ИЗУЧЕНИЕ КОНТАМИНАЦИИ СУХОФРУКТОВ ТОКСИГЕННЫМИ ПЛЕСНЕВЫМИ ГРИБАМИ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Original article

FOOD HYGIENE

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2021

Читать онлайн

Минаева Л.П., Полянина A.C., Киселева М.Г., Чалый З.А., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А.

Изучение контаминации сухофруктов токсигенными плесневыми грибами

ФГБУН «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи», 109240, Москва, Россия

Введение. Сухофрукты — ценный источник пищевых волокон, ряда витаминов и минеральных элементов в рационе питания населения. Однако высокое содержание легкодоступных углеводов делает этот вид продукции уязвимым к контаминации плесневыми грибами, наибольшую опасность среди которых представляют токсигенные виды. Но научной информации о загрязнённости сухофруктов, представленных на российском рынке, плесневыми грибами — продуцентами микотоксинов практически нет, что не позволяет судить об этом аспекте безопасности пищи. Материалы и методы. Культуральными методами анализа изучена контаминация плесневыми грибами и бактериями 57 образцов сухофруктов 7 популярных в России видов. Из сухофруктов выделены моноспоровые изоляты плесневых грибов, токсинообразование которых исследовано в условиях in vitro, анализ микотоксинов проводили методом УВЭЖХ-МС/МС в режиме мультидетекции.

Результаты. В целом микробная загрязнённость сухофруктов, в большинстве обусловленная плесневыми грибами, была низкой: 87,7% образцов отвечали установленным микробиологическим нормативам. При этом наибольшей степенью загрязнённости отличались финики. В микофлоре всех видов сухофруктов доминировали виды Aspergillus. Среди выделенных 33 изолятов плесеней 45,5% оказались токсигенными, способными в условиях in vitro к биосинтезу значительных количеств нескольких видов микотоксинов, включая эмерджентные. У штаммов Asspergillus секции Nigri обнаружена фумонизин- и охратоксин-продуцирующая активность. На модельных средах у отдельных штаммов накопление микотоксинов превышало значения, нормируемые в пищевой продукции, в том числе (в мкг/кг): для афлатоксинов B1 — более 32 000 и B2 — 3230, фумонизина B2 — более 3100, охратоксина А — до 4,3; для эмерджентных накопление достигало: стеригматоцистина — до 6218 220 и цитреовиридина — 153. Заключение. Плесневые грибы являются основным видом микрофлоры, контаминирующей сухофрукты. Установлена способность плесневых изолятов из сухофруктов к образованию микотоксинов, среди которых выявлены высокотоксигенные штаммы. Это свидетельствует о наличии потенциального риска загрязнения данного вида пищевой продукции микотоксинами, в том числе не нормируемыми в ней, и возможном увеличении их содержания в рационах потребителей за счёт данного источника. Полученные результаты обосновывают необходимость широкого мониторинга продуцентов микотоксинов в сухофруктах для прогноза риска токсинообразования и связи конкретных микотоксинов с определёнными видами сухофруктов. Наличие токсигенной активности у плесневых грибов, выделенных из сухофруктов, показано в России впервые.

Ключевые слова: токсигенные штаммы; Aspergillus; токсинообразование; in vitro; микотоксины; эмерджентные микотоксины; УВЭЖХ-МС/МС

Для цитирования: Минаева Л.П., Полянина А.С., Киселева М.Г., Чалый З.А., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Изучение контаминации сухофруктов токсигенными плесневыми грибами. Гигиена и санитария. 2021; 100 (7): 717-723. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2021-100-7-717-723

Для корреспонденции: Минаева Людмила Павловна, канд. техн. наук, ст. науч. сотр. лаб. биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи», 109240, Москва. E-mail: [email protected]

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи. Финансирование. Исследование выполнено при финансировании РНФ (грант № 18-16-00077).

Участие авторов: Минаева Л.П. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка результатов микробиологических исследований, написание и редактирование текста, ответственность за целостность всех частей статьи; Полянина А.С., Ефимочкина Н.Р. — сбор и обработка результатов микробиологических исследований; Киселева М.Г., Чалый З.А. — сбор и обработка результатов УВЭЖХ-МС/МС исследований; Шевелева С.А. — редактирование. Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи.

Поступила 08.10.2020 / Принята к печати 18.05.2021 / Опубликована 31.07.2021

Federal Research Centre of Nutrition and Biotechnology, Moscow, 109240, Russia

Introduction. Dried fruits are a valuable source of dietary fibre, many vitamins and minerals in the population's diet. However, the high content of readily available carbohydrates makes this type of product vulnerable to mould contamination. The greatest danger among which are toxigenic species. But there is practically no scientific information about the contamination presented on the Russian market dried fruits with moulds producing mycotoxins. That does not allow judging about this aspect of food safety.

Materials and methods. Contamination with moulds and bacteria of 57 samples of dried fruits of 7 species popular in Russia was studied using cultural methods of analysis. Monospore isolates of moulds were isolated from dried fruits; in vitro mycotoxins production studied; by UHPLC-MS / MS analyzed mycotoxins in the multidetection mode.

