CC BY
16
МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Боронина Л.Г.1,2, Саматова Е.В.2, Кукушкина М.П.2, Блинова С.М.1, Панова С.А.2, Устюгова С.С.2
ПОИСК ОПТИМАЛЬНОГО АЛГОРИТМА ТЕСТИРОВАНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА КАРБАПЕНЕМАЗ У НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ
1ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, 620028, Екатеринбург, Россия; 2ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница», 620149, Екатеринбург, Россия
Устойчивость представителей порядка Enterobacterales к эртапенему - 12,1%. Наиболее высокая частота нечувствительности к данному антимикробному препарату отмечена среди изолятов K. pneumoniae 29,4%%. Среди всех изолятов энтеробактерий устойчивость к имипенему и меропенему проявляли - 17,2% и 20%%. Доля штаммов P. aeruginosa устойчивых к меропенему и имипенему по 50,9% соответственно, к дорипенему - 45%%. A. Baumannii, устойчивых к меропенему - 66,6%%, имипенему - 63,6%, дорипенему - 83,3%. У K. pneumoniae обнаружены гены резистентности: NDM (n=2), KPC (n=10), OXA (n=1); у P. aeruginosa: VIM (n=8), NDM (n=1), OXA (n=1); A. baumannii OXA (n=1). Оптимально использование молекулярных методов, в частности ПЦР-РВ, для осуществления эффективного надзора за распространением продуцентов карбапенемаз, имеющими тенденцию к широкому распространению в условиях стационара. Молекулярные методы позволяют быстро получить результат (в течение рабочего дня) и принять адекватное решение о проведении антибиотикотерапии.
Ключевые слова: Enterobacterales; неферментирующие грамотрицательные бактерии; карбапенемазы; инфекция. Для цитирования: Боронина Л.Г., Саматова Е.В., Кукушкина М.П., Блинова С.М., Панова С.А., Устюгова С.С. Поиск оптимального алгоритма тестирования и характеристика карбапенемаз у нозокомиальных штаммов. Клиническая лабораторная диагностика, 2020; 65(12): 771-777. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-12-771-777
BoroninaLG.12, SamatovaE.V.2, KukushkinaM.P.2, BlinovaS.M.1, PanovaS.A.2, UstyugovaS.S.2 SEARCH FOR AN OPTIMAL TEST ALGORITHM AND CHARACTERISTIC OF CARBAPENEMASES IN NOSOCOMIAL STRAINS
1Urals State Medical University, chair of clinical laboratory diagnostics and bacteriology, 620028, Ekaterinburg, Russia; 2Regional Children's Clinical Hospital, clinical microbiology laboratory, 620149, Ekaterinburg, Russia
Resistance of representatives of the order Enterobacterales to ertapenem 12.1%. The highest frequency of insensitivity to this antimicrobial drug was noted among isolates ofK. pneumoniae 29.4%%. Among all enterobacterial isolates, resistance to imipenem and meropenem was 17.2% and 20%%. The proportion of P. aeruginosa .strains is 50.9% resistant to meropenem and imipenem, respectively, and45% to doripenem. In turn, A. baumannii is resistant to meropenem - 66.6%%, imipenem - 63.6%, doripenem -83.3%. The following resistance genes were found in K. pneumoniae: NDM (n=2), KPC (n=10), OXA (n=1); in P. aeruginosa: VIM (n=8), NDM (n=1), OXA (n=1); A. baumannii OXA (n=1). At present, it is optimal to use molecular methods, in particular real-time PCR, to effectively monitor the distribution of carbapenemase producers, which tend to be widely distributed in a hospital setting. Molecular methods allow you to quickly get the result (during the working day) and give an adequate decision on antibiotic therapy.
Key words: Enterobacterales; non-fermenting gram-negative bacteria; carbapenemases; infection.
For citation: Boronina L.G., Samatova E.V., Kukushkina M.P., Blinova S.M., Panova S.A., Ustyugova S.S. Search for an
optimal test algorithm and characteristic of carbapenemases in nosocomial strains. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika
(Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2020; 65(12): 771-777 (in Russ.) DOI:http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-
65-12-771-777
For correspondence: Boronina Lyubov Grigorievna, Doctor of Medical Sciences, Professor of chair of clinical laboratory diagnostics and bacteriology; е-mail: boroninalg@mail.ru Information about authors:
Boronina L.G.,http://orcid.org/0000-0003-0152-962X; Samatova E.V.,http://orcid.org/0000-0003-3154-6201; Kukushkina M.P. https://orcid.org/0000-0003-1980-9099; Blinova S.M.,http://orcid.org/0000-0003-4783-825X; Panova S.A., https://orcid.org/0000-0003-4347-0929; Ustyugova S.S., https://orcid.org/0000-0002-0053-4884. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Received 04.06.2020 Accepted 15.06.2020
Введение. Распространение устойчивости бактерий большим трудностям при лечении тяжёлых ИСМП [1, к карбапенемам, которые ранее считались одними из 2]. Грамотрицательные бактерии являются наиболее надёжных антимикробных препаратов (АМП) ведёт к частыми возбудителями, ИСМП, в том числе сепсиса,
Для корреспонденции: Боронина Любовь Григорьевна, д-р мед. наук, проф. каф. клин. лаб. диагностики и бактериологии; е-таП: Ьогош-nalg@mail.ru
MICROBIOLOGY
пневмонии, инфекций мочевыводящих путей, среди них выделяют представителей порядка Enterobacterales, среди которых чаще всего встречается Klebsiella pneumoniae, неферментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ) - Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii [1, 3 - 5].
