CC BY
185
Оригинальные статьи
СТИМУЛЯЦИЯ МЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЭКЗОСОМАМИ ПЛАЗМЫ
Р.Б. Самсонов1, 2, И.М. Коваленко2, Д.А. Васильев2, Е.В. Цырлина2, Г.А. Дашян2, Х. Шоxат-Карвальо3, Д. Карасик3, Л.М. Берштейн2, В.В. Лютынский4, А.В. Малек1, 2
ООО «Онкосистема»; Россия, 194356, Санкт-Петербург, ул. Хошимина, 11/1, 207; 2ФГБУ«НИИонкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России; Россия, 197758, Санкт-Петербург,
пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68; 3Университет им. Бар-Илана; Израиль, 13100, Цфат, ул. Генриеты Сольд, 8; 4ООО «Компания Альгимед»; Беларусь, 220020, Минск, ул. Нарочанская, 11
Введение. Злокачественный фенотип опухолевых клеток и метастатический потенциал опухоли определяются генетическими факторами. В дополнение к ним значимую роль в регуляции структурных и функциональных характеристик злокачественных клеток играют компоненты нормальной биологической среды, в том числе и наноразмерные везикулы, или экзосомы. Цель исследования — изучение механизмов и оценка эффекта влияния экзосом плазмы на клетки рака молочной железы в условиях in vitro.
Материалы и методы. В исследовании использованы культура клеток рака молочной железы MDA-MB-231 и экзосомы, выделенные из плазмы или культуральной среды. Для анализа экзосом применялись методы корреляционной спектроскопии, вестерн-блоттинг. Функциональные эффекты экзосом оценивались в экспериментах in vitro и in vivo.
Результаты. В представленной работе показано, что экзосомы плазмы стимулируют адгезивную и двигательную активность клеток рака молочной железы, потенцируя процесс метастатической диссеминации. Для реализации стимулирующего эффекта достаточно контактного взаимодействия, которое опосредовано фибронектином на поверхности экзосом и цито-плазматическим сигнальным каскадом, зависимым от киназы фокальной адгезии.
Выводы. Углубленное изучение роли экзосом плазмы или межклеточной жидкости в формировании и регуляции злокачественного фенотипа клеток опухоли может открыть перспективы разработки новых методов терапии онкологических заболеваний.
Ключевые слова: рак молочной железы, экзосомы, адгезия, метастазы, фибронектин
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-2-6-15
STIMULATION OF METASTATIC ACTIVITY OF BREAST CANCER CELLS BY PLASMA EXOSOMES
Background. Malignant phenotype of cancer cells and metastatic potency of the tumor are determined by genetic factors. In addition, normal biological environment, including the nano-vesicles or exosomes, plays an important role in regulation of the structural and functional characteristics of malignant cells.
Objective: presented study was aimed to evaluate mechanisms and to estimate effect of interaction of plasma exosomes and breast cancer cells in experimental conditions.
Materials and methods. We used breast cancer cell culture MDA-MB-231 and exosomes isolated from plasma and cultural medium. Exosomes were analyzed by dynamic light scattering method and western blotting. Functional effects of exosomes were evaluated in in vitro and in vivo models.
Results. In the present study we demonstrated that plasma exosomes stimulate the adhesion and the motility of breast cancer cells and induce the process of metastatic dissemination. Contact interaction of exosomes with cell surface is sufficient for stimulatory effect that is mediated by exosomal fibronectin and FAK-dependent signaling cascade.
Conclusions. Further investigation of plasma exosomes structure and functions is required to better understand their input in regulation of malignant cell phenotype. This research has a potential to provide novel approaches for cancer therapy.
Key words: breast cancer, exosome, cell adhesion, metastases, fibronectin
Контакты: Анастасия Валерьевна Малек [email protected]
R.B. Samsonov1'2,1.M. Kovalenko2, D.A. Vasilyev2, E. V. Tsyrlina2, G.A. Dashan2, Ch. Shochat-Carvalho3, D. Karasik3, L.M. Berstein2, V. V. Lutynskij4, A. V. Malek1, 2
1Oncosystem, Ltd.; 11/1—207Hoshimina St., Saint-Petersburg, 194256, Russia; 2Petrov Institute of Oncology; 68 Leningradskaya St., Saint-Petersburg, 197758, Russia; 3Bar-Ilan University; Henrietta Szold 8, Safed, 13100 Israel; 4Company Algimed, Ltd; 11 Narochanskaya St., Minsk, 220020, Belarus
Оригинальные статьи 7
Введение рении [6]. Специфические искажения биохимиче-Экзосомы — один из нескольких типов нанораз- ского профиля циркулирующих экзосом характерны мерных везикул, секретируемых клетками в межкле- для хронических системных заболеваний, включая точное пространство. В биогенезе экзосом имеет болезни нейродегенеративные и центральной нерв-место этап формирования в цитоплазме мультивези- ной системы [7, 8], метаболические нарушения кулярных телец, содержащих множество одинаковых и атеросклероз [9], патологии иммунной системы по составу и размеру микровезикул. На этом этапе [10] и вирусные инфекции [11]. Практический инте-формируются специфические отличия экзосом рес представляет изучение роли экзосом в развитии от других типов везикул (эктосом, апоптотических и прогрессии онкологических заболеваний [12]. телец). Предполагается, что секреция экзосом про- Причем объектом большинства исследований явля-исходит как постоянно (или конститутивно), так ются экзосомы, секретируемые злокачественными и в результате стимуляции различными внутри- клетками [13]. и (или) внеклеточными факторами [1]. Биологиче- Патологические эффекты опухолевых экзосом (ОЭ) ская значимость процессов формирования и секре- были показаны во множестве экспериментальных