Индикация из ассоциированной микрофлоры птиц молочнокислых микроорганизмов, способных к деградации микотоксинов

Горельникова Е.А.; Ларионова О.С.; Васильев А.А.; Фауст Е.А.; Семенов С.В.; Кузнецов М.Ю.; Аникеев Е.В.

ЕГЕПШАРНЫЙ

Врач

УДК 579.62

индикация из ассоциированной микрофлоры птиц молочнокислых микроорганизмов, способных к деградации микотоксинов

'Е.А.Горельникова - кандидат биологических наук, доцент; 1О.С.Ларионова - доктор биологических наук, заведующий кафедрой;

А.А.Васильев - доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующий кафедрой;

1Е.А.Фауст - кандидат биологических наук, доцент; 2С.В.Семенов - руководитель научно-исследовательской лабораторией; 'М.Ю.Кузнецов - кандидат сельскохозяйственных наук, доцент; 'Е.В.Аникеев - аспирант.

'ФГБОУ ВО«Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова», г.Саратов (4'00'2, г.Саратов, Театральная пл.,', тел. +7 (452) 26-54-33, e-mail: larionova'@mail.ru).

2ООО «ВИК-Здоровьеживотных», г.Саратов (410005, г.Саратов, ул. Соколовая, 335,

тел. +7(8452) 75-42-78, e-mail:[email protected]).

По оценке продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН экономический ущерб, причиняемый микроскопическими грибами и их микотоксинами, только в результате потерь урожая достигает 16 млрд. долларов в год. В настоящее время дезактивация микотоксинов микроорганизмами является одним из эффективных способов борьбы с микотоксикозами. Среди различных микроорганизмов, обладающих потенциальной возможностью к биодеградации микотоксинов, молочнокислые бактерии рассматриваются как наиболее перспективная группа. В связи с вышеизложенным, целью исследования явилось выделение из ассоциированной микрофлоры сельскохозяйственных птиц молочнокислых микроорганизмов, способных к деструкции микотоксинов. Материалы и методы. Молочнокислые микроорганизмы выделяли из содержимого слепой и подвздошной кишок цыплят в возрасте 3, 5, 7 и 14 дней. Отобранные на основании культуральных и морфологических свойств 42 штамма бактерий р.Lactobacillus и р.Enterococcus совместно культивировали с афлатокси-ном В1 и микотоксином Т-2 в течение 7 суток. Остаточное содержание микотоксинов определяли с помощью ИФА с использованием тест-систем RIDASCREEN@FASTAflotoxin и RIDASCREEN@FAST T2-Toxin (R-Biopharm AG, Germany). Результаты исследований. Выделено 2 штамма бактерий р. Enterococcus, снижающие в среде содержание афлатоксина В1 (на 76,9% и на 82,2%) и один штамм р.Enterococcus - токсин Т-2 на 43,7%. Микроорганизмы, имеющие закреплённый в поколении признак деструкции микотоксинов, способствуют максимально интенсивной деградации токсических элементов, что позволяет сократить последствия вынужденного скармливания птице недоброкачественных рационов. Заключение. Таким образом, разработка пробиотических препаратов на основе выделенных нами штаммов, с целью профилактики кормовых отравлений у животных имеет несомненную актуальность и практическую значимость.

ключевые СлоВА: микотоксикоз, микотоксин, афлотоксин, трихотецин, молочнокислые микроорганизмы.

Микотоксины представляют собой токсичные химические вещества, производимые микроскопическими грибами. Микотоксины негативно влияют на здоровье животных, действуя на работу печени, почек, ЦНС, снижают эффективность работы иммунной системы, а также антиоксидантной защиты организма. Экономический ущерб от мико-токсикозов обусловлен снижением продуктивности животных и их воспроизводительной способности; эффективности усвоения кормов и их использования на производство сельскохозяйственной продукции; повышением восприимчивости животных к заболеваниям; увеличением материальных затрат на лечение и профилактические мероприятия; ухудшением качества получаемой продукции, а в случае превышения допустимых концентраций микотоксинов - ее полной непригодности к использованию; угрозой здоровью человека в случае обнаружения

микотоксинов в мясе, яйцах, молоке и других продуктах животноводства.

