией (в) и больных метастатическим КРР (г). Изотипический контроль и отрицательный контроль (латексные частицы, покрытые антителами к CD9 c CD81 FITC-антителами) (д). Представлены средние значения медианы интенсивности флуоресценции (MFI)
Fig. 2. Expression of CD63, CD81 and CD24 on CD9-positive exosomes from plasma of control patients (а), patients with stage II colorectal cancer (б), patients with stage III colorectal cancer (в) and patients with metastatic colorectal cancer (г). Isotypic control and negative control (latex particles covered in antibodies against CD9 with CD81 FITC-antibodies) (д). Mean values of median fluorescence intensity (MFI) are presented
Все события / All events
Латексные частицы+/Beads+
о mf и* Fit J.
51
Ш ч—
а.
•ь
ипщпц
mm , ' ч - 1 'ИП ■ щ. - 4 iijn
к'
to1 11* it'
ЕЛРЯМАРС.Д
Латексные частицы+/Beads+
10? 1D1 11K1 I OP 10е 1вг МИМИ-1ГС.Д
MMP9+
п ■
о 19"
io* ю1 шг
ММРЙРПВД
MMP9+
■ft: ш
а-
Ifl1
| DJ>F5 1 OJVi ■j-; ' ' . ■
It ly : .'■..'lijiSjg | i ■■■щ : ' v" 3 iijo&r г „ iiJKi
It?
ldf 104 EMPRhAPC.A
i»5
ifl1
Рис. 3. Проточная цитометрия плазменных экзосом: а — прямое светорассеяние (FSC-A) и боковое светорассеяние (SSC-A) комплексов экзосом с альдегид-сульфатнымилатексными частицами; б — экспрессия матриксной металопротеиназы (ММР) ММР9 в образцахлатексных частиц, содержащих экзосомы у контрольных пациентов; в — экспрессия ММР9 в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы у больных колорек-тальным раком; г, д — тройное мечение антителами против ММР9, ММР2 и EMMPRIN образцов частиц, содержащих экзосомы контрольных пациентов (г) и больных колоректальным раком (д)
Fig. 3. Flow cytometry of plasma exosomes: а — forward scatter (FSC-A) and side scatter (SSC-A) of exosome complexes with aldehyde sulphate latex particles; б — expression of matrix metalloprotease (MMP) MMP9 in samples of latex particles containing exosomes in control patients; в — expression of MMP9 in samples of latex particles containing exosomes in patients with colorectal cancer; г, д — triple labeling with antibodies against MMP9, MMP2 and EMMPRIN ofparticles containing exosomes of control patients (г) and patients with colorectal cancer (д)
X ш
и
б
а
в
д
г
доминировали образцы латексных частиц, содержащих экзосомы, экспрессирующие ММР9, но отрицательные по ММР2 и EMMPRIN (до 73 %). Выявлены тендерные различия в экспрессии ММР9 и EMMPRIN у больных КРР. У женщин образцы латексных частиц, содержащих экзосомы с положительной экспрессией ММР и EMMPRIN, встречались чаще, чем у мужчин (0,38 ± 0,06 и 0,20 ± 0,05 % соответственно; р <0,05). Вообще, ММР9-положительные экзосомы у больных КРР также несколько чаще встречались у женщин, однако различия были недостоверными (табл. 3). Не выявлено значимых различий в экспрессии ММР и EMMPRIN в образцах экзосом плазмы крови больных КРР в зависимости от возраста, стадии, степени дифференцировки и локализации опухолевого процесса.
Связь ММР экзосом с метаболическим синдромом и метаболическими нарушениями у больных КРР. В данном исследовании заболеваемость метаболическим синдромом у больных КРР составляла 60 %. Уровни ММР и EMMPRIN в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы, больных КРР был проанализирован не только с наличием метаболического синдрома,
но и с некоторыми антропометрическими параметрами, а также с уровнем глюкозы и липидным спектром сыворотки крови (триглицериды, общий ХС, ХС ли-попротеинов низкой плотности (ЛПНП), ХС ЛПВП). Не выявлено связей экспрессии ММР и EMMPRIN в экзосомах с наличием метаболического синдрома, антропометрическими параметрами, уровнями общего ХС, ХС ЛПНП, ХС ЛПВП. Однако выявлены связи с уровнями триглицеридов и глюкозы в сыворотке крови. Графики рассеяния уровня экспрессии образцов латексных частиц, содержащих экзосомы плазмы крови ММР9+/ММР2-/EMMPRIN- и ММР9+/ ММР2-/ЕММРКТК+, от уровня триглицеридов (г = 0,51 и г = —0,56 соответственно; р <0,05) и от уровня глюкозы плазмы крови (г = —0,60 и г = 0,57 соответственно; р <0,05) представлены на рис. 4.