ции нановезикул точно не определена и является работ. Например, экзосомы, секретируемые клет- предметом активных исследований. С различной ками первичной опухоли поджелудочной железы, степенью уверенности принято считать, что секре- переносятся током плазмы в лимфатические узлы ция экзосом — это способ «очистки» клетки от не- и паренхиму легких, где они индуцируют экспресси- нужных метаболитов, изменения состава клетки онные и морфологические изменения, которые оп- в ходе процесса дифференцировки, модификации тимизируют условия для колонизации этих тканей внеклеточной среды и стромы [2]. Кроме того, в по- циркулирующими опухолевыми клетками и форми- следние годы сформировалась концепция экзосо- рования метастазов [14]. В другой работе было пока- мальной системы межклеточных «коммуникаций». зано, что экспрессионные изменения, индуцируемые Получены разнообразные экспериментальные дока- опухолевыми экзосомами в исходно нормальных зательства того, что экзосомы, попав во внеклеточ- донорских Т-лимфоцитах (CD4+) при культивации ное пространство, могут взаимодействовать с самой in vitro, приводят к потере поверхностных лимфоци- клеткой-продуцентом, соседними или анатомически тарных маркеров (CD69) и снижению функциональ- отдаленными клетками [3]. Таким образом, экзосо- ной активности клеток [15]. Интересно, что наблю- мы, опосредуя межклеточный транспорт ряда проте- даемый эффект не требовал интернализации экзосом инов и нуклеиновых кислот, могут выполнять роль Т-клетками, а был опосредован активацией поверх- комплексного фактора ауто-, пара- и эндокринной ностных рецепторов. В целом, описан ряд механиз- регуляции гомеостаза тканей различных органов мов, с помощью которых экзосомы, секретируемые и систем [4]. Существует несколько механизмов вза- опухолевыми клетками, прямо или опосредовано имодействия экзосом с клеточной поверхностью, влияют на развитие, дифференцировку и функцио- включая различные варианты эндоцитоза, взаимо- нальную активность иммунных клеток, что в резуль- действие с поверхностными рецепторами, слияния тате приводит к угнетению противоопухолевой им- мембран везикулы и клетки и др. (рис. 1). мунной реакции [16]. Изменения работы системы экзосомального Особого внимания заслуживает роль ОЭ в про- транспорта или состава секретируемых клетками цессе модификации соединительной ткани вокруг экзосом наблюдаются при ряде физиологических растущей опухоли путем изменения структуры стро- состояний, например при беременности [5] или ста- мы и активности клеточных компонентов (эндоте- лиоцитов, фибробластов) [17]. Результаты активных о Клатрин (ClathrirO-зависимый эндоцитоз исследований особенностей состава и патологиче- Фагоцитоз ^Активация ских эффектов ОЭ создали почву для разработки Слияние ° ¿РЧ . о поверхностных новых методов диагностики и мониторинга [18]. мембран 0 / # рецепторов Как известно, все (или почти все) клетки орга- экзосом о^ Jjj^ q а низма секретируют экзосомы и в норме экзосомы и клеток С^^^^^^НШ 0 Эндоцитоз могут быть выделены из большинства биологических ц р в зонах липидных рафтов* жидкостей, включая плазму, мочу, ликвор, молоко, V^*' 0 ° синовиальную жидкость и др. Следовательно, на клет-¿л ■, ки растущей опухоли оказывают воздействие экзо-о Микропиноцитоз сомы, секретируемые нормальными клетками окру-Кавеолин (СауеоПп)-зависимый эндоцитоз жающей стромы. Циркулирующие опухолевые клетки Рис. 1. Схематическое изображение механизмов взаимодействия экзо- находятся под воздействием «ШКТСМЯ» экз°с°м плаз-сом с клеткам мы, имеющих различное (преимущественно тромбо-
2'2016 ТОМ 15 | VOL.15 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY
в Оригинальные статьи
цитарное) происхождение. Образование метаста- Целью данного исследования была оценка реак-зов неизбежно сопровождается влиянием экзосом, ции клеток РМЖ на контакт с экзосомами. В ряде секретируемых клетками нормальной ткани, на опу- экспериментов in vitro и in vivo было показано, что холевые клетки в очаге диссеминации. Логично экзосомы стимулируют адгезивную и двигательную предположить, что в дополнение к феномену воз- активность, повышая инвазивный потенциал клеток действия ОЭ на клетки здоровых тканей, опреде- РМЖ. Причем наблюдаемый эффект: a) не зависел ленное значение в патогенезе онкологических забо- от происхождения экзосом, б) предполагал контакт-леваний имеет воздействие, которое оказывают ное взаимодействие молекул фибронектина (ФН) на на клетки опухоли экзосомы, секретируемые клетка- поверхности экзосом и поверхностных рецепторов ми нормальных тканей. Число исследований в этой клетки и в) был опосредован сигнальным каскадом, области существенно меньше по сравнению с коли- который регулируется ферментом — киназой фокаль-чеством работ, сфокусированных на изучении ОЭ. ной адгезии (focal adhesion kinase, FAK). Очевидно, исследования циркулирующих ОЭ ведут к созданию новых диагностических методов, в то Материалы и методы время как разработка новых терапевтических под- Клеточные линии и эксперименты in vitro ходов скорее основывается на коррекции (модуля- В исследовании была использована стабильная ции) эффекта, который оказывают циркулирующие культура клеток РМЖ MDA-MB-231, полученная или тканевые экзосомы на опухолевые клетки. Это из опухолевых клеток плеврального экссудата. Клет-предположение косвенно подтверждается позитив- ки этой линии сохраняют злокачественный (ER-) ным терапевтическим эффектом метода экстра- фенотип на протяжении многократных пассажей корпоральной изоляции экзосом из плазмы крови и культивируются в стандартных