Для обезвреживания микотоксинов на практике применяют следующие методы: физические (очистка, вымачивание, промывание, нагревание, растворение), химические (окисление, обработка бисульфатом, аммиаком, формальдегидом), связывание (адсорбция алюмосиликатами, бентонитами, цеолитами и т.п.), биологические (действие ферментов, в том числе микробных). Недостатком обработки зерна деконтаминирующими факторами является необходимость удаления остатков химических агентов, наличие которых в кормах нежелательно, и продуктов трансформации микотоксинов во избежание обратных реакций и реакций активации.

Среди различных микроорганизмов, обладающих потенциальной возможностью к биодеградации мико-токсинов, молочнокислые бактерии рассматриваются

как наиболее перспективная группа естественных биологических антагонистов микотоксинов. Литературные данные показывают, что многие молочнокислые бактерии могут ингибировать плесени, а некоторые имеют потенциальную возможность взаимодействовать с микотоксинами [1]. Некоторыми авторами показаны фунгицидные свойства некоторых молочнокислых микроорганизмов [2].

В литературном обзоре N.Blagojev и др. [1] приведён анализ противогрибковых метаболитов, продуцируемых молочнокислыми бактериями. К таким метаболитам относятся: органические кислоты, рутерин, перекись водорода, гидроксилированные жирные кислоты, фенольные соединения. Органические кислоты, такие как молочная, уксусная, пропионовая и фенилмолочная, действуют на плазматические мембраны грибов, нейтрализуя электрохимический потенциал и увеличивая их проницаемость [3, 4]. Рутерин - продукт брожения глицерина, способен подавлять активность рибонуклеазы. Противогрибковая активность рутерина была выявлена против видов Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Aspergillus и Fusarium [5]. Противогрибковая активность перекиси водорода связана с сильным окислительным влиянием на липидную мембрану и клеточные белки организма-мишени [6].

Некоторые авторы в последние два десятилетия рассматривали способы биологической деградации микотоксинов микроорганизмами Flavobacterium aurantiacum, Corynebacterium rubrum, Aspergillus niger, Rhizopus spp., Mucor spp. и др. [7, 8]. Было показано, что эти микроорганизмы ферментативно разрушали микотоксины, но некоторые продукты ферментативного расщепления этих бактерий токсичны и оказывают негативное влияние на качество корма.

В изученной нами литературе имеется незначительное количество данных о механизме дезактивации микотоксинов микроорганизмами, участвующими в пищевом брожении, такими как дрожжи и молочнокислые бактерии. Одним из процессов дезактивации микотоксинов молочнокислыми микроорганизмами, может быть ингибирование биосинеза микотоксинов. X.Gourama [9] продемонстрировал возникновение метаболита, который ингибирует накопление афлатокси-на в бесклеточных экстрактах Lactobacillus. В литературе имеются также сведения о способности штаммов молочнокислых микроорганизмов (L.rhamnosus GG, L.rhamnosus LC-705, L.brevis и L.sanfranciscensis) связывать некоторые микотоксины [10, 11, 12]. S.Fuchs et al. [13], были проведены исследования по деток-сикации двух микотоксинов - охратоксина и патулина молочнокислыми бактериями. Авторами из тридцати различных штаммов молочнокислых микроорганизмов по способности деградировать данные микотоксины из жидкой среды были определены два высокоэффективных штамма: L.acidophilus VM 20 и Bifidobacterium ат^ю^ VM 12.

Таким образом, имеются объективные предпосылки предполагать эффективность использования молочнокислых микроорганизмов для профилактики микотоксикозов [14]. Включение в рацион животных добавок с молочнокислыми микроорганизмами будет способствовать ограничению их всасывания и купированию токсического эффекта [15].