Results and discussion. In general, the microbial contamination of dried fruits was low: 87.7% of the samples met the established microbiological standards, in most cases, moulds caused it. At the same time, the highest frequency and levels of contamination were found in dates. Aspergillus sp. dominated in the micoflora of all types of dried fruits. Among the isolated 33 strains of moulds, 45.5% turned out to be toxigenic and, in vitro, were capable of biosynthesis of significant amounts of several types of mycotoxins, including emergent mycotoxins. Fumonisin- and ochratoxin-producing activities have been found in Aspergillus strains of the Nigri section. In model experiments, the accumulation of mycotoxins in individual strains exceeded the level normalized in grain products, including (in ^g/kg): for aflatoxins B1 - more than 32000 andB2 - 3230; fumonisin B2 - more than 3100; ochratoxin A up to 4.3; for emergent accumulation reached: sterigmatocystin up to 6218220 and citreoviridine -153.

Conclusion. Moulds are the main type of microflora that contaminates dried fruits. The ability of mould isolates from dried fruits to form mycotoxins has been established, among which highly toxigenic strains have been identified. This indicates the presence of a potential risk of contamination of this type of food with

Lyudmila P. Minaeva, Anna S. Polyanina, Mariya G. Kiseleva, Zakhar A. Chalyy, Natalia R. Efimochkina, Svetlana A. Sheveleva

Dried fruits marketed in Russian: toxigenic mold contamination

Оригинальная статья

unregulated mycotoxins and a possible increase in their content in the diets of consumers. The results obtained substantiate the need for extensive monitoring of mycotoxin producers in dried fruits. This is important for predicting the risk of toxin formation and identifying the relationship of specific mycotoxins with certain types of dried fruits. The presence of toxigenic activity of moulds isolated from dried fruits has been shown in Russia for the first time.

Keywords: toxigenic strains; Aspergillus; mycotoxins production; in vitro; mycotoxins; emergent mycotoxins; UHPLC-MS/MS

For citation: Minaeva L.P., Polyanina A.S., Kiseleva M.G., Chalyy Z.A., Efimochkina N.R., Sheveleva S.A. Dried fruits marketed in Russian: toxigenic mold contamination. Gigiena i Sanitariya (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2021; 100 (7): 717-723. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2021-100-7-717-723 (In Russ.) For correspondence: Luydmila P. Minaeva, PhD in Technical Sciences, senior researcher at the laboratory of biosafety and nutrimicrobiome analysis, Federal Research Centre of Nutrition and Biotechnology, Moscow, 109240, Russian Federation. E-mail: [email protected] Information about the authors:

Minaeva L.P., http://orcid.org/0000-0003-1853-5735; Polyanina A.S., https://orcid.org/0000-0002-2766-7716; Kiseleva M.G., https://orcid.org/0000-0003-1057-0886 Chalyy Z.A., https://orcid.org/0000-0002-9371-8163; Efimochkina N.R.,http://orcid.org/0000-0002-9071-0326; Sheveleva S.A., https://orcid.org/0000-0001-5647-9709

Contribution: Minaeva L.P. — concept and design of the study, collection and processing of material of microbiological studies, writing and editing of the manuscript, responsibility for the integrity of all parts of the article; PolyaninaA.S., EfimochkinaN.R. — collection and processing of material of microbiological studies; KiselevaM.G., Chalyy Z.A. — collection and processing of material UHPLC-MS/MS research results; Sheveleva S.A. — editing. All authors — approval of the final version of the article. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgement. The study was supported by Russian Science Foundation (grant No 18-16-00077). Received: October 8, 2020 / Accepted: May 18, 2021 / Published: July 31, 2021

Введение

Высушенные фрукты в рационе человека являются источником комплекса витаминов, минералов, углеводов, пищевых волокон, органических кислот, доступным в течение всего года. В последнее время отмечается значительное увеличение удельного веса этого вида продукта в рационе питания населения многих стран, в том числе в РФ. На российском рынке самым востребованным видом таких продуктов является изюм, импортируемый в основном из Ирана, Узбекистана, Турции, Чили, Афганистана, далее по популярности следуют сушёные финики, чернослив и курага [1].

Хотя сухофрукты не относятся к скоропортящимся продуктам, но высокое содержание легкодоступных углеводов делает их уязвимыми к контаминации плесневыми грибами на всех стадиях производства. При вегетации фруктов существует вероятность поражения фитопатогенными видами Fusarium зрр. и Alternaria зрр. [2], а на этапах переработки, транспортировки и хранения сапротрофами — Aspergillus зрр., Penicillium зрр. [3], способными к росту и токсинообразова-нию при низкой влажности и высоком содержании углеводов. Наличие плесневой контаминации не всегда указывает на присутствие микотоксинов (МТ), но всегда повышает опасность их образования. Контаминация продовольственного растительного сырья МТ является одной из наиболее острых проблем безопасности, так как они обусловливают канцерогенное, мутагенное, тератогенное, эстрогенное действие на организм человека, вызывают репродуктивные расстройства и подавление иммунной системы [4, 5]. О масштабах и последствиях контаминации сухофруктов токсигенными грибами косвенно можно судить по отчётам RASFF1, согласно которым МТ неизменно составляют категорию наивысшего риска, и каждый год они входят в десятку опасностей на протяжении последних 10 лет [5]. При этом на долю сухофруктов приходится в среднем около 10% от числа всех уведомлений по превышению нормативов на МТ, фиксируемых в импортируемой в ЕС продукции. Чаще всего эти инциденты связаны с превышением содержания афла-токсинов (AFLs) в инжире, в меньшей степени охратоксина А (ОТА) (преимущественно в изюме, а также кураге, смородине и инжире) [6]. Всё это свидетельствует об активном токсинообразовании на послеуборочных стадиях переработки фруктов, обусловленном развитием токсигенных видов Aspergillus зрр. и Penicillium зрр.