условиях: при тем-онкологических пациентов с помощью связывания пературе 37 °С и 5 % содержании СО2 в питательной специфических поверхностных протеинов или гли- среде RPMI-1640 с L-глутамином и 10 % эмбрио-копротеинов антителами или лектинами соответ- нальной сывороткой телят («БиоЛот», СПб). Клетки ственно [19]. Авторы упомянутой работы и ряда линии MDA-MB-231, стабильно экспрессирующие аналогичных ей публикаций объясняют наблюдае- зеленый флуоресцентный белок и РНК-дуплекс, ин-мый эффект преимущественно фактом уменьшения гибирующий экспрессию молекулы FAK, были предо-депрессивного эффекта ОЭ на иммунную систему. ставлены коллегами из Университета им. Бар-Илана Но изоляция экзосом из плазмы не была селектив- (доктором Hava Gil-Henn). При необходимости при-ной, т. е. изолировались все, а не только опухолевые менения среды без экзосом использовалась сыворот-экзосомы, поэтому эффект мог быть обусловлен ка Exo-FBS («SBI», США). Стандартный культураль-и уменьшением активирующего эффекта экзосом ный пластик («ПанЭко», Москва) применялся для плазмы на опухолевые клетки. Некоторые экспери- культивации клеток в адгерентном монослое; для ментальные данные свидетельствуют в пользу этой анализа неадгерентного (суспензионного) роста кле-гипотезы. Например, в эксперименте in vitro было ток пластик предварительно покрывали раствором показано, что экзoсомы сыворотки стимулируют полимера — Poly-HEMA, Sigma-Aldrich (Москва) пролиферацию клеток рака молочной железы (РМЖ) по методу, описанному нами ранее [23]. Пролифера-в условиях отсутствия адгезивного контакта [20]. тивная активность клеток определялась с помощью Секретируемые тромбоцитами экзосомы стимулиру- колориметрического теста CK04-13 Cell Counting ют пролиферацию, адгезию к эндотелиальным клет- Kit-8 («Dojindo Molecular Technologies, Inc.», США). кам, инвазивную активность клеток карциномы Для анализа движения клеток по плоскости была легких [21]. А экзосомы, секретируемые фибробла- использована система IN Cell Analyzer HCA Systems стами, стимулируют рост стволовых клеток коло- («GE Healthcare Life Sciences», США), с помощью ректальной карциномы и повышают резистентность которой проводилось автоматическое фотографиро-этой опухоли к цитостатической терапии [22]. вание клеток каждые 5 мин в течение 8 ч. Получен-В целом, опубликованные данные позволяют пред- ные данные анализировались с помощью программ положить, что «поведение» опухолевых клеток в ряде «ImageJ» (NIH, США) и «Chemotaxis and Migration аспектов регулируется «коктейлем» экзосом, секрети- Tool» («Ibidi GmbH», Германия ). Для оценки способ-руемых клетками нормальных тканей. Следовательно, ности клеток направленно мигрировать в трехмерном экзосомы плазмы могут оказывать влияние на жизне- матриксе были использованы специальные культу-способность и метастатический потенциал циркулиру- ральные камеры (Corning® Transwell® polycarbonate ющих опухолевых клеток. Исследование возможных membrane cell culture inserts), проницаемое дно кото-механизмов и эффектов такого влияния может создать рых покрывалось тонким слоем геля Matrigel Base-основу для разработки новых методов профилактики ment Membrane Matrix («BD Biosciences», США), или терапии метастатической диссеминации. каждая из которых помещалась в лунку 12-луночно-
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY 2 2016 том 15 I VOL.15
Оригинальные статьи
9
го планшета. Среда «внутренней» камеры содержала 0,5 % сыворотки, и в нее помещались клетки. Концентрация сыворотки в среде «внешней» камеры составляла 10 %. Градиент питательных веществ и хемоаттрактантов стимулировал перемещение клеток из внутренней камеры во внешнюю. После 12 ч инкубации клетки, переместившиеся из внутренней камеры, оказывались на нижней поверхности мембраны, где они фиксировались 10 % раствором метанола и окрашивались Bromophenol Blue («Sigma Aldrich», Москва). Клетки фотографировали и подсчитывали в 4 полях зрения для каждого эксперимента.
Данио-рерио (zebrafish) и эксперименты in vivo
В работе была использована линия рыбок данио-рерио (Danio rerio, zebrafish «casper» [24]), у которых в результате гомозиготных мутаций в 2 генах снижено число пигментных клеток, что делает такую модель удобной для экспериментальных трансплантаций. Кроме того, иммунная система эмбрионов в течение первой недели еще недостаточно сформирована для отторжения ксенографтных клеток. Поэтому имплантация опухолевых клеток человека в ходе коротких экспериментов не требует специальных усилий для угнетения иммунитета. Эмбрионы (48 ч после оплодотворения) помещали в раствор трикаина (80—100 мкг/мл) для анестезии и седации за 5—10 мин до инъекции. Адгерентно растущие клетки РМЖ (MDA-MB-231) отделяли от пластика традиционным методом с помощью трипсина, дважды «отмывали» фосфатно-со-левым буфером; после центрифугирования осадок клеток ресуспензировался в буфере, содержащем или не содержащем (контроль) экзосомы. Концентрацию экзосом в суспензии определяли с помощью анализа концентрации белков методом Бредфорда («Bio-Rad Laboratories, Ltd.», США). Клетки РМЖ инкубировались в суспензии экзосом, приблизительно соответствующей концентрации экзосом в плазме. (Методы более точного анализа, например корреляционная спектроскопия, не применимы для таких концентрированных растворов везикул.) После 30 мин инкубации суспензию клеток и экзосом имплантировали в желточный мешок эмбрионов с помощью тонкой стеклянной иглы (диаметром 15 мкм) и автоматической помпы, позволяющей дозировано инъецировать объем суспензии, содержащий 250—300 клеток.