Согласно молекулярной классификации Ambler, выделяют четыре класса ß-лактамаз. Сериновые ß-лактамазы включают класс А (KPC, GES, TEM, SHV, STX-M, SME, IMI, NMC-A), класс C (Amp C: FOX, CMY, DHA, ACT, ACC), класс D (OXA). Класс В включает ме-талло-бета-лактамазы (МБЛ): В, MBLs: IMP, VIM, NDM, GIM, SPM, SIM [1, 5]. Резистентность грамотрицатель-ных бактерий порядка Enterobacterales к карбапенемам может быть связана с: 1) гиперпродукцией хромосомных ß-лактамаз Amp C, 2) ß-лактамазами расширенного спектра (БЛРС) в сочетании с нарушением проницаемости клеточной стенки, потерей пориновых каналов, 3) ферментативной инактивацией АМП за счёт продукции карбапенемаз. У P. aeruginosa устойчивость к карбапене-мам может быть связана с нарушением транспорта АМП внутрь клетки в результате мутаций, ведущих к потере имипенем-специфического мембранного порина OprD, и гиперэкспрессией механизмов активного выведения -эффлюксных помп [1-5]. Наиболее часто резистентность к карбапенемам, обусловлена продукцией карбапенемаз. Причины нечувствительности у A. baumannii к данной группе АМП разнообразны: изменение проницаемости наружной мембраны клеточной стенки, эффлюкс, продукция приобретённых карбапенемаз (МБЛ и ОХА-карбапе-немаз), гиперпродукция видоспецифических ß-лактамаз (ОХА-51 и родственных ферментов) [4].
В феврале 2017 г. эксперты ВОЗ впервые представили перечень резистентных микроорганизмов, представляющих наибольшую опасность для общественного здоровья, где среди грамотрицательных бактерий лидируют карбапенемазорезистентные штаммы A. baumannii и P. aeruginosa, представители порядка Enterobacterales, продуцирующие БЛРС и карбапенемазы [5]. Обмен мобильными генетическими элементами, такими как инте-гроны, легко встраивающиеся в плазмиды, и транспозо-ны, внутри популяции, ведёт к быстрому распространению устойчивых штаммов [2, 3].
Для повышения качества оказания медицинской помощи и предотвращения возникновения и распространения инфекционных заболеваний, в частности ИСМП необходимо обеспечить раннее выявление грамотрицатель-ных бактерий, продуцирующих карбапенемазы путём постоянного мониторинга антибиотикорезистентности возбудителей и определения механизмов резистентности.
Цель — определение последовательности тестирования штаммов грамотрицательных бактерий к карбапене-мам, механизмов резистентности и частоты распространения карбапенемаз.
Материал и методы. С января по декабрь 2019 г. исследовано 6100 проб различного клинического материала (кроме фекалий) от 2483 пациентов ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница», госпитализированных в отделение анестезиологии и реанимации (ОРИТ), ОРИТ новорожденных и недоношенных детей № 2, онкогематологический центр, отделение патологии и недоношенных, отделения торакальной хирургии и хирургическое отделение для новорожденных больных, нефрологическое и неврологическое отделение. Исследованы кровь, спинномозговая жидкость, содержимое
трахеи, моча, отделяемое ран и конъюнктивы, мокрота, выпот из плевральной полости, материал из ротоглотки, аутопсийный материал - ткань лёгких.
Взятие клинического материала на бактериологическое исследование производили согласно общепринятым методам [6].