Плесневые грибы способны продуцировать сотни метаболитов. Применение методов на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС/МС) в формате мультидетекции значительно расширило представления о профилях токсичных

1 RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) - Система быстрого оповещения по качеству пищевых продуктов и кормов Европейского союза.

метаболитов плесневых грибов. Так, в исследованиях последних лет среди наиболее распространённых контаминан-тов пищевой продукции — грибов рода Aspergillus, показаны новые виды токсигенной активности. Описана способность некоторых видов Aspergillus секции Nigri продуцировать фу-монизины В2 и В4 (FB2 и FB4) и OTA, которые ранее связывали главным образом с грибами рода Fusarium и с Aspergillus секции Flavi соответственно [7, 8], в связи с высокой токсикологической опасностью этих МТ, существует необходимость в оценке потенциального риска для здоровья людей продукции, контаминированной видами Aspergillus секции Nigri, и в более подробном изучении токсигенных свойств штаммов, выделенных из сухофруктов.

Данные о наличии плесневых грибов в сухофруктах — важный критерий для прогнозирования возможности накопления МТ, а мониторинг продукции в части её контаминации токсигенными видами грибов позволяет оценить их распространённость по группам продукции, регионам происхождения, выявлять новые риски, что составляет основу обеспечения безопасности пищевых продуктов.

Цель настоящего исследования — изучение контаминации сухофруктов, представленных на потребительском рынке РФ, токсигенными плесневыми грибами на фоне микробиологического состояния этого вида продукции.

Материалы и методы

Исследовано 57 образцов сухофруктов: монокомпонентных (финики, абрикос, изюм, инжир, чернослив, яблоки) и смесей сухофруктов (компотные смеси). Образцы сухофруктов отечественного и импортного происхождения (Армения, Таджикистан, Узбекистан, Алжир, Аргентина, Иран, США, Тунис, Турция, Чили) были отобраны из розничной торговой сети Московского региона. Состав многокомпонентных образцов и происхождение представлены в дополнительных материалах (табл. 1П и 2П).

Микробиологический анализ. Микологический посев проводили по ГОСТ 10444.12-20132. Из посевов сухофруктов выделяли моноспоровые изоляты (МСИ) плесневых грибов, таксономическую идентификацию которых проводили по фенотипическим характеристикам в соответствии с Samson и соавт. [9, 10], для морфологически схожих видов указывали принадлежность к секции видов. Количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяли по ГОСТ 10444.15-943, бактерии

2 ГОСТ 10444.12-2013. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчёта количества дрожжей и плесневых грибов [Электронный ресурс]. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200107308 (дата обращения: 16.09.2020).

3 ГОСТ 10444.15-94. Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов [Электронный ресурс]. URL: https://docs.cntd.ru/ document/1200022648 (дата обращения: 16.09.2020).

Original article

Таблица 1П / Table 1Р

Состав многокомпонентных образцов сухофруктов Composition of multicomponent samples of dried fruits

№ образца Sample no

Компонентный состав Component composition

3 Абрикос (урюк), яблоки, груша, вишня, чернослив Apricot (uryuk), apples, pear, cherry, prunes

4 Абрикос (урюк), яблоко сушеное (дольки), вишня сушеная с косточкой, чернослив с косточкой Apricot (uryuk), dried apple (slices), dried cherries with stone, prunes with pits

7 Абрикос (курага), сливы черные, инжир

Apricot (dried apricots), black plums, figs

13 Яблоки, груши, абрикос (курага), чернослив Apples, pears, apricot (dried apricots), prunes

14 Груши, яблоки, шиповник, алыча, абрикос (курага), сливы, изюм Pears, apples, wild rose, cherry plum, apricot (dried apricots), plums, raisins

21 Абрикосы (урюк), виноград, груша, яблоки, чернослив

Apricots (uryuk), grapes, pear, apples, prunes

24 Абрикосы (урюк), виноград черный, груша, яблоки, чернослив с косточкой

Apricots (uryuk), black grapes, pear, apples, prunes with pits

39 Абрикос (урюк), яблоко, черешня с косточкой, груша, чернослив с косточкой, персик, алыча с косточкой

Apricot (uryuk), apple, cherry with stone, pear, prunes with pits, peach, cherry plum with stone

58 Абрикос (урюк), яблоко, груша, алыча, изюм

Apricot (uryuk), apple, pear, cherry plum, raisins

Таблица 2П / Table 2Р

Происхождение образцов сухофруктов Origin of dried fruit samples

Вид сухофрукта Количество образцов Страна происхождения (количество образцов)

Type of dried fruit Number of samples Country of origin (number of samples)

Чернослив 7 Аргентина (1), Армения (1), Чили (1), США (1), «не указано» (3)

Prunes Argentina (1), Armenia (1), Chile (1), USA (1), "not specified" (3)

Яблоки сушеные 3 Российская Федерация (3)

Dried apples Russian Federation (3)

Абрикосы сушеные 9 Таджикистан (3), Турция (2), «не указано» (4)

Dried apricots Tajikistan (3), Turkey (2), "not specified" (4)

Инжир 7 Турция (3), «не указано» (4)

Fig Turkey (3), "not specified" (4)

Компотная смесь 9 Таджикистан (3), Российская Федерация (5), Узбекистан (1)

Compote mixture Tajikistan (3), Russian Federation (5), Uzbekistan (1)

Изюм 11 Узбекистан (1), «не указано» (10)

Raisins Uzbekistan (1), "not specified" (10)

Финики 11 Иран (6), Алжир (2), Тунис (1), «не указано» (2)

Dates Iran (6), Algeria (2), Tunisia (1), "not specified" (2)

группы кишечных палочек (БГКП) по ГОСТ 31747-20124 патогенные, в том числе сальмонеллы, по ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002)5.