Исходя из вышеизложенного, разработка новых приемов профилактики микотоксикозов, основанных на современных представлениях о биодеградации микотоксинов микроорганизмами и позволяющих при разумных затратах сохранять продуктивность животных и качество сельскохозяйственной продукции, является актуальным направлением исследований.

Цель исследования: выделение из ассоциированной микрофлоры сельскохозяйственных птиц микроорганизмов, способных к деструкции микотоксинов.

Материалы и методы. Исходя из изученной нами литературы, бактерии рода Lactobacillus обладают потенциальной способностью разлагать микотоксины. Margee Lee et al. в своих [16] исследованиях показали, что наибольшее количество молочнокислых микроорганизмов, и в частности бактерий Lactobacillus spp., встречается в подвздошной и слепой кишке цыплят возраста 3-14 дней.

Нами были взяты 25 цыплят из фермерского хозяйства Саратовской области. В возрасте 3, 5, 7 и 14 дней производили убой и вскрытие, затем осуществляли забор содержимого подвздошной и слепой кишки исследуемой птицы. Высев содержимого кишечника производили на специальную среду для выделения лактобацилл Lactobacillus MRS Agar (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., india). Посевы инкубировали в аэробных условиях при температуре (37,0±1) °С в течение 3-4 суток. В процессе роста микроорганизмов на питательных средах изучали их культуральные свойства. Морфологию бактериальных клеток изучали в мазках, окрашенных по Грамму. Наблюдали грамм-положительные палочки и кокки, предположительно родов Lactobacillus и Enterococcus.

Из посевов на чашках Петри отбирали отдельные колонии микроорганизмов и пересевали на специальную жидкую среду Lactobacillus MRS Broth (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., india).

Для отбора штаммов микроорганизмов-ассоци-антов желудочно-кишечного тракта цыплят, способных к деструкции микотоксинов готовили специальную экспериментальную систему: в 5 мл стерильной среды Lactobacillus MRS Broth добавляли по 100 мкл микотоксинов: афлатоксина В1 в концентрации 13,3 мкг/мл и токсина Т-2 в концентрации 12,3 мкг/ мл. В каждую пробирку добавляли по 200 мкл соответствующей взвеси бактериальной культуры изучаемых штаммов микроорганизмов. Содержимое пробирок инкубировали при температуре (37,0±1) °С в течение 7 суток. Затем содержимое пробирок

центрифугировали при 5000 об./мин., надосадоч-ную жидкость отбирали и использовали в постановке иммуноферментного анализа для определения остаточного содержания микотоксинов. В качестве тест-систем для иммуноферментного анализа для определения микотоксинов использовали тест-системы RIDASCREEN@FAST Aflotoxin и RIDASCREEN @FAST T2-Toxin (R-Biopharm AG, Germany). По значению оптической плотности стандартных образцов

при длине волны 450 нм строили калибровочную кривую в полулогарифмической системе координат и по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению каждой пробы находили концентрацию афлатоксина В1 и токсина Т-2.

Результаты исследований. Данные по деградации микотокисинов в среде с чистыми культурами молочнокислых микроорганизмов представлены на рисунках 1 и 2.

Концентрация афлатоксина В1

100 80 60 40 20

ш

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

Номера штаммов

Рис. 1. Содержание афлатаксина В1 в среде после 7-дневной инкубации с чистыми культурами молочнокислых микроорганизмов, выделенных из ЖКТ цыплят возраста 3-14 дней.

Примечание. Проба № 1 - контроль, без добавления в среду микроорганизмов.

Концентрация микотоксина Т-2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

Номера штаммов

Рис. 2. Содержание микотоксина Т-2 в среде после 7 инкубации с чистыми культурами молочнокислых микроорганизмов, выделенных из ЖКТ цыплят возраста 3-14 дней.

Примечание. Проба № 1 - контроль, без добавления в среду микроорганизмов.