Эффективность имплантации и жизнеспособность эмбрионов оценивались через 30 мин, эмбрионы помещались в лунки 96-луночного планшета и инкубировались еще 2 дня при температуре 35 °С. Каждая экспериментальная группа включала 30 эмбрионов. Результаты (наличие и распределение флуоресцентных клеток) оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа после эвтаназии концентрированным раствором трикаина.
Экзосомы: изоляция, анализ
Экзосомы изолировались из 3 источников: эмбриональной телячьей сыворотки, сыворотки крови пациенток с РМЖ и культуральной среды. В последнем случае клетки культивировались в среде с сывороткой без экзосом Exo-FBS («SBI», США) для исключения контаминации. Для экспериментов in vitro и in vivo экзосомы выделялись классическим методом дифференциального ультрацентрифугирования [25], преимущества и недостатки которого обсуждались в предыдущих наших публикациях [26]. Кратко о методе: плазма (разведение 1:1 с фосфатно-солевым буфером) или среда центрифугировались последовательно в 3 этапа:
1) 2000 х G - 30 мин;
2) 17 000 х G - 60 мин;
3) 100 000 х G - 90 мин.
Первые 2 этапа позволяли осадить клетки и клеточный детрит, при этом экзосомы оставались в су-пернатанте. Экзосомы осаждались в ходе заключительного этапа ультрацентрифугирования в виде светлого осадка, который легко ресуспензировался в изотоническом буфере. Концентрация экзосом оценивалась либо с помощью набора реагентов для соответствующих измерений ExoTEST («Hansa Bio Med», Эстония), либо путем экстраполяции результатов измерения концентрации протеинов методом Бредфорда («Bio-Rad Laboratories, Ltd.», США). Эксперименты in vitro проводились при концентрации экзосом 2 х 1011 везикул/мл, что примерно в 5 раз ниже количества нановезикул в плазме. В ходе эксперимента in vivo инкубация и трансплантация клеток РМЖ проводились в суспензии экзосом, концентрация которых приблизительно соответствовала концентрации нановезикул в плазме: 1 х 1012 везикул/мл.
Метод сравнительного анализа специфических белков (вестерн-блоттинг) описан нами ранее [27]. Кратко о методе: осадки экзосом, полученные после центрифугирования, были лизированы (0,05 моль Tris-HCl, pH 7,4; 0,15 моль NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % SDS) в присутствии смеси ингибиторов протео-лиза P8340 («Sigma Aldrich», США) в течение 30 мин при температуре 4 °C. Лизаты вновь центрифугировали для удаления фрагментов мембран, экстракты протеинов нормализовали методом Бредфорда («BioRad Laboratories, Ltd.», США). Электрофорез проводили в 10 % SDS-PAAG, для нанесения использовался стандартный нередуцирующий буфер. Разделенные электрофорезом белки переносили на поливиниловую мембрану, которую блокировали в течение часа в 0,1 % растворе казеина в трис-солевом буфере с твином-20 и инкубировали с соответствующими антителами: анти-CD63 (ab68418), антифибронекти-ном (ab2413), анти-бета-актином (ab8227), анти-FAK (ab40794) производства компании «Abcam» (США).
10 Оригинальные статьи
Визуализацию блотов проводили с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой anti-rabbit IgG H&L (HRP): ab6721 («Abcam», США), набора Pierce™ ECL Western Blotting Substrate («Termo Fischer Scientific», США) на аппарате LAS-4000 («General Electric», США).
Для оценки размера и анализа свойств поверхности экзосом их изолировали с помощью соответствующих наборов — Immunobeads for Overall Exosome capture («Hansa Bio Med», Эстония). Эти наборы предполагают связывание экзосом антителами (анти-CD9), фиксированными на поверхности латексных частиц размером до 1 мк. Последующее «отмывание» и отделение от частиц позволяет получить препарат экзосом более чистый, чем это возможно путем ультрацентрифугирования. Анализ экзосом проводился на аппарате NanoSight NS300 (Malvern, Великобритания) при нескольких разведениях в соответствии с инструкциями производителя.
Результаты и обсуждение
Стимуляция адгезивной и миграционной
активности клеток РМЖ при контактном
взаимодействии их с экзосомами
Целью 1-го эксперимента было подтверждение результатов, опубликованных ранее J. Ochieng и соавт. [20], в условиях in vitro и in vivo. Мы начали с простого сравнения эффективности адгезии клеток РМЖ (MDA-MB-231) к культуральному пластику в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки с содержанием и без экзосом. Эффект оценивался через час после культивации в суспензии равного количества клеток. Аналогичные эксперименты были проведены с использованием плазмы крови пациенток с РМЖ (содержащей и не содержащей экзосомы), а также в среде с сывороткой без экзосом (содержащей и не содержащей экзосомы, полученные в ходе культивации клеток той же линии). В ходе всех 3 экспериментов присутствие экзосом определяло большую эффективность адгезивного взаимодействия клеток с субстратом (рис. 2, а и б).
Для оценки эффекта, который могут оказывать экзосомы на способность клеток к суспензионному росту, культуральный пластик был покрыт полимером, предотвращающим адгезию клеток (Poly-HEMA). Были протестированы экзосомы из 3 источников: телячьей эмбриональной сыворотки, сыворотки крови пациенток с РМЖ и культуральной среды. Во всех 3 экспериментах наблюдался схожий эффект: в присутствии экзосом клетки образовывали многоклеточные конгломераты сфероидной или неправильной формы в течение 3—4 ч культивации. Фотографии клеток, культивируемых в среде, содержащей экзо-сомы эмбриональной телячьей сыворотки, и в среде без экзосом (контроль) представлены на рис. 2, в и г.
