CC BY
0ПОИСК ПРОСТЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕСТРУКЦИИ МИКОТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ СПОРОВЫМИ КУЛЬТУРАМИ-
ПРОБИОТИКОВ
1Кутлиева Г. Дж., 2Тураева Б.И., ^Черкасова Г.В., 4Камалова Х.Ф.
1'2'3'4Институт микробиологии АН РУз https://doi.org/10.5281/zenodo.13954852
Аннотация. Потребление загрязненного корма животными и птицами приводят к возникновению хронических микотоксикозов, характеризующихся широким спектром поражения печени, почек, ЖКТ, органов дыхания, нервной системы, что, в конечном итоге, негативно отражается на продуктивности и сохранности поголовья.
Широкая распространенность данного негатива требует скорейшего изыскания путей решения. Даже небольшое количество микотоксинов ослабляет иммунную систему и репродуктивную функцию организма. Почти все предложенные методы детоксикации микотоксинов очень трудоемки, требуют высокотехнологичное оборудование и специализацию сотрудников, что почти недоступно для фермерских хозяйств. Поэтому следует разработать более простые биологические методы деструкции микотоксинов, например, с использованием пробиотических препаратов. В статье представлены простые методы определения деструкции микотоксинов пищевых продуктов в лабораторных условиях.
Ключевые слова: микотоксины, афлотоксин, деструкция микотоксина, лабораторные методы, пробиотики, сухофрукты, безвредность, Bacillus subtilis, Bacillus. licheniformis.
Abstract. Consumption of contaminated feed by animals and birds leads to the development of chronic mycotoxicoses, characterized by a wide range of damage to the liver, kidneys, gastrointestinal tract, respiratory organs, nervous system, which ultimately negatively affects the productivity and safety of livestock. The widespread prevalence of this negative requires the urgent search for solutions. Even a small amount of mycotoxins weakens the immune system and reproductive function of the body. Almost all the proposed methods of mycotoxin detoxification are very labor-intensive, require high-tech equipment and specialized staff, which is almost inaccessible to farms. Therefore, simpler biological methods for the destruction of mycotoxins should be developed, for example, using probiotic preparations. The article presents simple methods for determining the destruction offood mycotoxins in laboratory conditions.
Keywords: mycotoxins, aflatoxin, mycotoxin destruction, laboratory methods, probiotics, dried fruits, harmlessness, Bacillus subtilis, Bacillus.licheniformis.
Не всегда уделяется должное внимание качеству кормового сырья, поэтому любой пробел в этой области наносит экономический ущерб.
Серьезной проблемой комбикормовых предприятий и животноводческих хозяйств является поражение зерна и комбикормов грибами и продуктами их жизнедеятельности микотоксинами (1,2). Использование пробиотических препаратов при микотоксикозах -перспективный способ профилактики кормовых отравлений, который начинает активно применяться в современном птицеводстве и животноводстве и не уступает по
эффективности традиционным сложным приемам. В основе этого метода лежит свойство живых бактерий не только связывать часть токсинов в пищеварительном тракте, но и биохимически модифицировать их до менее опасных соединений (13). Микроорганизмы, имеющие закрепленный в поколении признак деструкции микотоксинов, способствуют максимально интенсивной деградации токсических элементов, что позволяет сократить последствия вынужденного скармливания животному недоброкачественных рационов (5). На основе многих культур пробиотиков создан целый ряд препаратов, применяемых для деструкции микотоксинов. Первое поколение пробиотиков было создано на основе бифидо- и лактобактерий. Они предназначались для профилактики и лечения дисбактериозов кишечника различной этиологии. Эти культуры удаляют из жидких сред микотоксины путем их связывания. (6).
Потребность в биопрепаратах для медицины и ветеринарии с более широким и активным антагонистическим действием привела к созданию второго поколения пробиотиков - самоэлиминирующихся антагонистов, состоящих из спорообразующих бактерий - главным образом рода Bacillus. Например, в препараты «Биотроф-111», «Микосубтил», Бацелл», «Моноспорин» входят спорообразующие бактерии Bac.subtilis. Этот вид бактерий вырабатывает ферменты, разрушающие микотоксины (1,11,12).
Так же, Bac.subtilis продуцирует целый ряд биологически активных веществ, повышающих устойчивость организма животного к негативному действию микотоксинов. При применении данных препаратов за счет их высокой антагонистической активности, ингибируется развитие гнилостной микрофлоры, плесневых грибов - продуцентов микотоксинов, дрожжей. (7,8).
