CC BY
89
УДК 577.214.625:578.853
раздел БИЛОГИЯ
ПОИСК КАУЛИМОВИРУСОВ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН И ИССЛЕДОВАНИЕ
ИХ ПОЛНОГЕНОМНЫХ ПРОМОТОРОВ
© Б-Р.Кулуев1, А.В.Чемерис2, Р.И.Ибрагимов1
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450074, ул. Фрунзе, 32.
Тел./факс: + 7 (347) 273 67 78. E-mail: Kuluev@bk.ru
2 Институт биохимии и генетики УНЦ РАН
Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, Проспект Октября, 71.
Тел.: +7( 347) 235 61 00.
Впервые был амплифицирован и клонирован полногеномный промотор вируса мозаики георгина. Секвенирование показало наличие гомологии данного промотора с промоторами других каулимовирусов. Также был амплифицирован и клонирован промотор вируса кольцевой гравировки гвоздики. Приготовлены генно-инженерные конструкции для оценки силы этих промоторов в трансгенных растениях.
Ключевые слова: полногеномный промотор, каулимовирус, вирус мозаики цветной капусты, вирус кольцевой гравировки гвоздики, вирус мозаики георгины
В трансгенных растениях для проявления достаточного уровня экспрессии чужеродного гена, вместо собственных промоторов этих генов, часто применяют сильные, конститутивные промоторы каулимовирусов. Наиболее известным является 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) [1]. Этот промотор оказался более сильным, чем промоторы маннопинсинтазы и октопин-синтазы, широко применявшиеся ранее в генной инженерии растений. К тому же, в отличие от них, 35S промотор не проявляет тканеспецифичности, то есть с одинаковой силой работает во всех тканях растения. Тем не менее для некоторых целей сила 35S промотора оказалась недостаточной [2]. К тому же были сконструированы бинарные векторы, в которых и селективный, и маркерный гены находятся в обоих случаях под контролем 35S промотора, что может отрицательно сказываться на уровне экспрессии. В этой связи представляет значительный интерес обнаружение новых еще более сильных промоторов, и поскольку 35S промотор ВМЦК оказался во многом универсальным, то стали осуществляться поиски аналогичных промоторов других каулимовирусов.
Кроме 35S промотора ВМЦК, были выделены и исследованы промоторы вируса мозаики норичника, вируса мозаики ночной красавицы, вируса, окаймляющего жилки земляники, и вируса мозаики маниока. Последний, например, оказался даже более сильным, чем 35S промотор [3]. Однако допустить мысль о том, что самые лучшие промоторы для целей создания трансгенных растений уже найдены или сконструированы, было бы неправильным. Исходя из этого, мы приступили к поиску различных каулимовирусов с целью амплификации, клонирования и секвенирования их полноге-
номных промоторов с последующим получением соответствующих генно-инженерных конструкций и оценки силы их в клетках растений.
На первом этапе работы мы занимались поиском вируса мозаики норичника на территории Республики Башкортостан. Были обнаружены листья Scrophularia nodosa (норичник шишковатый) с характерной мозаикой и подобраны различные варианты праймеров (в том числе и вырожденные) для амплификации участка генома, но наши поиски не увенчались успехом, что может объясняться высокой вариабельностью нуклеотидной последовательности разных штаммов вируса мозаики норичника. Например, изученные штаммы M3 и DxS демонстрируют 26%-ное различие последовательностей между промоторными областями, в отличие от консервативных 35S промоторов разных штаммов ВМЦК [4]. Были также найдены листья земляники с симптомами вирусного заболевания. Возможно, растения были поражены вирусом, окаймляющим жилки земляники. Для проверки этого предположения были подобраны праймеры для амплификации промотора, но нужный фрагмент ДНК с их помощью детектировать не удалось. Возможно, листья были поражены другим вирусом, которых для земляники известно 4 вида, и лишь один из них относится к каулимовирусам. Поскольку георгин и гвоздика также поражаются каулимовирусами, мы приступили к поиску этих растений с характерными симптомами вирусного заболевания. К тому же из данных литературы следует, что эти вирусы широко распространены в мире. Промоторы этих вирусов к началу наших исследований не были выделены и в генной инженерии, насколько нам известно, не использовались. Несмотря на то что листья гвоздики с похожими симптомами были найдены в
Вестник Башкирского университета. 2007. Т.12, №2
25
Ботаническом саду-институте УНЦ РАН, все же не удалось амплифицировать полногеномный промотор вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ). Данный промотор удалось амплифицировать из листьев различных видов гвоздик, присланных из Института вирусологии, микробиологии и биологической безопасности (г. Брауншвейг, Германия). В окрестностях Уфы и в Ботаническом саду-институте УНЦ РАН мы обнаружили листья георгина с характерной мозаикой. Молекулярнобиологическими методами было показано, что листья поражены вирусом мозаики георгина (ВМГ). Можно констатировать, что на территории Башкортостана из каулимовирусов нами был обнаружен вирус мозаики георгина.