; - \ 1 - V ;
f . 'v.r
' 1 ■ ЯКЯШ
^ЧйЖАЕ
Рис. 2. Эффект воздействия экзосом на адгезивные характеристики клеток РМЖ(MDA-MB-231) in vitro: а, б—рост клеток на адгезивном пластике; в, г — рост клеток на неадгерентном пластике в условиях суспензии; а, в — концентрация экзосом в культуральной среде, эквивалентная 20 % концентрации экзосом в плазме; б, г — отсутствие экзосом в культуральной среде
Сама по себе способность эпителиальных клеток к формированию адгезивных контактов с базальной мембраной и соседними клетками является нормальным свойством, которое имеет тенденцию утрачиваться в результате трансформации. Злокачественный фенотип определяется сочетанием специфических адгезивных характеристик и двигательной активности. Для оценки функционального эффекта воздействия экзосом на клетки РМЖ, мы использовали модель in vivo (эмбрионы данио-рерио, zebrafish), которая позволяла приблизить условия эксперимента к реальной ситуации. Клетки линии MDA-MB-231, экспрессирующие флуоресцентный белок, в состоянии суспензии инкубировали с экзосомами, концентрированными из культуральной среды, и инъецировали в желточный мешок эмбрионов. Наличие клеток РМЖ в теле эмбриона, их пролиферация и локализация оценивались через 48 ч с помощью флуоресцентной микроскопии. Репрезентативные результаты представлены на рис. 3. В присутствии экзосом опухолевые клетки были способны мигрировать из желточного мешка в различные части эмбрионов (рис. 3, а). В контрольной группе (рис. 3, б) флуоресцирующие клетки заметны только в пределах желточного мешка. Эти данные показывают, что экзосомы стимулируют эффективную комбинацию адгезивной и двигательной активности клеток РМЖ, что может определять повышение метастатического потенциала.
Опосредование фибронектином
стимулирующего действия экзосом
Цель следующего этапа работы — количественная оценка наблюдаемых результатов и определение
а
г
Оригинальные статьи 11
/
б ^
Рис. 3. Эффект воздействия экзосом на миграторную активность клеток РМЖ(MDA-MB-231) in vivo. Стрелками показаны флуоресцирующие опухолевые клетки. Суспензия клеток линии MDA-MB-231, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, инъецированная в желточный мешок 2-дневных эмбрионов данио-рерио (фотографии сделаны после 2 дней инкубации): а — инкубация (30мин) и инъецирование клеток в суспенции экзосом в концентрации, соответствующей физиологической концентрации экзосом в плазме; б — инъецирование клеток в растворе фосфатно-солевого буфера (контроль)
механизма, который может лежать в основе стимулирующего действия экзосом на клетки РМЖ.
С учетом динамики наблюдаемого эффекта и данных литературы мы предположили, что контактного взаимодействия экзосом с поверхностью клетки может быть достаточно для реализации стимулирующего действия экзосом. Один из возможных механизмов такого контактного взаимодействия был описан для экзосом, секретируемых клетками мие-ломы [28]. Авторы этой работы показали, что контакт экзосом с клеточной мембраной опосредуется молекулами ФН, фиксированными на поверхности экзо-сом. ФН является мажорным белком плазмы и может неспецифично связываться с поверхностью циркулирующих везикул вне зависимости от их происхождения.
Можно предположить, что циркулирующие опухолевые клетки неизбежно контактируют с экзосо-мами плазмы и экзосомальный ФН может служить медиатором такого контактного взаимодействия. Для проверки этой гипотезы мы обработали экзосо-мы раствором трипсина (фермент класса гидролаз), отмыли фосфатно-солевым буфером и изолировали методом иммунно-аффинной сорбции. По результатам измерений, проведенных методом корреляционной спектроскопии (рис. 4, а), процедура привела к ожидаемому снижению концентрации и некоторому уменьшению размера частиц. Использование дополнительно к этому новой технологии, сочетаю -щей в себе метод корреляционной спектро- и микроскопии, позволило оценить интенсивность излучения, отраженного от поверхности анализируемых частиц. Этот параметр характеризует структуру поверхности. Его изменения показаны по оси z на рис. 4, б. Как видно при сравнении верхней и нижней панелей (рис. 4, б), обработка трипсином привела к существенному изменению структуры поверхности экзосом.
ос
S ^
та ü н i
ф ^
i
о
123 нм
Контроль
96 нм
ос
s ^
та
р
т н
ф ^
н о К
UiMfc w i i- "ЧЯч/д"/^ 1У '1 /■ z /
/ Контроль
z
Трипсин
о н н
ф *
та
О. ^
5 ¡S
- и
та та
6 ^
CQ О
с ь ьт У со он
I X
CQ Ü
S Ф
и CQ
но ф 1=
Трипсин
200 400 600 Диаметр частиц, нм
Ось х: Размер частиц Плазма Культуральная среда
Контроль Трипсин Контроль Трипсин
CD63 (25 кДа)
Фибронектин (25 кДа)
г MDA-MB-231 Контроль FAK-KD
Бета-актин (42 кДа)
FAK (119 кДа)
Рис. 4. Физические и биохимические характеристики экзосом: а, б — результаты анализа экзосом (выделенных из культуральной среды и обработанных трипсином для удаления поверхностного ФН) методом корреляционной спектроскопии на аппарате Nano Sight NS300 («Malvern», Великобритания); а — соотношение размера и концентрации экзосом; б — трехмерный график: по оси z показаны изменения характеристик света, отраженного от поверхности экзосом; в, г — анализ содержания специфических протеинов методом ве-стерн-блоттинга; в — анализ содержания ФН и экзосомального маркера CD63 (контроль) в экзосомах, выделенных из плазмы крови пациенток с РМЖ и культуральной среды; г — анализ содержания FAK и бета-актина (контроль) в клетках РМЖ линии MDA-MB-231
На заключительном этапе эквивалентное количество нативных и обработанных трипсином частиц было сконцентрировано и использовано для анализа содержания экзосомального маркера CD63 и ФН методом вестерн-блоттинга (рис. 4, в). Как предполагалось, инкубация с раствором трипсина привела к разрушению экзосомального ФН, но не повлияла на содержание в препарате трансмембранного тетра-спонина CD63. В совокупности описанные результаты показали, что обработка трипсином приводит к незначительному уменьшению размера, существенному изменению структуры поверхности экзосом и частичному удалению трипсина из их состава. Интересно, что экзосомы из культуральной среды «очистились» от ФН значительно эффективней, чем экзосомы плазмы (правая и левая панели на рис. 4, в).