Для посева крови забранной из интактной вены и/или катетера использованы системы для гемокультур «Signal» («Oxoid», Великобритания), флаконы для автоматического анализатора гемокультур «BACTEC™ FX» («Becton Dickinson», США), бульон с сердечно-мозговым экстрактом с 0,025% SPS, СО2 и вакуумом («Conda», Испания). При культуральном исследовании спинномозговой жидкости использован модифицированный посев, согласно нормативной документации [7]: чашки с шоколадным и кровяно-сывороточным агарами (оригинальные рецепты) [8, 9] инкубировали при +35о С в атмосфере с 5% СО2 в течение 48 ч, 0,1% полужидкий сывороточный агар при +37о С в течение 5 сут с ежедневным просмотром. Посев катетеров осуществлялся полуколичественным методом по D. Maki на кровяно-сывороточный агар (инкубация при +37о С в атмосфере с 5% СО2 в течение 72 ч) и погружением катетера в сахарный бульон для изучения его внутреннего канала, инкубация при +37о С в течение трёх суток с ежедневным просмотром. Пунктаты, экссудаты засевали на кровяно-сывороточный агар (инкубация при +37о С в аэробной атмосфере в течение 48 ч), свежеприготовленный кровяно-сывороточный агар (инкубация при +37о С в анаэробных условиях в течение 7 сут), прореге-нерированную тиогликолевую среду и двухфазную среду, включающую плотный питательный агар и бульон (инкубация при +37о С в аэробной атмосфере в течение 5 сут) с ежедневным просмотром. На питательные среды Эндо, желточно-солевой, кровяно-сывороточный, шоколадный агар (инкубация в атмосфере с 5% СО2) и агар Сабуро осуществлялся посев мокроты, бронхоальвеолярного лаважа, содержимого трахеи [10]. Пробы с отделяемым ран, конъюнктивы дополнительно засевали на прорегене-рированную тиогликолевую среду. Посев мочи осуществлялся по методу Айзенберга на 5% кровяной агар [11]. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили бактериологическим методом, на полуавтоматическом ATB Expression (bioMerieux, Франция) и автоматическом Phoenix M50 (Becton Dickinson, США) анализаторах. Определение антибиотикочувствительности проводили диско-диффузионным методом, на полуавтоматическом SENSITITRE (TREC Diagnostic Systems, США/Великобритания) и автоматическом Phoenix M50 (Becton Dickinson, США) анализаторах. Постановка и оценка антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом проводилось в соответствии с действующей нормативной документацией [12]. Для выявления продукции карбапенемаз без их дифференциации у P. aeruginosa и представителей порядка Enterobacterales применялся фе-нотипический метод - метод инактивации карбапенемов (Carbapenem Inactivation Method, CIM) [13].
Для обнаружения грамотрицательных бактерий, резистентных к карбапенемам не зависимо от механизма резистентности, при первичном посеве клинического материала от онкологических больных использована среда «CHROMagar™ KPC» (DRG, Франция).
Молекулярно-биологическая детекция генов, кодирующих карбапенемазы у выделенных штаммов, осуществлялась методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием наборов реагентов «Ам-плиСенс® MDR MBL-FL» и «АмплиСенс® MDR KPC/ OXA-48-FL» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотреб-надзора, Россия). Выявлялись гены, кодирующие приобретённые сериновые карбапенемазы групп KPC и OXA-48-подобных (OXA-48, OXA-162) и МБЛ с карбапене-мазной активностью групп VIM, IMP, NDM.
Результаты и обсуждение. В исследовании представлены результаты тестирования A. baumannii и P. aeruginosa, представителей порядка Enterobacterales, в связи с тем, что согласно информации ВОЗ, именно эти виды среди резистентных грамотрицательных бактерии, наиболее часто вызывают тяжёлые инвазивные инфекции и требуют постоянного контроля резистентности.
С января по декабрь 2019 г. из клинического материала 900 пациентов выделено 940 штаммов грамотри-цательных бактерий: Pseudomonas aeruginosa (n=202), Acinetobacter baumannii (n=62), Escherichia coli (n=236), Klebsiella pneumoniae (n=223), Klebsiella oxytoca (n=41), Enterobacter cloacae (n=69), Enterobacter aerogenes (n=5), Serratia marcescens (n=55), Proteus mirabilis (n=23), Proteus vulgaris (n=4), Morganella morganii (n=5), Citrobacter freundii (n=5), Citrobacter koseri (diversus) (n=5), Citrobacter amalonaticus (n=1), Pseudomonasputida (n=2).
Небольшое количество протестированных к дорипенему изолятов обусловлено тем, что этот АМП входит не во все коммерческие панели для определения резистентности. Суммарная доля карбапенемнечувствительных штаммов грамотрицательных бактерий (резистентные и умеренно-резистентные к меропенему и/или имипенему у P. aeruginosa, A. baumannii или эртапенему у энтеро-бактерий) среди всех штаммов, составила 14% (n=132).
Устойчивость представителей порядка Enterobacterales к эртапенему - 12,1%, что ниже, чем в целом по РФ
- 23,6%, соответственно [14, 15]. Наиболее высокая частота нечувствительности к эртапинему отмечена среди изолятов K. pneumoniae - 29,4% соответственно, что ниже, чем показатели в целом по РФ - 41,6% соответственно [15]. Среди изолятов энтеробактерий устойчивость к имипенему и меропенему проявляли 17,2% и 20% соответственно. Среди изолятов K. pneumoniae устойчивы к имипенему - 35,5%, к меропенему - 44,7%. Согласно исследованию МАРАФОН в 2015-2016 гг., среди всех энтеробактерий резистентность к имипенему - 6,9%, к меропенему - 6,5% штаммов, изолятов K. pneumoniae -11,9 и 12,2%, соответственно [15]. При выявлении умеренной резистентности или резистентности к эртапене-му у энтеробактерий определялась чувствительность к меропенему и имипенему и проводился CIM-тест.
Штаммы P aeruginosa устойчивы к меропенему и имипенему в 50,9%, к дорипенему - 45%, что ниже данных общероссийских исследований: резистентных изоля-тов к имипенему - 67,5% и меропенему - 55,5%, согласно данным исследования «МАРАФОН» 2015-2016 гг. [16].