Амплификация и клонирование полногеномного промотора вируса мозаики георгина
Вирус мозаики георгина вызывает образование просветлений, идущих по жилкам, и инфицирует в природе только представителей рода Dahlia (георгин), но этим вирусом можно искусственно инфицировать представителей других видов, например, циннию (Zinnia) [5]. Данный вирус распространен по всему миру, где выращивают георгины. Первое упоминание о данном вирусе в русскоязычной литературе относится к 1965 году [5]. В 90-х годах XX в. этот вирус обнаружен на юге Дальнего Востока [6, 7]. Был амплифицирован и секвениро-ван участок гена 4 ВМГ размером 1440 пн [6]. Геном вируса георгина секвенирован частично, в Генбанке есть только последовательности отдельных генов. Промотор и околопромоторная область не секвенированы, что не позволяет подобрать удобные праймеры для амплификации полногеномного промотора ВМГ. Было решено амплифи-цировать более протяженный участок, который бы включал и промотор. Исходя из того, что геном ВМГ имеет кольцевую форму, мы соединили вместе известные последовательности и, вставляя вместо неизвестных гомологичные участки других каулимовирусов, собрали модель последовательности полного генома ВМГ. После того как были выровнены известные последовательности ВМГ с теми же последовательностями других каулимовиру-сов и было построено филогенетическое древо, стало ясно, что ВМГ стоит наиболее близко к вирусу мозаики норичника и вирусу мозаики ночной красавицы. Затем мы провели выравнивание последовательности составного условного генома ВМГ с последовательностями геномов вирусов норичника и ночной красавицы, что позволило нам оценить примерное расположение полногеномного промотора ВМГ. Далее было осуществлено выравнивание условного генома ВМГ с геномами всех доступных
из Генбанка каулимовирусов. Это было нужно для подбора праймеров к наиболее консервативным участкам, так как мы допускали, что геном различных штаммов ВМГ может характеризоваться некоторой или даже значительной вариабельностью. При подборе праймеров использовались лишь известные последовательности генома ВМГ, подбирались участки, ближе всего прилегающие к промотору. Наиболее подходящими оказались праймеры: 5-СЛОТОЛСТСЛТССТССЛЛТЛ-з' и 5-ЛЛТЛТ
СТЛСТОЛСЛТТТСТТ-3.