Исследование токсинообразования в условиях in vitro проводили на модельных средах: картофельно-сахарозный агар (КСА) (PDA), агар Чапека с дрожжевым экстрактом и сахарозой (CY20S), а также на зерне риса с относительной влажностью 20% [10, 11]. МСИ предварительно культивировали

4 ГОСТ 31747-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) [Электронный ресурс]. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200098583 (дата обращения: 16.09.2020).

5 ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002). Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella [Электронный ресурс]. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200098239 (дата обращения: 16.09.2020).

на среде КСА (7 сут при 24 ± 1 °С), затем делали смыв стерильным физраствором. Полученной споровой суспензией по 0,1 мл инокулировали каждую пробирку с 2 г стерильной питательной среды (в трех повторностях). После инкубирования (12 сут при 27 ± 1 °С) из ферментированной среды (субстратного мицелия) экстрагировали МТ.

Приготовление экстракта из субстратного мицелия для анализа МТ. В каждую пробирку с ферментированной средой вносили по 5 мл экстрагента (ацетонитрил/вода/уксус-ная кислота — 80/20/0,5% об.), перемешивали на вортексе, выдерживали 1 ч в ультразвуковой бане, после чего 1 ч интенсивно встряхивали на шейкере. Далее центрифугировали при 4000 g 10 мин, отбирали 1 мл супернатанта, к которому добавляли 1 мл воды (шПИО), после перемешивания повторно центрифугировали при 10 000 g 10 мин. Супернатант 1 мл переносили в хроматографическую виалу для анализа. В ка-

Оригинальная статья

Таблица 1 / Table 1

Распределение образцов сухофруктов по уровням микробной загрязнённости Distribution of dry fruit samples by microbial contamination levels

Чернослив Яблоки Абрикосы Инжир Компотная смесь Изюм Финики

Prunes Apples Apricots Fig Compote mix Raisins Dates

n = 7 n = 3 n = 9 n = 7 n = 9 n = 11 n = 11

Показатель, КОЕ/г Indicators, CFU/g

Среднее < 5 < 5 < 5

Average

Диапазон значений < 5 < 5 < 5

Range of values

Плесени (дрожжи) Mold (yeast)

6

< 5-40

83

1.3 • 104

< 5 - (5.4 • 102) < 5 - (1.4 • 105)

5.7 • 102 (1.7 • 103*)

< 5 - (4 • 103) (1.7 • 103*)

Уровни загрязнения Contamination levels

Число образцов по уровням загрязнения Number of samples by contamination levels

< 5 5-500 > 500

2(10*) 5 (0*) 4 (1*)

Среднее Average

Диапазон значений Range of values

Количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов Total Mesophilic Aerobic end Facultative Anaerobic Microbial Count (TMAFaMC)

< 15 < 15 1.1 • 103 7 4 2 • 103 25

1.1 • 104

< 15 < 15 < 15 - (7.3 • 103) < 15 - (2.6 • 102) < 15 - (7.5 • 103) < 15 - (7.5 • 103) < 15 - (1.2 • 105)

Уровни загрязнения Contamination levels

Число образцов по уровням загрязнения Number of samples by contamination levels

< 15 15-5 • 104 > 5 • 104

Примечание. * — дрожжи. КОЕ — колониеобразующие единицы. Note. * yeasts. CFU - Colony Forming Units.

честве отрицательного контроля использовали экстракты стерильных питательных сред. Стандартное отклонение для трёх повторностей (посевов на питательные среды) анализа микотоксинов в экстрактах из субстратного мицелия составляло 7,4%, получено с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel.

Определение 28 микотоксинов проводили методом УВЭЖХ-МС/МС в режиме мультидетекции по методике, приведённой в [12]. Определяемые аналиты: альтенуен (ALT), альтернариол (АОН), AFL (B1, В2, G1 и G2), 3- и 15-ацетил дезоксиниваленол (3- и 15-AcDON), боверицин (BEA), дезоксиниваленол (DON), диацетоксискирпенол (DAS), а- и ß-зеараленол (а- и ß-ZEL), зеараленон (ZEN), метиловый эфир альтернариола (АМЕ), неосоланиол (NeoS), ОТА, стеригматоцистин (STC), тентоксин (TE), T-2 токсин (Т-2), HT-2 токсин (HT-2), T-2 триол (T-2 triol), фузаренон Х (4-ацетил ниваленол) (FusX), фумонизины В1 и В2 (FB1 и FB2), цитреовиридин (CTV), энниатины А, В (ENN A, B). Для исключения влияния матрикса и получения ложнополо-жительных результатов стандарты МТ разводили в экстрактах соответствующих питательных сред.