Обсуждение
Экспрессия ММР и ЕММРКСК в экзосомах при КРР не зависела от стадии заболевания, поэтому маловероятно, что эти биомаркеры в экзосомах могут использоваться в качестве прогностических циркулирующих
CV
со
us
и ш u
Таблица 2. Экспрессия матриксных металопротеиназ (ММР) и их индуктора EMMPRIN в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы у здоровых лиц и больных колоректальным раком, % (m ± M)
Table 2. Expression of matrix metalloproteases (MMP) and their inductor EMMPRIN in samples of latex particles containing exosomes in control patients and patients with colorectal cancer, % (m ± M)
Показатель
Characteristic
Контрольная группа го1 pa
>льные колоректальным ра! Patients with colorectal cancer
MMP9+ 40,0 ± 8,12 60,9 ± 6,86 <0,05
MMP9 - 60,0 ± 7,13 39,1 ± 6,8 <0,05
MMP9+/MMP2+/EMMPRIN+ 0,57 ± 0,12 0,28 ± 0,05 <0,05
MMP9+/MMP2-/EMMPRIN - 72,7 ± 6,66 71,1 ± 2,44 >0,05
MMP9+/MMP2-/EMMPRIN+ 26,8 ± 4,00 28,6 ± 2,00 >0,05
MMP9+/MMP2+/EMMPRIN - 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 >0,05
Таблица 3. Гендерные различия в экспрессии матриксных металопротеиназ (ММР) и их индуктора EMMPRIN (%) в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы, у здоровых лиц и больных колоректальным раком, % (m ± M) Table 3. Gender differences in expression of matrix metalloproteases (MMP) and their inductor EMMPRIN (%) in samples of latex particles containing exosomes in control patients and patients with colorectal cancer, % (m ± M)
Показатель Мужчины Males Женщины Females P
MMP9+ 46,8±7,43 64,6±8,00 >0,05
MMP9- 53,2 ± 7,15 34,4 ± 7,12 >0,05
MMP9+/MMP2+/EMMPRIN+ 0,20 ± 0,05 0,38 ± 0,06 <0,05
MMP9+/MMP2-/EMMPRIN- 72,7 ± 3,17 70,4 ± 3,90 >0,05
MMP9+/MMP2-/EMMPRIN+ 27,1 ± 2,18 29,2 ± 2,00 >0,05
MMP9+/MMP2+/EMMPRIN- 0,02 ± 0,01 0,02 ± 0,01 >0,05
X ш
и
маркеров, полезных для оптимизации адъювантно-го лечения. Однако уровни ММР9-положительных, ММР9-отрицательных и ММР9+/ММР2+/EMMPRIN+ экзосом у пациентов с колоректальными полипами и КРР статистически значимо различались. Таким образом, актуальным является дальнейшее изучение экзосом, экспрессирующих ММР и ЕММРЯГК, для диагностики КРР.
В настоящее время КРР рассматривается как злокачественное новообразование, в значительной степени связанное с метаболическим синдромом [14]. В нашем исследовании не выявлено связей экспрессий ММР и ЕММРЯГК в экзосомах с наличием метаболического синдрома, антропометрическими параметрами, уровнями общего ХС, ХС ЛПНП, ХС ЛПВП, но обнаружены связи с уровнем триглицеридов и глюкозы в сыворотке крови. По-видимому, это связано с моногокомпонентностью метаболического синдрома. В настоящее время выделяют 3-, 4- и 5-компонентный метаболический синдром. Обсуждается вопрос о существовании нескольких патогенетических вариантов метаболического синдрома [11]. По нашим дан-
ным, 15 % больных КРР не имеют метаболического синдрома, но страдают от избыточной массы тела или ожирения без каких-либо других метаболических нарушений или в сочетании только с одним измененным метаболическим параметром. Таким образом, около 75 % больных КРР имеют метаболические нарушения.