б
а
в
12 Оригинальные статьи
Это может быть связано с тем, что культуральная среда содержала лишь 10 % сыворотки, которая является источником ФН, поэтому экзосомы из среды содержали меньше ФН, чем экзосомы из плазмы.
Описанная процедура ферментативного разрушения экзосомального ФН была проведена с экзо-сомами, выделенными из плазмы крови пациенток и культуральной среды; после чего эффект таких экзосом на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток РМЖ (МБА-МВ-231) в условиях суспензии был оценен с помощью колориметрического теста. Исследование проводилось 5 дней (рис. 5, а и б): в присутствии экзосом плазменного или культурального происхождения наблюдалась активная пролиферация клеток с достижением «плато» к 4-му дню. В присутствии экзосом, «очищенных» от ФН трипсином, наблюдалась менее активная пролиферация клеток.
Необходимость функциональной активности
нерецепторной киназы фокальной адгезии
для стимулирующего эффекта экзосом
ФН — один из ключевых белков межклеточного матрикса, неколлагеновый структурный гликопро-теин, синтезируемый и выделяемый в межклеточное пространство многими клетками. Его вариант, синтезируемый преимущественно гепатоцитами, существует в растворимой форме и является одним из основный белков плазмы. Вероятно, именно этот тип ФН связывается с поверхностью циркулирующих везикул. Каждая субъединица ФН содержит последовательность Арг-Гли-Асп (ЯОБ), с помощью которой он может присоединяться к клеточным рецепторам.
Наиболее полно изучен механизм взаимодействия плазменного ФН с интегринами [29]. Такое взаимодействие активирует сигнальный каскад, регулирующий многие аспекты клеточного гомеостаза, включая пролиферативную и миграционную активность. Ключевой молекулой, контролирующей работу этих сигнальных путей, является БАК [30]. Патологическая активация этой сигнальной молекулы часто сопровождает процесс малигнизации клеток разных типов [31], включая протоковый эпителии молочных желез [32].
На основе сказанного мы предположили, что БАК может участвовать в передаче (регуляции) активирующего сигнального каскада, который инициируется в результате контакта экзосомального ФН и рецепторных интегринов в составе поверхностной мембраны клеток РМЖ. Для проверки этого предположения, мы использовали клетки той же линии (МБА-МВ-231), в которых экспрессия БАК была стабильно ингибирована на пост-транскрипционном уровне. Активность пролиферации модифицированных и контрольных клеток была оценена в парал-
а
Миграция у Адоешн Пролиф*ряцня
0 1 2 3 4 5
Время инкубации, дни
- экзо из среды - экзо из среды, трипсин
- экзо из плазмы - ►- экзо из плазмы, трипсин -А - РАК-КЭ, экзо из среды -О- среда без экзосом
- РАК-ЭК, экзо из плазмы
Рис. 5. Результаты анализа пролиферативной активности клеток колориметрическим методом в условиях неадгерентного роста. В эксперименте тестировалось действие на клетки линии МВА-МВ-231 экзосом — нативнъа (о), обработанные трипсином (&) и в состоянии инактивации молекулы ТАК (◊). Каждый эксперимент был проведен дважды с использованием экзосом, выделенных либо из культуральной среды, либо из плазмы (что отражено характером заполнения фигур легенды). Контролем служили клетки линии МВА-МВ-231, культивирующейся в условиях среды без экзосом.
лельных экспериментах с использованием интактных или «очищенных» от ФН экзосом, полученных либо из бычьей сыворотки, либо из культуральной среды (схему и результаты эксперимента см. на рис. 5, а и б). Инактивация БАК снижала способность клеток «отвечать» на стимулирующее влияние экзосом вне зависимости от их происхождения. Интересно, что пролиферация модифицированных клеток в присутствии экзосом была несколько выше, чем пролиферация контрольных клеток в среде, содержащей «очищенные» от ФН экзосомы, или в среде без экзо-сом. Это может быть свидетельством существования сигнальных путей, альтернативных БАК-каскаду,
Оригинальные статьи 13
и дополнительных возможностей «трансляции» стимулирующего влияния экзосом.
Стимуляция экзосомами миграционной активности клеток рака молочной железы (MDA-MB-231) in vitro
С целью количественной оценки влияния экзо-сом на адгезивные и миграционные характеристики клеток РМЖ были использованы модели in vitro. Они лишь приближенно отражают реальную ситуацию миграции опухолевых клеток по плоскости (2D) или в толще ткани (3D), но позволяют провести достаточно точные измерения. Например, при культивации на адгезивном пластике клетки «передвигаются» по его плоскости. Это движение характеризуется определенной цикличностью и сопровождается изменением формы, образованием псевдоподий на «лидирующем» крае клетки, формированием «фокальных» контактов клетки с матриксом, «подтягиванием» клетки к переднему краю и т. д. Такое движение приблизительно отражает перемещение клеток вдоль плотных образований типа поверхности эпителия или базальной мембраны. В условиях 2D эксперимента миграцию клетки можно наблюдать в течение длительного периода времени, что позволяет оценить различные характеристики движения (траекторию, перемещение, скорость) (рис. 6, а).