Пробиотические препараты на основе культур рода Bacillus значительно снижают содержание афлатоксина В1. Через 24 часа микотоксин в культуральной жидкости не обнаруживался (9,10). В связи с тем, что биохимические методы деструкции микотоксинов трудоемки, а выполнение многих из них проблематично организовать в обычных условиях, многие исследователи рекомендуют простой тест по аналогии с оценкой чувствительности к антибиотикам. Предполагается, что микотоксины диффундируют в агар, повышают локальную концентрацию ксенобиотика в нем, что является предпосылкой для подавления роста бактерий на поверхности. Однако результат учитывают здесь не по подавлению круговой области просветления (зоны лизиса), а по интенсивности обесцвечивания индикатора резазурина, предварительно введенного в плотную питательную среду (3,4, 5,14,).
Материал и методы.
В работе применили 3 метода деструкции микотоксинов:
1-метод лунок в агаре, как предлагают многие исследователи (4 и др.);
2-метод десятикратных предельных разведений культур-пробиотиков в среде: (МПБ+микотоксин+резазурин) (метод предложенный нами);
3- добавление в среду с микотоксинами исходную КЖ пробиотических культур рода Bacillus (Bacillus. subtilis + Bacillus. licheniformis в соотношении 1:1) для определения времени деструкции микотоксинов.
Материалом исследования служили:
-бациллярные культуры Bacillus.subtilis и Bacillus.licheniformis, проявляющие антагонистические свойства ко многим условно-патогенным культурам, в том числе к Candida albicans;
-культуральная жидкость микрофлоры черного сушеного кишмиша с микотоксинами, профильтрованная через бумажный фильтр.
-рабочий раствор резазурина;
- питательные среды - МПА, МПБ, Чапека.
Кишмиш -К - контрольный вариант - ничем не обработанный;
Кишмиш-О - опытные варианты - трехразовая тщательная обработка кишмиша культурами пробиотиков.
Методы исследования: Применялись общепринятые методы в микробиологии.
Результаты исследования.
Накопление микотоксина:
Оба варианта кишмиша (контрольный и опытный) инкубировали в жидкой среде Чапека (100мл среды + 20 средних ягод кишмиша) при 28оС в течение 15 суток с последующей фильтрацией КЖ через обычный рулонный бумажный фильтр. Фильтрат в дальнейшем применен в качестве «микотоксина».
Метод №1. (Метод лунок)
Твердую среду МПА с резазурином и микотоксином по 20мл разливают в чашки Петри. После ее затвердевания в агаровой пластинке вырезают лунки диаметром 0,8 см в которые вводят смесь (1:1) КЖ двух применимых спороносных бактерий - пробиотиков (Bacillus.subtilis и Bacillus.licheniformis). После входа КЖ спороносных культур в толщу твердой питательной среды - чашки инкубируют при 28оС. Контроль - чашки с такой же средой, н без ввода КЖ исследуемых споровых культур - пробиотиков.
Метод №2 (метод предельных разведений)
Питательную среду МПБ с добавлением в нее резазурина и микотоксина объемом по 4,5 мл разливают в 10 пробирок. 0,5мл КЖ исследуемых споровых культур-пробиотиков (Bac.subtilis и Bac.liсheniformis в соотношении 1:1) вносят в первую пробирку и, методом десятикратных последовательных разведений доводят ее до 10 разведения. Инкубация при 28оС в течение 48 часов. Этот метод показывает:
-антагонистическую активность пробиотиков;
-деструкцию микотоксина по обесцвечиванию среды;
Метод №3. Исходную КЖ пробиотиков добавляли в фильтрат среды после 15 суточной инкубации кишмиша в среде Чапека, в которой находятся микотоксин и резазурин. Данный метод показывает время, за которое происходит деструкция микотоксина (по исчезновению красной окраски фильтрата). У контрольного и опытного варианта был определен титр клеток/мл методом десятикратного последовательного разведения КЖ. (Табл.1)
Титр клеток контрольного и опытного вариантов 15-суточной КЖ после ильтрации
Таблица 1
Варианты опыта Титр клеток /мл
контроль 103
Опыт (трехкратная обработка пробиотиками) 101
Из представленных данных титра клеток видно, что опытный вариант трижды обработанный культурами пробиотиков был почти на уровне стерильности. Титр клеток
составлял всего 100кл/мл. Далее определяли деструкцию микотоксинов в контрольном и опытном вариантах предложенными методами.