Заключение
Уровень ММР9-положительных образцов экзосом был значимо выше у больных КРР по сравнению с больными с колоректальными полипами. Доля ММР9-от-рицательных образцов латексных частиц, содержащих экзосомы, и образцов с положительной экспрессией ММР9, ММР2 и ЕММРКШ, наоборот, была выше у больных с полипами по сравнению с больными КРР. Образцы латексных частиц, содержащих ММР9-по-ложительные экзосомы и отрицательные по ММР2 и ЕММРЯШ, преобладали как у больных КРР, так и в контрольной группе. Не выявлено значимых различий в экспрессии ММР и ЕММРЯШ в образцах латексных частиц, содержащих экзосомы плазмы
85 80
I
1 75 5
§ 70
CN
I 65
5
^ 60 с* о. 5
5 55
50
0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 Триацилглицериды/Гг/'acy/g/ycer/'des
5 6 7
Уровень глюкозы/G/ucose
б
50 45
+ Z
ОС 40 ^
5
§ 35
Т
2
I 30 5
^ 25
CL il 20
15
£Г
Л 35
О-
5
^ 30 +
I 25
5
20
0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 Триацилглицери ды/Tr/acy/g/ycer/des
50 45 40
3
5 6 7
Уровень глюкозы/G/ucose
Рис. 4. Графики рассеяния. Зависимость экспрессии образцов латексных частиц, содержащих экзосомы MMP9+/MMP2—/EMMPRIN— и MMP9+/MMP2—/EMMPRIN+, от уровней триглицеридов (а, б) и глюкозы плазмы крови (в, г)
Fig. 4. Scatter plots. Dependence of expression of latex particle samples containing MMP9+MMP2-/EMMPRIN- and MMP9+MMP2-/EMMPRJN+ exosomes on plasma triglyceride (а, б) and glucose (в, г) levels
крови больных КРР, в зависимости от возраста, стадии, степени дифференцировки и локализации опухолевого процесса. Не обнаружено взаимосвязей экспрессии ММР, EMMPRIN в экзосомах и наличия метаболического синдрома, антропометрических параметров, уровней общего ХС, ХС ЛПНП, ХС ЛПВП. Выявлены корреляционные связи экзосом плазмы крови ММР9+/ MMP2-/EMMPRIN- и MMP9+/MMP2-/EMMPRIN+
с уровнями триглицеридов (г = 0,51 и г = —0,56 соответственно; р <0,05) и глюкозы плазмы крови (г = —0,60 и г = 0,57 соответственно;р <0,05). Необходимы дальнейшие исследования по изучению характеристик экзосом, ассоциированных с метаболическими нарушениями, и возможности их использования в качестве диагностических, прогностических или предиктор-ных маркеров.
CV
ев
и ш u
X ш
и
а
в
г
3
4
8
9
4
8
9
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Li W., Li C., Zhou T. et al. Role
of exosomal proteins in cancer diagnosis. Mol Cancer 2017;16(1):145. DOI: 10.1186/s12943-017-0706-8.
2. Yunusova N.V., Tamkovich S.N., Stakheeva M.N. et al. The characterization of exosome from blood plasma
of patients with colorectal cancer. AIP Conference Proceedings; 2016;1760(1). DOI: 10.1063/1.4960289.
3. Юнусова Н.В., Тугутова Е.А., Тамкович С.Н., Кондакова И.В. Роль тетраспанинов и протеаз экзосом в опухолевой прогрессии. Биомедицинская химия 2018;64(2):123—33. DOI: 10.18097/PBMC20186402123. [Yunusova N.V., Tugutova E.A., Tamkovich S.N., Kondakova I.V. The role of exosomal tetraspanins and proteases in tumor progression. Biomeditsinskaya khimiya =
Biomedical Chemistry 2018;64(2):123-33. (In Russ.)].
4. Shimoda M., Khokha R. Metalloprotein-ases in extracellular vesicles. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 2017;1864(11PtA):1989-2000.
DOI: 10.1016/j.bbamcr.2017.05.027.
5. Tamkovich S.N., Yunusova N.V., Tugutova E.A. et al. Protease cargo in circulating exosomes of breasr cancer and
в ovarian cancer patients. Asian Pac
^ J Cancer Prev 2019;20(1):255-62.
ej DOI: 10.31557/APJCP.2019.20.1.255.
6. Замбалова Е.А., Патышева М.Р., со Димча А.А. и др. Экзомальные
^ протеазы при колоректальном раке.
tiS Успехи молекулярной онкологии
-J 2018;5(4):117-26. DOI: 10.17650/
g 2313-805X-2018-5-4-117-126.
gj [Zambalova E.A., Patysheva M.R.,
«v- Dimcha A.A. et al. Exosomal proteases
in colorectal cancer. Uspekhi molekulyar-
Э noy onkologii = Advances in Molecular
ш Oncology 2018;5(4):117-26. (In Russ.)].