Результаты

Определение микробной загрязнённости сухофруктов. На

первом этапе оценивали контаминацию сухофруктов плесневыми грибами, а также бактериальный фон. В РФ и стра-

нах ЕАЭС, согласно техническому регламенту «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011)6, установлены требования к микробиологической безопасности сухофруктов в отношении грибной микрофлоры, обладающей потенциалом токсинообразования: содержание плесневых грибов и дрожжей — 500 КОЕ/г, не более; а также бактериальной, характеризующей общее гигиеническое состояние производства: КМАФАнМ - 5 • 104 КОЕ/г, не более; БГКП - в 0,1 г не допускается; патогенные, в том числе сальмонеллы, в 25 г не допускаются.

Результаты микробиологических исследований 57 видов сухофруктов отечественного и импортного происхождения представлены в табл. 1. По содержанию плесневых грибов наиболее контаминированными оказались финики из Ирана, в 4 из 6 образцов до 4 • 103 КОЕ/г; в изюме только в 1 образце из Узбекистана было значительное превышение — 1,4 • 105 КОЕ/г; в 1 образце компотной смеси, расфасованном в РФ, также было незначительное превышение — 5,4 • 102 КОЕ/г. По дрожжам превышение норматива было только в 1 из 2 образцов фиников из Алжира -

6 ТР ТС 021/2011. О безопасности пищевой продукции: технический регламент Таможенного союза / утв. Решением Комиссии Таможенного союза от 9 декабря 2011 года № 880 [Электронный ресурс]. КОДЕКС: электронный фонд правовой и нормативно-технической документации. URL: https://docs.cntd.ru/document/902320560 (дата обращения: 20.11.2019).

Original article

Таблица 2 / Table 2

Характеристики токсигенных грибов, выделенных из сухофруктов Characteristics of toxigenic molds isolated from dried fruits

Число изолятов: всего/токсигенных Содержание в образце, КОЕ/г Content in the sample, CFU/g Видовой состав жизнеспособных плесневых грибов (количество изолятов) Происхождение Содержание МТ в питательных средах MT content in nutrient substrate

Number of isolates: total / toxigenic Species composition of viable moulds (number of isolates) Origin > ПКО*, мкг/кг** > LOQ*, ^g/kg** < ПКО (следы) < LOQ (traces)

Инжир / Fig

1/1 101 Aspergillus section Flavi (1) н/д (n/d) AFLB2: 1,85-56 AFLG2: 21 -

Компотная смесь / Compote mix

7/4 101 Aspergillus section Nigri (1) Таджикистан / Tajikistan FB2: 565-3116 -

101 Aspregillus spp. section Nigri (1) н/д (n/d) - -

101 Aspergillus section Ochraceorosei (Flavi) (1) РФ / RF AFLB1: 32980; AFLB2: 3230; STC: 702

101 Aspergillus section Flavi (1) РФ / RF AFLB2: 0,45 -

101 Aspregillus section Flavi (1) РФ / RF - STC

101 Penicillium spp. (2) Таджикистан / Tajikistan - -

Финики / Dates

18/5 102 Aspergillus section Ochraceorosei (1) Иран / Iran STC: 237000-6218000 -

102 Aspergillus section Nigri (1) Иран / Iran OTA: 4,3 -

101 Aspergillus section Nigri (1) н/д (n/d) OTA: 0,22

101-102 Aspergillus section Nigri (11) Иран / Iran (10), Тунис / Tunisia (1) - -

103 Aspergillus section Flavi (1) Иран / Iran - STC

102 Penicillium spp. (1) Иран / Iran OTA: 3,1; CTV: 153 -

102 Penicillium spp. (1) н/д (n/d) - -

102 Penicillium spp. (1) Иран / Iran -

Изюм / Raisins

7/1 102 Aspergillus section Flavi (1) н/д (n/d) - STC

101-102 105 *** Aspergillus section Nigri (6) РФ / RF (3) н/д (n/d) (3) - -

Примечание. * — ПКО предел количественного обнаружения; ** — количество МТ приведено в пересчёте на 1 кг питательного субстрата; (***) — только в одном образце; «—» — МТ не обнаружены; н/д — нет данных.

Note. * - LOQ Limit of Quantitation; ** - the amount of MT in ^g / per kg of nutrient substrate; *** - only in one sample; "-" - MTs were not found; n/d - no data. STC - sterigmatocystin.

1,7 • 103 КОЕ/г. При этом все образцы сушёных чернослива, яблок, абрикосов и инжира независимо от региона происхождения отвечали гигиеническим требованиям.

Определение бактериальной контаминации важно при оценке общего гигиенического состояния производства и характеризует условия сбора, переработки и транспортировки. Кроме того, в природных ареалах спорообразующие бактерии являются антагонистами плесневых грибов в борьбе за субстрат, подавляя их развитие и токсинообразование. По полученным результатам 56 из 57 исследованных образцов соответствовали нормативу по КМАФАнМ, превышение обнаружено только в 1 образце фиников из Алжира — 1,2 • 105 КОЕ/г. Бактериальная контаминация была обусловлена преимущественно спо-рообразующими бациллами Bacillus зрр. Ни в одном образце не были выявлены на нормируемом уровне БГКП и патогены рода Salmonella. В целом установленным микробиологическим требованиям безопасности не соответствовали 7 из 57 (12,3%) образцов. Наибольшие уровни и частота плесневого и бактериального загрязнения выявлены у фиников.

Исследование токсигенных свойств плесневых грибов в условиях in vitro. На втором этапе для исследования токсигенных свойств плесневых контаминантов сухофрук-

тов из микологических посевов были отобраны 33 изолята плесневых грибов, из которых: Aspergillus секции Nigri — 21 (63,6%), Aspergillus секции Flavi — 5 (15%), Aspergillus секции Ochraceorosei (Flavi) — 2 (6%) и Penicillium зрр. — 5 (15%).