Метод 1 (метод лунок в агаре)
В приготовленную плотную среду МПА с температурой 40-42оС ввели рабочий раствор резазурина +профильтрованный через бумажный фильтр КЖ кишмиша -«микотоксин». Среда приобрела интенсивно розовый цвет. После затвердевания среды в агаровой пластинке сделаны лунки диаметром 0,8см в которые внесена КЖ (по 0,05мл в лунку) смеси споровых бациллярных культур-пробиотиков. Контроль - только питательная среда с резазурином + микотоксином. Инкубация при 28оС.
Недостаток этого метода в том, что питательная среда после добавления в нее резазурина и микотоксина стала не очень твердой. Из проделанных лунок было трудно изымать агаровые блоки. Тем не менее, в лунки была введена КЖ (0,05мл) смешанных споровых культур-пробиотиков. Очень быстро (через 1час) в двух вариантах опыта цвет в агаровых пластинках стал бледнеть. Можно предположить, что в довольно мягкой агаровой среде КЖ пробиотиков быстро проникает во всю агаровую пластинку в чашке. В контрольной чашке без добавления спороносных культур пробиотиков розовый цвет среды сохранялся. Таким образом, предположительно, цвет в опытных чашках быстро изменился из-за воздействия и быстрого распространения культур - пробиотиков во всю агаровую пластинку как деструктор микотоксина. (рис.1). Метод лунок в агаре.
На Рис. 1 видна разница в окрашивании агаровой пластинки опытных и контрольных вариантов.
Метод 2 - метод последовательного десятикратного разведения пробиотиков в жидкой среде с резазурином и микотоксином. (предложенный нами).
Жидкая питательная среда МПБ с добавлением резазурина и микотоксина приобрела нежный розовый цвет. Эту среду разлили по пробиркам (4.5мл), в которые методом десятикратных последовательных разведений сделали посев споровых культур-пробиотиков.
На рис. 2 видно, что через 48 часов после однократной обработки кишмиша пробиотиками наблюдается отсутствие роста спор грибов, находящихся в профильтрованном через бумажный фильтр «микотоксине» включительно по 10-5 разведение. Начиная с 6-го разведения выявлен рост грибов на границе «среда-воздух» По-видимому, титр клеток в КЖ пробиотиков влияет на деструкцию микотоксина до пятого разведения. Далее на прорастание спор КЖ пробиотиков уже невоздействует и они
■
спокойно прорастают на границе «среда-воздух». Наличие спор грибов в «микотоксине» объясняется фильтрацией КЖ микрофлоры кишмиша через обычный бумажный фильтр. Тем не менее, преимущество фильтрации КЖ через бумажный фильтр состоит в том, что визуально можно наблюдать (рис.2).
Рис.2. Антагонизм споровых пробиотиков к культурам грибов-продуцентов микотоксина.
Деструкция микотоксина в питательной среде
- антагонизм споровых пробиотиков к грибам - продуцентам микотоксинов;
- угнетение роста слегка проросших спор грибов - продуцентов микотоксинов культурами пробиотиков (пробирки 1-5).
К тому же, в первой пробирке (10-1) наглядно просматривается на поверхности обесцвеченной среды узкое кольцо красного цвета резазурина, что указывает на деструкцию микотоксина спороносными культурами - пробиотиков (рис.2).
В опытном варианте (тройная обработка пробиотиками) после 15 суточной инкубации на среде Чапека в фильтрате выявлен очень слабый титр микофлоры. В 1 мл фильтрата находится 100 клеток грибов. В этом эксперименте был также низкий титр клеток-пробиотиков. В результате наглядно видна деструкция микотоксина в первом разведении.
Рис. 3 Деструкция микотоксина, трижды обработанного сухофрукта - кишмиша пробиотиками.
В опытном варианте (тройная обработка кишмиша пробиотиками) после 15 суточной инкубации на среде Чапека в фильтрате выявлен очень слабый рост микрофлоры. В 1 мл выявлено всего 100 клеток.
Метод 3. Для определения времени, необходимого для деструкции микотоксинов кишмиша культурами пробиотиков, за основу была взята среда Чапека с добавлением в
нее микотоксина и резазурина. В одну пробирку не внесли культуры пробиотиков (Контроль), а вдругую были внены пробиотики. Через 4 часа инкубации при 37оС исчезла красная окраска в среде в опытном варианте. В контрольной пробирке цвет среды не изменился. В литратуре есть ссылка (9,10) что, используя культуру Вас.БиЫШв микотоксин в продукте исчезал через 24 часа, а наши бациллярные пробиотики микотоксин разрушили через 4 часа совместного культивирования их с выделенным микотоксином. (рис.4).
_ _ I < I
'шгш 'Ш щ
Контроль Опыт
Рис.4 Деструкция микотоксина через 4 часа совместного культивирования с пробиотиками.