Штаммы A. baumannii устойчивы к меропенему -66,6%, имипенему - 63,6%, дорипенему - 83,3%, что в целом ниже опубликованных данных по России: резистентных изолятов к имипенему - 77,5%, меропенему
- 77,2%, согласно данных исследования «МАРАФОН» 2015-2016 гг. [17], но выше данных отдельных городов, так в многопрофильных стационарах Санкт-Петербурга, доля меропенемустойчивых штаммов A. baumannii составила 41,4%, имипенемустойчивых приблизилась к 50% исследованных штаммов [18].
МИКРОБИОЛОГИЯ
Устойчивые к карбапенемам изоляты выделялись от пациентов, длительно находящихся на стационарном лечении в онкогематологии, реанимационных отделениях перинатального центра, после оперированных врождённых пороков сердца, врождённых пороков развития, бронхо-лёгочной дисплазии, пневмонии, хронического обструктивного бронхита, хронической почечной недостаточности, инфекции мочевыводящих путей. Кар-бапенемазорезистентные штаммы часто обнаружены у пациентов длительно и неоднократно лечившихся в нескольких стационарах, подвергавшихся полостным операциям, получающих массивную терапию АМП, пациентов на паллиативном наблюдении.
Источниками выделения этих штаммов являлись кровь (n=8), спинномозговая жидкость (n=2), содержимое трахеи (n=67), моча (n=36), отделяемое ран (n=10) и конъюнктивы (n=2), мокрота (n=4), выпот из плевральной полости (n=1), ротоглотка (n=1), аутопсийный материал - ткань лёгких (n=1). Выделены штаммы, устойчивые к карбапенемам: P aeruginosa (n=55), A. bauman-nii (n=22), Escherichia coli (n=2), Klebsiella pneumoniae (n=40), Klebsiella oxytoca (n=1), Enterobacter cloacae (n=7), Serratia marcescens (n=2), Proteus mirabilis (n=2), Pseudomonas putida (n=1).
Штаммы P. aeruginosa, устойчивые к карбапенемам, резистентны или умеренно-резистентны к меропенему и имипенему. Один изолят A. baumannii умеренно-резистентный к меропенему, но чувствительный к имипене-му. 67,5% штаммов K. pneumoniae одновременно устойчивы ко всем карбапенемам: эртапенему, меропенему, имипенему.
У пяти пациентов одновременно обнаружены несколько видов грамотрицательных бактерий, устойчивых к карбапенемам: P aeruginosa и A. baumannii (n=2), K. pneu-moniae и P. aeruginosa (n=3). Все случаи наблюдались у пациентов ОРИТ с диагнозами: хронический обструктивный бронхит, бронхолёгочная дисплазия, острое поражение ЦНС, острая гнойно-деструктивная пневмония.
Часто карбапенемазопродуцирующие штаммы гра-мотрицательных бактерий имеют фенотип множественной резистентности к АМП (MDR, multiple drug resistance) - нечувствительны как минимум к трём АМП различных классов [3]. Такие штаммы были среди P. aeruginosa (n=32), A. baumannii (n=15), K. pneumoniae (n=29). Такие изоляты обнаружены у детей из ОРИТ, он-когематологических больных, пациентов, находящихся на гемодиализе при хронической почечной недостаточности. Для определения экстремальной лекарственной резистентности (XDR, extensively drug resistance) или панрезистентности (PDR, pandrug resistance), согласно экспертной группе Европейского общества по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ESCMID), у бактерий порядка Enterobacterales предложено использовать 17 категорий АМП (содержащих 28 АМП), у P. aeruginosa - 8 категорий (17 АМП), у A. baumannii - 9 категорий (22 АМП) [3]. В лаборатории клинической микробиологии такое количество АМП не тестируется, поэтому достоверно выявить количество штаммов с XDR и PDR-фенотипом резистентности в нашем исследовании не удалось.
Наиболее распространённым механизмом устойчивости грамотрицательных бактерий к карбапенемам является продукция карбапенемаз, спектр которых достаточно широк. Для выявления карбапенемаз использованы несколько методов определения их продукции,
MICROBIOLOGY
как фенотипические, так и молекулярно-генетические. С 2017 г. в практику внедрён метод инактивации карба-пенемов (CIM) [1, 13]. Молекулярно-биологическая детекция генов, кодирующих карбапенемазы, у грамотри-цательных бактерий осуществлялась методом мультиплексной ПЦР-РВ с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, выявлялись гены, кодирующие приобретённые сериновые карбапенема-зы групп KPC, OXA-48-подобных (OXA-48, OXA-162), МБЛ с карбапенемазной активностью групп VIM, IMP, NDM. Для определения антибиотикочувствительности на автоматическом анализаторе Phoenix M50 использованы три вида панелей. Один вид панелей позволяет определить факт наличия карбапенемаз, второй - обеспечивает дифференцировку класса карбапенемаз, третий - не предназначен для выявления карбапенемаз. Для
определения колонизации слизистой оболочки прямой кишки грамотрицательными бактериями, резистентных к карбапенемам, не зависимо от механизма, у онкогема-тологических больных приобретена хромогенная среда CHROMagar KPC (DRG, Франция).