Моноспоровые изоляты плесневых грибов культивировали на трёх видах питательных сред, рекомендованных для контроля токсинообразования [9], а также на стерильном зерне риса [11]. Экстракты субстратного мицелия анализировали по 28 аналитам, включающим регламентируемые и эмерджентные МТ. В табл. 2 представлены данные по числу токсигенных изолятов, уровню присутствия в образце (в пределах логарифмического порядка), видовому составу, происхождению и максимальным количествам МТ, накопленным в модельных средах. Самые высокие уровни токсинообразования были получены на зёрнах риса — на субстрате с минимальной влажностью (20%).

Наибольшее число токсигенных изолятов — 5 — было выделено из фиников, меньше — 4 — из компотной смеси и по одному из инжира и изюма. Среди изолятов Aspergillus секции Nigri были обнаружены продуценты: ОТА — 2 штамма, FB2 — 1 и остальные 18 нетоксигенные; из изолятов Aspergillus секции Flavi продуценты: AFLs (B2, G2) — 2 штамма и STC — 3;

Оригинальная статья

совместная продукция AFLs (В1, B2) и STC была у 2 штаммов Aspergillus секции Ochraceorosei (Flavi), а среди Penicillium зрр. один штамм продуцировал ОТА и CTV и 4 были нетоксигенные.

Обсуждение

Анализ микробиологического состояния 57 образцов семи видов сухофруктов (шесть монокомпонентных и одна смесь) отечественного и импортного происхождения в основном показал соответствие установленным в ТР ТС 021/2011 микробиологическим требованиям безопасности: в 50 образцах из 57 (87,7%). В 6 из 7 не соответствующих образцов основным источником контаминации были плесневые грибы, а в одном дрожжи и общее количество микроорганизмов. Наиболее загрязнённым видом сухофруктов среди исследованных как по количеству плесеней, так и бактерий оказались финики.

Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, в частности в исследовании Ozer H. и соавт. [14] отмечено, что плесень вносит наибольший вклад в порчу сухофруктов. Если влажность сушёных фруктов колеблется от 2 до 22% в зависимости от вида фруктов [14], то большинство сухофруктов обладают достаточно низкой активностью воды, высокой кислотностью и содержанием сахаров, получаемых в результате сушки. В таких условиях рост бактерий практически прекращается, но возможен рост ксерофиль-ных микромицетов, плесневых грибов. Однако плесень вносит наибольший вклад в порчу сухофруктов [15].

Среди 57 исследованных образцов только в 20 (35%) обнаруживался рост плесневых грибов, из них в 17 максимальные уровни контаминации определяли виды Aspergillus секции Nigri. В меньших количествах были представлены другие виды ми-кромицетов, в том числе Aspergillus зрр., Penicillium sрp., Alternaria sрp., среди которых есть продуценты опасных МТ и ЭМТ.

Изучение токсинообразования плесневых грибов позволяет получить более полные знания о метаболитных профилях конкретных видов, хемотипах, а также с учётом видоспецифично-сти токсинпродуцирующей способности является одним из инструментов при установлении видовой принадлежности. Эти данные также важны для понимания источников происхождения МТ и для последующей разработки стратегий контроля и предотвращения загрязнения пищевой продукции.

Полученные результаты показали способность изолятов Aspergillus секции Nigri (A. niger), выделенных из фиников

(2 штамма) и смеси сухофруктов (1 штамм), продуцировать ОТА 0,22 и 4,3 мкг/кг, а также FB2 3116 мкг/кг соответственно. Выявление ОТА- и FB-производящих видов в популяции Aspergillus секции Nigri описано сравнительно недавно, в исследованиях последнего десятилетия сообщалось об их обнаружении в инжире, винограде и других фруктах. Среди чёрных аспергилл преобладающим продуцентом ОТА в винограде считается A. carbonarius, с меньшей частотой встречаются A. niger и А. tubingensis. Описан морфологически схожий с A. niger вид A. welwitschiae, выделенный из винограда и изюма в Италии и Турции, способный к одновременному производству FB2 и OTA, что обусловлено наличием генов, кодирующих как продукцию FB2, так и OTA [13, 16, 17]. Чёрные аспергиллы имеют широкое распространение, а FB-продуцирующие Aspergillus niger в отличие от Fusarium spр. способны к токсинообразованию при минимальной влажности даже в высушенных фруктах. Это вызывает настороженность, учитывая потребление сухофруктов населением разного возраста, так как обычно сухофрукты не рассматриваются как источник поступления в организм человека этих микотоксинов.

У трёх штаммов была выявлена AFL-продуцирующая способность. Два из которых были отнесены к Aspergillus секции Flavi: из инжира накапливал AFLB2 — до 56 и AFLG2 21 мкг/кг, а из компотной смеси — AFLB2 0,45 мкг/кг. Способность к одновременному биосинтезу AFLs типов В и G была подтверждена, в частности для A. parasiticus и A. nomius [18]. В исследованиях сушёных фиников и черносливе, загрязнённых АFLs, A. parasiticus был преобладающим видом [13]. Третий AFL-токсигенный штамм, выделенный из

компотной смеси, продуцировал очень высокие количества AFLB1 - 32 980 мкг/кг и AFLB2 - 3230 мкг/кг и одновременно в меньшей степени STC - 702 мкг/кг. Известно, что STC является биогенным предшественником AFLB1, но не все продуценты афлатоксинов способны к совместному их накоплению. Такая способность установлена для A. ochraceoroseus и A. rambellii секции Ochraceorosei [19, 20] а также A. nidulans, A. mottae и A. togoensis секции Flavi [18].