Как видно из диаграмм, наибольшей способностью к разрушению микотоксинов обладали штаммы № 30 и 37 в отношении афлатоксина В1 и штамм № 43 в отношении токсина Т-2. Штамм № 30 был способен снижать содержание афлатоксина В1 в среде на

76,9%, штамм № 37 - на 82,2% относительно контроля. Добавление штамма № 43 в среду культивирования приводило к снижению содержания токсина Т-2 на 43,7% относительно контрольных значений.

Штамм № 30 был выделен из желудочно-кишечно-

120

0 -

1400

800

600

J 400

200

0

го тракта цыплёнка в возрасте 3 суток. Исследование морфологических признаков показало наличие в мазках кокков, располагающихся парами или цепочками, окрашенных грамположительно. Колонии на среде MRS мелкие, 1-2 мм, бежевые, блестящие, с ровными краями и мягкой консистенции.

Штаммы № 37 и № 43 были выделены из подвздошной кишки цыплят в возрасте 7 суток. Исследование культуральных и морфологических признаков показало сходство с ранее выделенным штаммом № 30: грамположительные кокки, располагающиеся цепочками. Колонии на среде MRS мелкие, 1-2 мм, бежевые, блестящие, с ровными краями и мягкой консистенции.

Анализ литературных данных о морфологических и культуральных свойствах молочнокислых микроорганизмов и сопоставление их с характеристиками штам-

мов, выделенных из ЖКТ цыплят и способных расти на среде MRS, позволили предположительно их отнести к роду Enterococcus, сем. Enterococcaceae.

заключение. Известно, что микроорганизмы, имеющие закреплённый в поколении признак деструкции микотоксинов, способствуют максимально интенсивной деградации токсических элементов, что позволяет сократить, а в некоторых случаях и полностью нивелировать, последствия вынужденного скармливания птице недоброкачественных рационов, что напрямую отражается как на зоотехнических, так и на экономических показателях.

Таким образом, считаем целесообразным разработку пробиотических препаратов на основе полученных нами штаммов с целью профилактики кормовых отравлений у животных.

Литература

1. Control of mould growth and mycotoxin production by lactic acid bacteria metabolites / N.Blagojev [et al.] // Romanian Biotechnological Letters. - 2012. - V. 17, № 3. - P. 7363-7373.

2. Dalie, D.K.D. Lactic acid bacteria - potential for control of mould growth and mycotoxins / D.K.D.Dalie, A.M.Deshamps, F.Richard-Forget // Food Control. - 2010. - V. 21, № 3. - P. 370-380.

3. Antifungal attributes of lactic acid bacteria / V.K.Batish [et al.] // Critical Reviews in Biotechnology. - 1997. - V. 17, № 2. - P. 2009-2225.

4. Purification and characterization of novel antifungal compounds from sourdough Lactobacillus plantarum strain 21 B / P.Lavermicocca [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - V. 66, № 5. - P. 4084-4090.

5. In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri / T.C.Chung [et al.] // Microbial Ecology in Health and Disease. - 1989. - V. 2, № 3. - P. 137-144.

6. Lindgren, S.E. Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentations / S.E.Lindgren, W.J.Dobrogosz // FEMS Microbiology Reviews. - 1990. - V. 87, № 2. - P. 149-163.

7. Bata, A. Detoxification of mycotoxin contaminated food and feed by microorganisms / A.Bata, R.Lasztity // Trends in Food Science & Technology. - 1999. - V. 10, № 2. - P. 223-228.

8. Styriak, I. Microbial binding and biodegradation of mycotoxins / I.Styriak, E.Concova // Veterinary & Human Toxicology. - 2002. - V. 44, № 1. - P. 358-361.

9. Gourama, H. Growth and aflatoxin production of Aspergillus flavus in the presence Lactobacillus species: dissertation / H.Gourama. - Ph.D.:University of Nebraska-Lincoln, 1991. - 54 р.