MDR штаммы, независимо от результатов детектирования CIM-теста для энтеробактерий и P. aeruginosa, сохранялись с целью определения генов резистентности. В тестирование не включены изоляты одного и того же вида микроорганизмов при повторном выделении одного больного из того же материала или из разных ло-кусов, но с одним и тем же результатом антибиотикочув-ствительности. Карбапенемазы у исследованных грамо-трицательных бактерий и их генотипы резистентности в сравнении с фенотипическими методами представлены в таблице.
Резистентность к карбапенемам фенотипическим и молекулярно-генетическим методом
Микроорганизмы Биоматериал, я-количество штаммов № штамма CIM Гены резистентности, ПЦР-РВ
VIM | IMP | NDM KPC OXA-48, 162
Класс В A D
Klebsiella кровь, я=3 1-2 + - - - + -
pneumoniae 3 - -- + - -
содержимое трахеи, я=5 4-5 + --- + -
6 + --- + -
7 + --- - -
8 - --- - -
моча, я=6 9-11 + --- + -
12 + --- + +
13 + -- + - -
14 - --- - -
отделяемое конъюнктивы, я=1 15 + --- + -
Всего я=15 002 10 1
Pseudomonas кровь, я=1 16 - --- - -
aeruginosa содержимое трахеи, я=14 17-20 + +-- - -
21 + --- - +
22 + --- - -
23-28 - --- - -
29 - -- + - -
30 - --- - -
мокрота, я=1 31 - --- - -
выпот в плевральную полоть, я=1 32 - --- - -
раневое отделяемое, я=3 33-34 + +-- - -
35 - --- - -
моча, я=2 36 - --- - -
37 + +-- - -
отделяемое конъюнктивы, я=1 38 + +-- - -
ротоглотка, я=1 39 +; среда KPC+ --- - -
Всего я=24 801 0 1
Acinetobacter кровь, я=1 40 --- - -
baumannii ликвор, я=1 41 --- - -
содержимое трахеи, я=2 42 --- - -
43 --- - -
аутопсийный материал (лёгкое), я=1 44 --- - +
Всего я=5 000 0 1
Pseudomonas кровь, И=1 45 + --- - -
putida раневое отделяемое, я=1 46 + --- - -
Всего я=2 0 0 0 0 0
Примечание. CIM - метод инактивации карбапенемов (Carbapenem Inactivation Method).
При определении продукции карбапенемаз, наиболее распространённым из фенотипических методов, имеются ограничения, так CIM рассчитан для определения карбапенемаз у представителей порядка Enterobacterales и P. aeruginosa [1].
В 84,7% случаев наблюдается корреляция между методами определения карбапенемаз, приведенными в таблице. У K. pneumoniae методом ПЦР обнаружены гены резистентности: NDM(n=2), KPC (n=10), OXA (n=1); у P. aeruginosa: VIM (n=8), NDM (n=1), OXA (n=1); A. baumannii OXA (n=1). Такое распределение генов в отношении P. aeruginosa и A. baumannii не противоречит данным по России [2-4, 16, 17]. Относительно K. pneu-moniae в больнице лидируют KPC, в целом по России среди бактерий порядка Enterobacterales, согласно данным исследований «МАРАФОН» в 2013-2014 гг. и 20152016 гг., преобладает группа ОХА-48 [15].
У K. pneumoniae штамм № 7, P. aeruginosa № 22 при положительном тесте CIM гены резистентности не выявлены. Мы можем использовать только наборы, обладающие регистрационным удостоверением на медицинское изделие и паспортом качества. Имеющиеся ПЦР-наборы на рынке, которые соответствуют требованиям, не включают весь известный спектр генов.
У K. pneumoniae штамм № 8, 14, P. aeruginosa № 35, где CIM-тест отрицателен и A. baumannii № 42, - другим фенотипическим методом (анализатором Phoenix M50) выявлен факт наличия или конкретный класс карбапе-немаз, но гены резистентности использованными ПЦР-наборами не определены. Ни один фенотипический метод не обладает 100% чувствительностью. По данным литературы, чувствительность CIM-теста 82%, при определении чувствительности на анализаторе, в том числе Phoenix M50, 95-97% [2, 19]. Существует метод, где при приготовлении суспензии тестируемого изолята стерильную дистиллированную воду или 0,9% физиологический раствор заменяют на триптиказо-соевый бульон, что повышает чувствительность до 93%, но в рутинной практике не используется из-за дороговизны [2]. Наличие умеренно активных ферментов (карбапенемаз), в частности, типа OXA-48, снижает чувствительность их определения [2]. Разрешённые к применению в РФ ПЦР-наборы не включают весь спектр генов, ответственных за выработку карбапенемаз различных классов, можно предположить, в данных случаях имеет место продукция карбапенемаз, что требует дальнейшего изучения.