Изолят из фиников показал самые высокие среди всех МТ количественные уровни, накопление STC достигало 237 750-6 218 220 мкг/кг. Свехпродуктивность STC была описана для вида A. rambellii секции Ochraceorosei [20].

ОТА-продуцирующая способность была выявлена также у штамма рода Penicillium, выделенного из фиников, ОТА 3 мкг/кг. Основными ОТА-продуцирующими видами этого рода являются P. verrucosum и P. nordicum, однако одновременное накопление CTV - 0,153 мг/кг, характерное для P. islandicum, P. citreonigrum, P. smithii, P. manginii, P. miczynskii [21], требует более глубокого изучения видовой принадлежности этого изолята. Окончательная видовая идентификации может быть установлена только после проведения генетических исследований.

В совокупности из 33 плесневых изолятов 15 (45,5%) были токсигенными. Надо отметить, что МТ, продуцируемые на модельных средах в условиях in vitro, не всегда обнаруживаются в исходных образцах, такие наблюдения описаны и другими исследователями [22]. Это может быть обусловлено комплексом внешних и внутренних факторов влияющих на продукцию токсинов в естественной среде, дискретной загрязнённостью образцов, а также, возможно, преобладанием в популяции атоксигенных штаммов.

Полученные результаты показали, что среди плесневых грибов, контаминирующих сухофрукты (реализуемые в торговой сети), присутствуют виды Aspergillus sрp., обладающие высоким потенциалом токсинообразования и в благоприятных условиях способные к накоплению высоких и сверхвысоких уровней различных МТ, в том числе эмерджентных. Это свидетельствует о наличии потенциальной опасности в загрязнении МТ данного вида продукции. И подтверждает актуальность проведения широкого мониторирования содержания МТ в сухофруктах, реализуемых на российском рынке, для последующего обоснования введения нормативных показателей контроля МТ в сухофруктах и гармонизации с европейскими требованиями по ОТА и AFL.

Заключение

Плесневые грибы являются основным видом микрофлоры, контаминирующей сухофрукты, при этом виды с высоким природным содержанием сахаров (финики) наиболее подвержены загрязнению плесенями как по частоте, так и по уровням загрязнения. В большинстве исследованных образцов сухофруктов, загрязнённых плесенями, грибы Aspergillus секции Nigri доминировали по частоте и по уровням содержания. Среди них выявлены штаммы с фумонизин- и охратоксин-продуцирующей активностью, у которых накопление FB2 было сопоставимо с продукцией у типичных продуцентов - грибов рода Fusarium, а также ОТА - с уровнем, продуцируемым видами Penicillium sрp. В условиях in vitro установлена способность выделенных из сухофруктов плесеней к накоплению высоких и сверхвысоких количеств МТ, среди которых наиболее опасные и регламентируемые в пищевой продукции, а также эмерджентные. Это свидетельствует о наличии потенциального риска загрязнения данного вида пищевой продукции микотоксинами, в том числе не регламентируемыми в ней, и возможном увеличении их содержания в рационах потребителей за счёт данного источника. Полученные результаты обосновывают необходимость широкого мониторинга продуцентов микотоксинов в сухофруктах для прогноза риска токсинообразования и связи конкретных микотоксинов с определёнными видами сухофруктов. Наличие токсигенной активности у плесневых грибов, выделенных из сухофруктов, показано в России впервые.

Original article

Литература

(п.п. 5-11, 13-22 см. References)

Анализ рынка сушеных овощей, грибов, сухофруктов и орехов в России в 2014-2018 гг., прогноз на 2019-2023 гг. Available at: https://businesstat.ru/ images/demo/dried_vegetables_fruits_nuts_mushrooms_russia_2019_demo_ businesstat.pdf

Исаева Е.В., Шестопал З.А. Атлас болезней плодовых и ягодных культур. Киев: Урожай; 1991.

Гарибова Л.В., Лекомцева С.Н. Основы микологии: Морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов. М.: КМК; 2005. Тутельян В.А., Кравченко Л.В. Микотоксины (Медицинские и биологические аспекты). М.: Медицина; 1985.

Чалый З.А., Киселева М.Г., Седова И.Б., Минаева Л.П., Шевелева С.А., Тутельян В.А. Изучение контаминации сухофруктов микотоксинами. Вопросы питания. 2021; 90(1): 33-9. https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-1-33-39

3

4

2

References

1. Analysis of the market for dried vegetables, mushrooms, dried fruits and nuts in Russia in 2014-2018, forecast for 2019-2023. Available at: https://busi-nesstat.ru/images/demo/dried_vegetables_fruits_nuts_mushrooms_rus-sia_2019_demo_businesstat.pdf (in Russian)

2. Isaeva E.V., Shestopal Z.A. Atlas of Diseases of Fruit and Berry Plant [Atlas bolezneyplodovykh iyagodnykh kul'tur]. Kiev: Urozhay; 1991. (in Russian)