В нашем эксперименте наблюдение проводилось за клетками, которые культивировались в среде содержащей (не содержащей) экзосомы в течение 8 ч.
На рис. 6, б показаны траектории движения 16 клеток после сопоставления точек старта (8 клеток в среде, содержащей экзосомы, 8 — в среде без экзосом) На рис. 6, в представлены сравнительные результаты 3 экспериментов в средах: 1) без экзосом, 2) с натив-ными экзосомами, 3) с «очищенными» от ФН экзо-сомами.
Эти результаты позволяют сделать вывод, что эк-зосомы стимулируют 2D миграционную активность клеток, но стимулирующий эффект зависит от наличия ФН на поверхности экзосом.
Использование камеры, разделенной проницаемой для клеток мембраной и слоем геля, позволяет несколько приблизить условия in vitro эксперимента к реальности (рис. 7, а). Для стимуляции направленного движения клеток из одной камеры в другую был создан градиент питательных веществ и хемокинов (10 % vs. 0,5 % эмбриональной телячьей сыворотки). Как и в предыдущем случае, сравнение проводилось между клетками, которые культивировались в средах: без экзосом, с нативными экзосомами и с «очищенными» от ФН экзосомами. В этом эксперименте были получены аналогичные результаты, которые подтверждают способность экзосом стимулировать 3D миграцию клеток РМЖ и зависимость этого феномена от экзосомального ФН.
б
20
б
30' 2 35' 1 40' о
1 2
' 45
75
в 15 10 5
длина траектории перемещение
2,0 ,х10*з
1,5
- 1,0
0,5
> # 1 _ экзо (-) экзо (+) о
«I. CL г^ Г \ I
Нк- V"
< о \ — '1
-2 -1 0 1 2 3 4см Wi-T-r-i
к 2,0 и
з- S 15
vo ^ 1,5 р0 о 5 0
и ЧО
2 0,5
т
щ экзо (-)
экзо (+) контроль щ экзо (+) трипсин
■ ■
X
Перемещение, мм
Скорость, мкм/с Длина
траектории, мм
н экзо (-) :— экзо (+) контроль _I экзо (+) трипсин
Рис. 6. Анализ миграции клеток РМЖ по плоскости культурального пластика: а — схема эксперимента и обозначение измеряемых параметров; б — изображение траекторий движения клеток (зеленые — в присутствии экзосом, черные — в среде без экзосом) после совмещения точек старта; в — сравнительные результаты усредненной для группы клеток оценки скорости, длины пути и перемещения в течение 8 ч. Статистическая значимость разницы определена по и-критерию Манна—Уитни;р < 0,5(*), р < 0,05(**)
Рис. 7. Анализ миграции клеток РМЖ в трехмерном пространстве: а — схема эксперимента; б—репрезентативные изображения клеток, «прошедших» сквозь мембрану, фиксированных метанолом и окрашенных бром-фенолом на нижней поверхности мембраны; в —сравнительная оценка количества клеток, «прошедших» сквозь мембрану, в 3 параллельных экспериментах. Статистическая значимость разницы определена по и-критерию Манна—Уитни, р < 0,05(**)
Заключение
В практической медицине традиционно принято оценивать клеточный состав циркулирующей крови и биохимический состав плазмы. Это комплексные показатели, которые объективно отражают состояние организма и течение системных заболеваний. Анализ строения, состава и физиологической роли
а
а
в
14
Оригинальные статьи
циркулирующих субклеточных структур был затруднен в силу технических ограничений. В настоящее время, благодаря развитию и широкому внедрению новых технологий спектроскопии и их сочетанию с традиционными методами световой микроскопии, сделаны первые шаги в исследовании наноразмер-ных компонентов крови и других биологических жидкостей. Стало очевидно, что циркулирующие нановезикулы являются важным физиологическим фактором, значимо вовлеченным в патогенез многих заболеваний, включая онкологические [33]. Активность исследований в этой области является косвенным доказательством открывающихся возможностей разработки принципиально новых диагностических и терапевтических методов [34].
В основе данного исследования лежало предположение, что в процессе развития и диссеминации РМЖ имеет значение взаимодействие опухолевых клеток и экзосом межклеточной среды и плазмы. В работе было показано, что контакт с экзосомами изменяет адгезивные характеристики и двигательную активность опухолевых клеток — качества, прямо определяющие
метастатический потенциал опухоли. Кроме того, представленные результаты указывают на то, что стимулирующее влияние экзосом может быть опосредовано лишь контактным взаимодействием и не требует «ин-тернализации» экзосомы. Так как компонентам плазмы свойственно с равной вероятностью адсорбироваться на поверхности всех циркулирующих экзосом, стимулирующий эффект последних может не зависеть от их происхождения и быть относительно универсальным. Кроме того, контактный характер взаимодействия может определять динамику эффекта, а именно: относительно быстрое изменение характеристик клетки в зависимости от окружающих условий.
В целом, представленные результаты указывают на значимость наноразмерных компонентов внутренней среды организма на процесс развития онкологического заболевания. Разработка методов оценки, осмысленного анализа и коррекции состава этих компонентов может быть основой для нового подхода к терапии рака, включая РМЖ с различным ре-цепторным фенотипом и, соответственно, различной чувствительностью к гормональным сигналам.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Kowal J., Tkach M., Thery C.. Biogenesis and secretion of exosomes. Curr Opin Cell Biol 2014;29:116-25.
2. Abels E.R., Breakefield XO. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol 2016;36(3):301-12
3. Mulcahy L.A., Pink R.C., Carter D.R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles 2014;4;3. doi: 10.3402/jev.v3.24641. eCollection 2014. PMID: 25143819.