У K. pneumoniae штамм № 3 CIM-тест отрицателен, другим фенотипическим методом (анализатором Phoenix M50) выявлена продукция карбапенемазы класса D, но при этом обнаружен ген резистентности класса В - NDM. Ингибитор, используемый для выявления карбапенемаз в анализаторе Phoenix M50, является коммерческой тайной. У нас пока недостаточно накопленных данных для однозначных заключений, что требует дальнейшего изучения, в доступной литературе информации о специфичности применённых методов не обнаружено. Так как мировыми исследователями «золотым стандартом» обнаружения продуцентов карбапенемаз признан молекулярный метод, скорее всего здесь продуцируются карбапенемазы класса В.
У P. aeruginosa штамма № 29 CIM-тест отрицателен и другим фенотипическим методом (анализатор Phoenix M50) не выявлен факт наличия карбапенемаз, при этом обнаружен ген класса В - NDM, что подчеркивает, что
МИКРОБИОЛОГИЯ
ПЦР-РВ вне конкуренции при определении наиболее часто встречающихся классов карбапенемаз.
У P. aeruginosa штамма № 39 CIM-тест положительный, другим фенотипическим методом (анализатором Phoenix M50) не выявлен факт наличия карбапенемаз, гены резистентности использованными ПЦР-наборами не выявлены. При выделении данного штамма в лаборатории имелась хромогенная среда CHROMagar KPC, при посеве на неё культура P. aeruginosa дала рост, что свидетельствует в пользу продукции карбапенемазы у данного штамма.
Методика CIM-теста предполагает его использование только у энтеробактерий и P. aeruginosa, в качестве эксперимента он поставлен на культуре Pseudomonas putida, выделенной от пациента с онкогематологиче-ским заболеванием. В результате CIM-тест положительный, гены резистентности методом ПЦР не выявлены. 100% уверенности, что продукция карбапенемазы имеет место, нет.
Скринингом выявления карбапенемрезистентных штаммов грамотрицательных бактерий является использование хромогенных сред. Чувствительность CHROMagar KPC варьирует в пределах от 43% до 100%. Чувствительность CHROMagar KPC для детекции карбапенемаз класса D (OXA-48) - 87.7% [19, 20]. Бесспорным преимуществом является то, что результат можно получить уже на следующий день с момента посева клинического материала.
У 30,4% протестированных штаммов: P. aeruginosa (n=11) и A. baumannii (n=3), продукция карбапенемазы не выявлена, что свидетельствует о других механизмах резистентности к карбапенемам.
Исходя из возможностей оснащения лаборатории, приобретения коммерческих диагностических средств для детекции карбапенемаз, зарегистрированных в РФ, оптимальным предлагается алгоритм, представленный на рисунке.
Если пациент находится в тяжёлом или неотложном состоянии, возможно определение генов, кодирующих карбапенемазы, непосредственно в нативном материале предполагаемого очага инфекции.
В нашей больнице организован центр инфекционного контроля, включающий совместную работу врача-бактериолога, врача-эпидемиолога, клинического фармаколога. В его работу входит микробиологический мониторинг и оперативное информирование, в том числе клиницистов, о выделение MDR штаммов, проведение эффективных изоляционно-ограничительных мероприятий, поддержание оптимальной степени микробиологического контроля больничной среды, внедрения современных технологий уборки помещений и обеззараживания медицинских отходов, защиту пациента от вторичного эндогенного инфицирования. Согласно вну-трибольничным приказам регламентировано разделение потоков пациентов с разной степенью эпидемической опасности на всех этапах лечебно-диагностического процесса, закреплён принцип рационального использования АМП, в том числе с учётом результатов микробиологического исследования, направленных на ограничение селекции антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов.
Заключение. Устойчивость представителей порядка Enterobacterales к эртапенему - 12,1%. Наиболее высокая частота нечувствительности к данному АМП отмечена среди изолятов K. pneumoniae - 29,4%. Среди
MICROBIOLOGY
Детекция карбапенемаз в лаборатории клинической микробиологии в течение рабочего дня.
изолятов энтеробактерий устойчивость к имипенему и меропенему проявляли 17,2% и 20%. Доля штаммов P. aeruginosa, устойчивых к меропенему и имипенему по 50,9% соответственно, к дорипенему - 45%. A. baumannii устойчивых к меропенему - 66,6%, имипенему - 63,6%, дорипенему - 83,3%. У K. pneumoniae обнаружены гены резистентности: NDM (n=2), KPC (n=10), OXA (n=1); у P aeruginosa: VIM (n=8), NDM (n=1), OXA (n=1); у A. baumannii OXA (n=1). Оптимальным является использование молекулярных методов, в частности ПЦР-РВ, для осуществления эффективного надзора за распространением продуцентов карбапенемаз, имеющих тенденцию к широкому распространению в условиях стационара. Молекулярные методы позволяют получить результат в течение рабочего дня и принять адекватное решение о проведении антибиотикотерапии.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп 11, 13 см. REFERENCES)
1. Савинова Т.А., Лазарева А.В., Шамина О.В., Крыжановская О.А., Чеботарь И.В., Маянский Н.А. Генотипы и носитель-ство металло-бета-лактамаз среди карбапенемазорезистент-ных Pseudomonas aeruginosa, выделенных у детей г. Москвы. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018; 20(4):370-4.