3. Garibova L.V., Lekomtseva S.N. Basics of Mycology: Morphology and Taxonomy of Fungi and Fungi-Like Organisms [Osnovy mikologii: Morfologiya i sistematika gribov i gribopodobnykh organizmov]. Moscow: KMK; 2005. (in Russian)

4. Tutel'yan V.A., Kravchenko L.V. Mycotoxins: Medical and Biological Aspects [Mikotoksiny (Meditsinskie i biologicheskie aspekty)]. Moscow: Meditsina; 1985. (in Russian)

5. Agriopoulou S., Stamatelopoulou E., Varzakas T. Advances in occurrence, importance, and mycotoxin control strategies: prevention and detoxification in foods. Foods. 2020; 9(2): 137. https://doi.org/10.3390/foods9020137

6. RASF, The Rapid Alert System for Food and Feed. Reports and publications. Available at: https://ec.europa.eu/food/safety/rasff/reports_publications_en

7. Nielsen K., Mogensen J., Johansen M., Larsen T., Frisvad J. Review of secondary metabolites and mycotoxins from the Aspergillus niger group. Anal. Bioanal. Chem. 2009; 395(5): 1225-42. https://doi.org/10.1007/s00216-009-3081-5

8. Heperkan D., Moretti A., Dikmen C.D., Logrieco A.F. Toxigenic fungi and mycotoxin associated with figs in the Mediterranean area. Phytopathol. Medi-terr. 2012; 51(1): 119-30. https://doi.org/10.14601/Phytopathol_Mediterr-9467

9. Samson R.A., Noonim P., Meijer M., Houbraken J.A.M.P., Frisvad J.C., Varga J. Diagnostic tools to identify black aspergilli. Stud. Mycol. 2007; 59: 129-45. https://doi.org/10.3114/sim.2007.59.13

10. Samson R.A., Visagie C.M., Houbraken J., Hong S.B., Hubka V., Klaassen C.H., et al. Phylogeny, identification and nomenclature of the genus Aspergillus. Stud. Mycol. 2014; 78, 141-173. https://doi.org/10.1016Asimyco.2014.07.004

11. Han X., Jiang H., Xu J., Zhang J., Li F. Dynamic fumonisin B2 production by Aspergillus niger intented used in food industry in China. Toxins (Basel). 2017; 9(7): 217. https://doi.org/10.3390/toxins9070217

12. Chalyy Z.A., Kiseleva M.G., Sedova I.B., Minaeva L.P., Sheveleva S.A., Tutel'yan V.A. Dried fruits marketed in Russia: multi-mycotoxin contamination. Voprosy pitaniya. 2021; 90(1): 33-9. https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-1-33-39 (in Russian)

13. Ozer H., Imge H., Basegmez O., Ozay G. Mycotoxin risks and toxigenic fungi in date, prune and dried apricot among Mediterranean crops. Phytopathol. Mediterr. 2012; 51(1): 148-57. https://doi.org/10.14601/Phytopathol_Mediterr-9806

14. Vinson J.A., Zubik L., Bose P., Samman N., Proch J. Dried fruits: excellent in vitro and in vivo antioxidants. J. Am. Coll. Nutr. 2005; 24(1): 44-50. https://doi.org/10.1080/07315724.2005.10719442

15. Rico-Munoz E., Samson R.A., Houbraken J. Mould spoilage of foods and beverages: Using the right methodology. Food Microbiol. 2019; 81: 51-62. https://doi.org/10.1016/j.fm.2018.03.016

16. Trucksess M.W., Scott P.M. Mycotoxins in botanicals and dried fruits: A review. Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo. Risk Assess. 2008; 25(2): 181-92. https://doi.org/10.1080/02652030701567459

17. Daskaya-Dikmen C., Heperkan D. Fumonisin production of black Aspergilli in vitro, fumonisin and ochratoxin A production in figs of positive strains and their growth assessment. Toxin Rev. 2013; 32(1): 10-7. https://doi.org/10.3109/15569543.2012.756524

18. Frisvad J.C., Hubka V., Ezekiel C.N., Hong S.B., Novakova A., Chen A.J., et al. Taxonomy of Aspergillus section Flavi and their production of afla-toxins, ochratoxins and other mycotoxins. Stud. Mycol. 2019; 93: 1-63. https://doi.org/10.1016/j.simyco.2018.06.001

19. Cary J.W., Ehrlich K.C., Beltz S.B., Harris-Coward P., Klich M.A. Characterization of the Aspergillus ochraceoroseus aflatoxin/sterig-matocystin biosynthetic gene cluster. Mycologia. 2017; 101(3): 352-62. https://doi.org/10.3852/08-173

20. Frisvad J.C., Skouboe P., Samson R.A. Taxonomic comparison of three different groups of aflatoxin producers and a new efficient producer of aflatoxin B1, sterigmatocystin and 3-O-methylsterigmatocystin, Aspergillus rambellii sp. nov. Syst. Appl. Microbiol. 2005; 28(5): 442-53. https://doi.org/10.1016/j.syapm.2005.02.012

21. Moretti A., Susca A., eds. Mycotoxigenic Fungi: Methods and Protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press; 2017.

22. De Souza Ferranti L., Fungaro M.H.P., Massi F.P., da Silva J.J., Penha R.E.S., Frisvad J.C., et al. Diversity of Aspergillus section Nigri on the surface of Vitis labrusca and its hybrid grapes. Int. J. Food Microbiol. 2018; 268: 53-60. https://doi.org/10.1016/]. ijfoodmicro.2017.12.027