7. Friedl P., Wolf K. Tumour-cell invasion E and migration: diversity and escape
35 mechanisms. Nat Rev Cancer
со 2003;3(5):362-74. DOI: 10.1038/nrc1075.
{¡5 8. Huang K.J., Sui L.H. The relevance
5 and role of vascular endothelial growth
factor C, matrix metalloproteinase-2 and E-cadherin in epithelial ovarian cancer. Med Oncol 2011;29(1):318—23. DOI: 10.1007/s12032-010-9817-4. 9. D'Souza-Schorey C., di Vizio D. Biology and proteomics of extracellular vesicles: harnessing their clinical potential. Expert Rev Proteomics 2014;11(3):251—3. DOI: 10.1586/14789450.2014.874290.
10. Yunusova N.V., Kondakova I.V., Kolomiets L.A. et al. Molecular targets for the therapy of cancer associated with metabolic syndrome (transcription and growth factors). Asia-Pac J Clin Oncol 2017;14(3):134-40.
DOI: 10.1111/ajco.12780.
11. Yunusova N.V., Kondakova I.V., Kolomiets L.A. et al. The role of metabolic syndrome variant in the malignant tumors progression. Diabetes Metab Res
Rev 2018;12:807-12. DOI: 10.1016/j.dsx.2018.04.
12. Eitan E., Tosti V., Suire C.N. et al.
In a randomized trial in prostate cancer patients, dietary protein restriction modifies markers of leptin and insulin signaling in plasma extracellular vesicles. Aging Cell 2017;16(6):1430-3. DOI: 10.1111/acel.12657.
13. Wang J., Wu Y., Guo J. et al. Adipocyte-derived exosomes promote lung cancer metastasis by increasing MMP9 activity via transferring MMP3 to lung cancer cells. Oncotarget 2017;8(47): 81880-91. DOI: 10.18632/oncotarget.18737.
14. Esposito K., Chiodini P., Colao A. et al. Metabolic syndrome and risk of cancer: a systematic review and meta-analysis. Diabetes Care 2012;35(11):2402-11. DOI: 10.2337/dc12-0336.
X ш
U
Вклад авторов
H.В. Юнусова: обзор публикаций по теме статьи, анализ полученных данных, написание текста рукописи;
Е.А. Замбалова: выделение экзосом, проточная цитометрия, статистический анализ, написание текста рукописи;
М.Р. Патышева: проточная цитометрия, обзор публикаций по теме статьи;
А.А. Димча: сбор клинических данных, анализ метаболических нарушений у больных;
О.В. Черемисина: формирование клинической группы больных с колоректальными полипами;
С.Г. Афанасьев: разработка дизайна исследования, анализ полученных данных;
И.В. Кондакова: анализ полученных данных.
Authors' contributions
N.V. Yunusova: reviewing of publications on the article's topic, analysis of obtained data, article writing;
E.A. Zambalova: exosome isolation, flow cytometry, statistical analysis, reviewing of publications on the article's topic, article writing;
M.R. Patysheva: flow cytometry, reviewing of publications on the article's topic;
A.A. Dimcha: collecting of clinical data, analysis of metabolic diturbance
O.V. Cheremisina: formation a group of patients with colorectal polyps;
S.G. Afanas'ev: study design development, analysis of obtained data;
I.V. Kondakova: analysis of obtained data.
ORCID авторов/ORCID of authors
Н.В. Юнусова/N.V. Yunusova: https://orcid.org/0000-0003-4595-4177 Е.А. Замбалова/E.A. Zambalova: https://orcid.org/0000-0003-3698-8455 М.Р. Патышева/M.R. Patysheva: https://orcid.org/0000-0003-2865-7576 А.А. Димча/A.A. Dimcha: https://orcid.org/0000-0002-9551-1908 О.В. Черемисина/O.V. Cheremisima: https://orcid.org/0000-0000-7234-4708 С.Г. Афанасьев/S.G. Afanas'ev: https://orcid.org/0000-0002-4701-0375 И.В. Кондакова/1.V. Kondakova: https://orcid.org/0000-0003-0907-4615
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Администрации Томской области в рамках научного проекта № 18-415-703006.
Financing. The reported research was funded by Russian Foundation for Basic Research and the government of the Tomsk region of the Russian Federation, grant № 18-415-703006.
Информированное согласие. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Informed consent. All patients gave written informed consent to participate in the study.
Статья поступила: 02.07.2019. Принята к публикации: 17.09.2019. Article received: 02.07.2019. Accepted for publication: 17.09.2019.