2. Попов Д.А. Сравнительная характеристика современных методов определения продукции карбапенемаз. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(2):125-33.
3. Полищук А.Г., Якубович Е.И., Полухина О.В., Осовских В.В., Евтушенко В.И. Карбапенемазопродуцирующие грамотрица-тельные бактерии в специализированном стационаре ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Санкт-Петербурга». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2017; 19(3):235-42.
4. Хрульнова С.А., Коробова А.Г., Федорова А.В., Фролова И.Н.,
Савочкина Ю.А., Клясова Г. А. Детекция генов, приобретенных карбапенемаз у изолятов Acinetobacter baumannii, выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(1):56-60.
5. Козлов Р.С., Стецюк О.У, Андреева И.В. Цефтазидим-авибак-там: новые «правила игры» против полирезистентных грамо-трицательных бактерий. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018; 20(1):24-34.
6. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории. Методические указания 4.2.203905. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России; 2005.
7. Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. Методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнад-зора; 2017.
8. Воронина Л.Г. Питательная среда для выявления H. influenzae и способ ее получения. Патент РФ № 2006136958/13; 2009.
9. Воронина Л.Г., Саматова Е.В. Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала. Патент РФ № 2011128466/10; 2013.
10. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ. Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.85. М.; 1985.
12. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии. Клинические рекомендации. Версия-2018-03. М.: Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии; 2018.
14. Шайдуллина Э.Р., Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю., Сухору-кова М.В., Козлов Р.С. Антибиотикорезистентность нозокоми-альных карбапенемазопродуцирующих штаммов Enterobacte-rales в России: результаты эпидемиологического исследования 2014-2016 гг. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018; 20(4):362-9.
15. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Иванчик Н.В., Скле-енова Е.Ю., Шайдуллина Э.Р., Азизов И.С. и др. Антибиоти-
МИКРОБИОЛОГИЯ
корезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacterales в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН 2015-2016». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(2):147-59.
16. Эйдельштейн М.В., Шек Е.А., Сухорукова М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Шайдуллина Э.Р. и др. Антибиотикорези-стентность, продукция карбапенемаз и генотипы нозокомиальных штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН 2015-2016». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(2):160-70.
17. Шек Е.А., Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Шайдуллина Э.Р. и др. Антибиотикоре-зистентность, продукция карбапенемаз и генотипы нозокоми-альных штаммов Acinetobacter spp. в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН 2015-2016». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(2):171-80.
18. Светличная Ю.С. Распространение карбапенемустойчивых штаммов А. baumannii в многопрофильных стационарах Санкт-Петербурга. Медицинский альманах. 2015; (5):102-5.
19. Гаязова Д. Выявление микроорганизмов, продуцирующих карбапенемазы. Режим доступа. URL: https://fedlab.ru/upload/ medialibrary/000/prezentatsii-/prezentatsii-samara/%D0%93%D0 %B0%D1%8F%D0%B7%D0%BE%D0%B2%D0%B0.pdf. (дата обращения: 21.02.2020).
20. Кречикова О.И. Фенотипические методы выявления механизмов резистентности. Возможности использования CHROMAgar в клинической практике. НИИ антимикробной химиотерапии. Улан-Удэ. 2 сентября. Режим доступа. - URL: https://chromagar. ru/wp-content/uploads/Fenotip-metody-ESBL-KPC-Hromagary-Ulan-Ude-02-sent-2016.pdf. (дата обращения: 21.02.2020).