4. Iraci N., Leonardi T., Gessler F. et al. Focus on Extracellular Vesicles: Physiological Role and Signalling Properties of Extracellular Membrane Vesicles. Int J Mol Sci 2016;6;17(2). pii: E171. doi: 10.3390/ ijms17020171. PMID: 26861302.
5. Mincheva-Nilsson L., Baranov V. Placenta-derived exosomes and syncytiotrophoblast microparticles and their role in human reproduction: immune modulation for pregnancy success. Am J Reprod Immunol 2014;72(5):440-57.
6. Weilner S., Schraml E., Redl H. et al. Secretion of microvesicular miRNAs in cellular and organismal aging. Exp Gerontol 2013;48(7):626-33.
7. Russo I, Bubacco L, Greggio E. Exosomes-associated neurodegeneration and progression of Parkinson's disease. Am J Neurodegener Dis 2012;1(3):217-25.
8. Tsilioni I., Panagiotidou S., Theoharides T.C. Exosomes in neurologic and psychiatric disorders. Clin Ther 2014;36(6):882-8.
9. Huber HJ, Holvoet P. Exosomes: emerging roles in communication between blood cells and vascular tissues during atherosclerosis. Curr Opin Lipidol 2015;26(5):412—9.
10. Buzas EI, Gyorgy B, Nagy G et al. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nat Rev Rheumatol 2014;10(6):356-64.
11. Alenquer M., Amorim M.J. Exosome Biogenesis, Regulation, and Function in Viral Infection. Viruses 2015;7(9):5066-83.
12. Малек А.М., Берштейн Л.М., Филатов М.В., Беляев А.М. Система экзосомальных межклеточных коммуникаций и ее роль в процессе метастатической диссеминации. Вопросы онкологии 2014;60(4):429-36.
13. Tchevkina Е.М., Shcherbakov А.М., Zhuravskaya A.Y. et al. Exosomes and transfer of (epi)genetic information by tumor cells. Advances in Molecular Oncology 2015;3(2):8-20.
14. Rana S., Malinowska K., Zoller M. Exosomal tumor microRNA modulates premetastatic organ cells. Neoplasia 2013;15(3):281-95.
15. Muller L., Mitsuhashi M., Simms P. et al. Tumor-derived exosomes regulate expression
of immune function-related genes in human T cell subsets. Sci Rep 2016;6:20254.
16. Whiteside T.L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. J Clin Invest 2016;126(4):1216-23.
17. Fu H., Yang H., Zhang X., Xu W. The emerging roles of exosomes in tu-mor-stroma interaction. J Cancer Res Clin Oncol 2016;17. PMID: 26987524.
18. Whiteside T.L. The potential of tumor-derived exosomes for noninvasive cancer monitoring. Expert Rev Mol Diagn 2015;15(10):1293-310.
19. Marleau A.M., Chen C.S., Joyce J.A., Tullis R.H. Exosome removal as a therapeutic adjuvant in cancer. J Transl Med 2012;10:134.
20. Ochieng J., Pratap S., Khatua A.K., Sakwe A.M. Anchorage-independent growth of breast carcinoma cells is mediated by serum exosomes. Exp Cell Res 2009;315(11):1875-88.
21. Janowska-Wieczorek A., Wysoczynski M., Kijowski J. et al. Micro-vesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. Int J Cancer 2005;113(5):752-60.
22. Hu Y., Yan C., Mu L. et al. Fibroblast-Derived Exosomes Contribute
to Chemoresistance through Priming Cancer Stem Cells in Colorectal Cancer. PLoS One 2015;10(5):e0125625.
23. Malek A., Catapano C.V., Czubayko F., Aigner A. A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quanti-
Оригинальные статьи
15
fication of metastasis in human xenograft mouse models. Clin Exp Metastasis 2010;27(4):261-71.
24. White R.M., Sessa A., Burke C. et al. Transparent adult zebrafish as a tool for
in vivo transplantation analysis. Cell stem cell 2008;2(2):183-89.
25. Thery C., Amigorena S., Raposo G., Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol 2006;3;Unit 3.22.
26. Malek A.V., Sanmsonov R.B., Chiesi A. Development of cancer diagnostics and monitoring methods based on analysis
of tumor-derived exosomes. Russian Journal of Biotherapy 2015;14(4): 9-18.
27. Samsonov R.B., Shtam T.A., Burdakov V.S. et al. Extraction and analysis of the exosomal micro-RNA from the urine: new method of the prostate cancer diagnostics. Experimental and Clinical Urology 2015;4:28-32.
28. Purushothaman A., Bandari S.K., Liu J. et al. Fibronectin on the Surface
of Myeloma Cell-derived Exosomes Mediates Exosome-Cell Interactions. J Biol Chem 2016;291(4):1652-63.
29. Akiyama S.K. Integrins in cell adhesion and signaling. Hum Cell 1996;9(3):181-6.
30. Schaller M.D. Cellular functions of FAK kinases: insight into molecular mechanisms and novel functions. J Cell Sci 2010;123(7):1007-13.
31. Sulzmaier F.J., Jean C., Schlaepfer D.D. FAK in cancer: mechanistic findings and clinical applications. Nat Rev Cancer 2014;14(9):598-610.
32. Luo M., Guan J.L. Focal adhesion kinase: a prominent determinant in breast cancer initiation, progression and metastasis. Cancer Lett 2010; 289(2): 127-39.
33. Pupyshev A. B. Extracellular v esicles: intercellular information flow and medical applications. Tsitologiia 2015;57(8):551-62.
34. Fais S., O'Driscoll L., Borras F.E. et al. Evidence-Based Clinical Use of Nanoscale Extracellular Vesicles in Nanomedicine. ACS Nano 2016;15.