Рис.5 образцы высущенного кишмиша посеянные для выделения грибов (начало опыта до обработки)
Рис.6 Образцы высущенного кишмиша после обработки пробиотиками.
Конечно, данные методы не отвечают на вопросы какой токсин разрушен. Но он свидетельствует о действенном механизме деструкции микотоксинов и возможных перспективах обработки сухофруктов безвредными пробиотическими бактериями. Методы определения деструкции микотоксинов пищевых продуктов в лабораторных условиях очень просты и доступтны. Главное, результаты можно получить быстро, не используя дорогое оборудование и не имея специальной подготовки, можно обезвредить выработанную продукцию от микотоксинов.
Из изложенного следует, для почти полной утилизации микотоксинов в хранившемся кишмише, требуется не менее 3-х обработок пробиотиками. Таким образом, проверив предложенные методы по деградации микотоксинов кишмиша
пробиотическими культурами рода Bacillus, более информативным показал себя наш методы 2 и 3. Особенно быстро и наглядно проявил себя метод 3. Результаты проведенных исследований представляют огромный интерес и перспективу для использования пробиотиков в целях хранения и обеззараживания сухофруктов и других продуктов питания (рис.5-6). Это очень важно и ценно для увеличения экспортного потенциала нашей Республике по продаже различной пищевой продукции.
ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гулюшин С.Ю, Елизаров И.В. Использование микроорганизмов Bac.subtilis для профилактики микотоксикозов ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии в печати 29.06 2018.
2. Ефимочкина Н.Р., Седова И.Б., Шевелева С.А., Тутельян В.А. Токсические свойства микроскопических грибов. //Вестник Томского Гос. Университета. Биология Биологические науки,2019, №45. С.6-33.
3. Кононенко С.И. Пути снижения влияния неблагоприятных кормовых факторов на организм животных// Ж-л Животноводство и молочное дело. 2016.
4. Шкуратова И., Лебедев И., Рапосова М., Коноплева И., Бусырин П., //Ж-л Ветеринария и Животноводство России Спец выпуск 2013, с. 56-57.
5. Шкуратова И., Лебедева Ряпосова М. Коноплева И. Бусырин П. Профилактика микотаксикозов свиней с использованием пробиотиков. //ГНУ Уральский НИВИ Россельхозакадемии. Г. Екатеринбург, март 2013.
6. Гулюшин С., Елизарова У., Долгорукова А. Пробиотики при микотоксикозе. Энзимы - главный критерий. //Ж-л Комбикорма №12 2018 с. 71-73.
7. Лаптева Г.Ю., Новикова Н.И., Ильин П.А., Йылдырым Е.А., Солдатова В.В. и др. Динамика накопления микотоксинов в силосе на разных этапах хранения. // Ж-л Сельскохозяйственная биология, 2014Ю №6, с.123-130.
8. Иванов Е.Н., Матросов Л.Б., Еремеев И.М., Тримасов Ю.М. Использование биопрепаратов для обезвреживания кормов от микотоксинов //Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных Казань 2010, №1 стр.193.
9. Голельникова С.А., Ларионова О.Р., Васильев А.А., Фауст С.А. Индикация ассоциированной микрофлоры птиц молочнокислых микроорганизмов, способных к деградации микотоксинов. //Ж-л Ветеринарный врач. 2016. ВАК.
10. Габриэль Виндерола, Альберто Ритиени Роль пробиотиков против микотоксинов //Ж-л Исследований пищевых продуктов. Том 4 «1» 2015.
11. Феоктистова Н.Ф., Марданова А.М., Хадиева Г.Ф., Шарипова М.Р. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus в птицеводстве. //Ученые записки казанского университета, сер. Естественные науки (Ветеринарные науки), 2017, Т.159, кн. 1 с. 85107.
12. Иванов Е.Н. Автореф. Дисс. На соик. уч.ст. к.б.н. 20 авг.2009г. «Фармако-токсикологическая и биологическая оценка препарата «Микосубтил» и его эффективность при обезвреживании кормов от микотоксинов»
13. Yan Zhy, Yousef I, Hassan, Dion Lepp, Suguin Shao and Ting Zhou Strategies and Methodologies for Developing Microbial Detoxification System to Mitigate Mycotoxins. //Journal List Toxins (Basel) <V/9(4), 2017 Apr PMC 5408204.
14. Patents. RU2458136 C2 Russia 2010. Способ отбора бактерий рода Lactobacillus для их включения в состав пробиотических препаратов.
15. С.Ю. Горюшин , Р.А. Зернов, Е.В.Елизарова, И.В. Елизаров, С.П.Куликов- авторы патента.