REFERENCES
1. Savinova T. A., Lazareva A.V., Shamina O.V., Kryzhanovskaya O.A., Chebotar' I.V., Mayanskiy N.A. Genotypes and carriage of metallo-beta-lactamases among carbapenemasoresistant Pseudomonas aeruginosa isolated in children of Moscow. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2018; 20(4):370- 4. (in Russian)
2. Popov D.A. Comparative characteristics of modern methods for determining the production of carbapenemases. Klinicheskaya mik-robiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2019; 21(2):125-33. (in Russian)
3. Polishchuk A.G., Yakubovich E.I., Poluhina O.V., Osovskikh V.V., Evtushenko V.I. Carbapenemase-producing gram-negative bacteria in a specialized hospital of St. Petersburg Russian Scientific Center for Radiology and Surgical Technologies. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2017; 19(3):235-42. (in Russian)
4. Khrul'nova S.A., Korobova A.G., Fedorova A.V., Frolova I.N., Savochkina Yu.A., Klyasova G.A. Detection of genes acquired by carbapenemases in Acinetobacter baumannii isolates isolated from the blood culture of patients with tumors of the blood system. Klin-icheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2019; 21(1):56-60. (in Russian)
5. Kozlov R.S., Stetsyuk O.U., Andreeva I.V. Ceftazidime-avibactam: new "rules of the game" against multiresistant gram-negative bacteria. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2018; 20(1):24-34. (in Russian)
6. Technique for collecting and transporting biomaterials to microbiological laboratories. Guidelines 4.2.2039-05. Technique for collecting and transporting biomaterials to microbiological laboratories. Guidelines 4.2.2039-05. [Tekhnika sbora i transportirovaniya bio-materialov v mikrobiologicheskie laboratorii. Metodicheskie uka-zaniya 4.2.2039-05]. Moscow: Federal'nyi tsentr Gossanepidnad-zora Minzdrava Rossii; 2005. (in Russian)
7. Laboratory diagnosis of meningococcal infection and purulent bacterial meningitis. Methodical instructions. [Laboratornaya di-agnostika meningokokkovoy infektsii i gnoynykh bakterial'nykh meningitov. Metodicheskie ukazaniya]. Moscow: Federal'nyi tsentr
gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora; 2017. (in Russian)
8. Boronina L.G. Culture medium for the detection of H. influenzae and method for its preparation. Patent RF № 2006136958/13; 2009. (in Russian)
9. Boronina L.G., Samatova E.V. Nutrient medium for isolation, cultivation and determination of hemolytic properties of bacteria from clinical material. Patent RF №2011128466/10; 2013. (in Russian)
10. On the unification of microbiological (bacteriological) research methods used in clinical diagnostic laboratories of hospitals. Order of the Ministry of Health of the USSR No. 535 of 04.22.85. [Ob unifikatsii mikrobiologicheskikh (bakteriologicheskikh) metodov issledovaniya, primenyaemykh v kliniko-diagnosticheskikh labo-ratoriyakh LPU. Prikaz MZ SSSR № 535 ot 22.04.85]. Moscow; 1985. (in Russian)
11. Essential procedures for clinical microbiology. Isenberg H.D., ed. Washington, D.C.: ASMPRESS; 1998.
12. Determination of the sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs. Interregional Association of Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. Clinical recommendations. Version 2018-03. [Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam. Mezhregional'naja assotsiatsi-ja po klinicheskoj mikrobiologii i antimikrobnoj himiotera-pii. Klinicheskie rekomendatsii. Versija-2018-03]. Moscow: Mezhregional'naya assotsiatsiya po klinicheskoy mikrobiologii i antimikrobnoy khimioterapii; 2018. (in Russian)
13. Zwaluw K., Haan A., Pluister G.N. et al. The Carbapenem Inacti-vation Method (CIM), a Simple and Low-Cost alternative for Carba NP Test to Assess Phenotypic Carbapenemase Activity in Gram Negative Rjds. PLosOne. 2015; 10 (3): е0123690.
14. Shaydullina E.R., Eydel'shtein M.V., Skleenova E.Yu., Sukhoruko-va M.V., Kozlov R.S. Antibiotic resistance of nosocomial carbapen-emase-producing strains of Enterobacterales in Russia: results of an epidemiological study 2014-2016. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2018; 20(4):362-9. (in Russian)
15. Sukhorukova M.V., Eydel'shtein M.V., Ivanchik N.V., Skleenova E.Yu., Shaydullina E.R., Azizov I.S. et al. Antibiotic resistance of nosocomial Enterobacterales strains in Russian hospitals: results of a multicenter epidemiological study "MARAFON 2015-2016". Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2019; 21(2):147-59. (in Russian)
16. Eydel'shtein M.V., Shek E.A., Sukhorukova M.V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V., Shaydullina E.R. et al. Antibiotic resistance, production of carbapenemases and genotypes of nosocomial strains of Pseudomonas aeruginosa in Russian hospitals: results of a multicenter epidemiological study "MARAFON 2015-2016". Klin-icheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2019; 21(2):160-70. (in Russian)
17. Shek E.A., Sukhorukova M.V., Eydel'shtein M.V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V., Shaydullina E.R. et al. Antibiotic resistance, production of carbapenemases and genotypes of nosocomial strains of Aci-netobacter spp. in Russian hospitals: the results of the multicenter epidemiological study "MARAFON 2015-2016". Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapia. 2019; 21(2):171-80. (in Russian)
18. Svetlichnaya Yu.S. Distribution of carbapenemic resistant strains of A. baumannii in multidisciplinary hospitals in St. Petersburg. Meditsinskij al'manah. 2015; (5):102-5. (in Russian)
19. Gayazova D. Identification of microorganisms producing carbapen-emase. Rezhim dostupa. - URL: https://fedlab.ru/upload/mediali-brary/000/prezentatsii-/prezentatsii-samara/%D0%93%D0%B0% D1%8F%D0%B7%D0%BE%D0%B2%D0%B0.pdf. (data obrash-cheniya: 21.02.2020). (in Russian)
20. Krechikova O.I. Phenotypic methods for identifying resistance mechanisms. Possibilities of using CHROMAgar in clinical practice. Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy. Ulan-Ude. September 2. Rezhim dostupa. - URL: https://chromagar.ru/wp-content/uploads/Fenotip-metody-ESBL-KPC-Hromagary-Ulan-Ude-02-sent-2016.pdf. (data obrashcheniya: 21.02.2020). (in Russian)
Поступила 04.06.20 Принята к печати 15.06.20