10. Binding rather tan metabolism may explain the interaction of two food-grade Lactobacillus strains with zearalenone and its derivative alpha zearalenol / H.S.El-Nezami [et al.] // Food Protection. - 1998. - V. 61, № 1. - P. 446-448.

11. Ability of diary strains of lactic acid bacteria to bind aflatoxin M1 in a food model / M.Pierides [et al.] // Food Protection. - 2000. - V. 63, № 5. - P. 645-650.

12. Piotrowska, M. The limitation of ochratoxin A by lactic acid bacteria strains / M.Piotrowska, Z.Zakowska // Microbiology. - 2005. - V. 54, № 3. - P. 279-286.

13. Detoxification of patulin and ochratoxin A, two abundant mycotoxins, by lactic acid bacteria / S.Fuchs [et al.] // Food and Chemical Toxicology. - 2008. - V. 46, № 5. - P. 1398-1407.

14. Гончаренко, A.A. Трансформация Т-2 токсина микроорганизмами кишечника in vitro / A.A.Гончаренко // Успехи медицинской микологии. - 2003. - Т. 1. - С. 132-133.

15. Шевелева, С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса / С.А.Шевелева // Вопросы питания. - 1999. - № 2. - C.32-39.

16. Microbial dinamics of the broiler intestinal tract / M.D.Lee [et al.] // The Elanco Global Enteritis Symposium, Greenfield, Indiana, July 9-11, 2002. - Greenfield, Indiana, 2002. - Р. 54-62.

DETECTION OF LACTIC ACID BACTERIA CAPABLE TO DEGRADE MYCOTOXINS IN AVIAN ASSOCIATED MICROFLORA

1Gorelnikova E.A. - Candidate of Biological Sciences; 1Larionova O.S. - Doctor of Biology;

1 Vasiliev A.A. - Doctor of Agricultural Science, professor; 1Faust E.A. - Candidate of Biological Sciences; 2Semionov S.V. - Head of research laboratory; 1Kuznetsov M.U. - Candidate of Agriculture

Sciences; 1Anikeev E.V. - postgraduate.

1N.I.Vavilov Saratov State Agrarian University, Saratov (e-mail: [email protected]).

2LLC «VIC- Animal health», Saratov (e-mail: [email protected]).

Introduction: according to Food and Agriculture Organization United Nations an annual economic harm in crop losses because of microscopic fungi and their mycotoxins is as high as 16 billion dollars. Currently, mycotoxins deactivation by microorganisms is one of the most effective methods of mycotoxicosis control. Of various microorganisms capable to degrade mycotoxins the lactic acid bacteria are the most promising. The aim of the research was to isolate lactic acid bacteria able to degrade mycotoxins from associated bird microflora. Methods and materials: lactic acid bacteria were isolated from blind end and ileum intestine contents of 3-, 5-, 7- and 14-days old chickens. 42 strains of Lactobacillus spp. and Enterococcus spp. were selected basing on their cultural and morphological properties and then incubated with B1 aflatoxin and T-2 mycotoxin during 7 days. Mycotoxins residual content was studies by ELISA using RIDASCREEN @ FAST Aflotoxin and RIDASCREENFAST T2-Toxin test systems (R-Biopharm AG, Germany). Results: 2 Enterococcus spp. strains reducing the level of B1 aflatoxin (by 76.9% and 82.2% correspondingly) in media, and one Enterococcus spp. strain reducing the level of T-2 toxin by 43.7% in media were isolated. Microorganisms with genetically fixed ability to degrade mycotoxins promote the most intense degradation of toxic elements that allows less negative effects from birds' forced feeding with substandard rations. Conclusion: therefore, development of probiotic drugs based on Lactobacillus spp. and Enterococcus spp. strains has undoubted relevance and practical value to prevent animal toxicities.

KEYWORDS: mycotoxicosis, mycotoxin, aflotoxin, trichothecene, lactic-acid-producing bacterium.

References