Теоретические расчеты показали, что размер амплифицируемого участка должен был составить примерно 1280 - 1300 пн. Из листьев георгина с мозаикой выделили тотальную ДНК фенольно-детергентным методом. Амплификацию проводили при температуре отжига 48°С с добавлением в реакционную смесь диметилсульфоксида до концентрации 1%. Размер амплифицируемого участка составил приблизительно 1290 пн. Этот фрагмент ДНК был клонирован в фагмидный вектор рКЯХ и секвенирован. Анализ последовательности показал, что мы секвенировали часть гена 6, промотор, большой межгенный спейсер и 7-ю открытую рамку считывания вируса мозаики георгина. Выравнивание секвенированного нами промоторного участка с известной последовательностью гена 6 вируса мозаики георгина из Генбанка с помощью программы “Ме£аИ£п” пакета Ьазе^епе показало совпадение последовательностей. Таким образом, нам впервые удалось секвенировать промотор вируса мозаики георгина и провести его первичный анализ. Промотор ВМГ оказался гомологичным промоторам других каулимовирусов. Наиболее близкими по гомологии промоторов к ВМГ оказались вирус мозаики норичника и вирус мозаики ночной красавицы. Например, гомология промоторов ВМГ и вируса ночной красавицы составила 63%. Было проведено сравнение регуляторных областей промоторов ВМГ, вирусов мозаики норичника и ночной красавицы. Если у вируса норичника ССАСТ-бокс имеет каноническую последовательность, то у ВМГ она отличается и представлена последовательностью ССААТ, а у вируса ночной красавицы -ОСЛЛС. У вирусов норичника и ночной красавицы ТОЛСО-бокс представлен последовательностью ТОЛСО, а у ВМГ Т заменен на А. ТАТА-бокс у всех трех видов не различается и представляет собой консенсусную последовательность ТАТАТАА. Сайт инициации транскрипции или так называемый -18 +1 домен заканчивается у ВМГ последовательностью ОЛТСЛ, как и у вирусов норичника и ночной красавицы. Анализ энхансерного домена промотора ВМГ позволил выявить еще несколько консенсусных последовательностей, которые также,
26
раздел БИОЛОГИЯ
видимо, выполняют регуляторные функции. Проведенный анализ позволил оценить расположение и подобрать праймеры для амплификации самого промотора, размер которого, судя по гомологии с родственными каулимовирусами, не должен был быть больше 400 пн. Но все же было решено ам-плифицировать участок несколько большего размера, так как оставались некоторые сомнения насчет границ промотора. После этапов амплификации, клонирования и секвенирования были сконструированы векторы для оценки силы этого промотора в трансгенных растениях.
Амплификация и клонирование полногеномного промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики
Из Германии мы получили листья 4-х видов гвоздичных с симптомами вирусного заболевания: Lychnis (смолка обыкновенная или клейкая), Dian-thus caryophyllus (гвоздика садовая), Dianthus barba-tus (гвоздика турецкая) и некий дикий вид из семейства гвоздичных, который немецкие коллеги, к сожалению, не определили.
В Генбанке есть полная последовательность генома вируса кольцевой гравировки гвоздики. Путем множественного выравнивания с различными каулимовирусами было выявлено, что этот вирус стоит ближе к ВМЦК, чем к другим вирусам. Поэтому для оценки расположения промотора осуществили выравнивание генома ВКГГ с геномами 4-х штаммов ВМЦК. Далее, учитывая выравнивание со всеми каулимовирусами, осуществили подбор праймеров для амплификации полногеномного промотора ВКГГ, при этом отдавали преимущество более консервативным участкам. Было подобрано 3 праймера: CERVFltFl 5-ATTAAAAGAACAATGG CAAG-3', CERVFltF2 5 '-AGAAGATTT AATGGC AATCC-3', CERVFltR 5'-AGGACTTAGGCTCAA CACAT-3'. При амплификации с праймерами CERVFltF1 и CERVFltR должен был образоваться ампликон размером 651 пн. А с праймерами CERVFltF2 и CERVFltR - размером 501 пн. Из всех 4-х образцов нам удалось амплифицировать ДНК размерами 501 пн и 651 пн. Так, молекулярнобиологическими методами было показано наличие ВКГГ в листьях гвоздики. Оба фрагмента ДНК, отличающиеся лишь расположением праймеров, были клонированы в фагмидных векторах pKRX и pBluescript II KS (-/+). Далее было осуществлено секвенирование этого промотора. Поиск сходных последовательностей в базе данных генов c помощью программы “Megablast”, доступной на вебсайте NCBI, показал 95%-ную гомологию секвени-рованного нами промотора с промоторным участком изолята вируса ВКГГ из США. Путем множественных выравниваний промоторов каулимовиру-
сов было выявлено, что промотор ВКГГ стоит ближе всего к 35S промотору ВМЦК. Гомология промотора ВКГГ и 35S промотора составила примерно 50%. Был проведен сравнительный анализ последовательностей полногеномных промоторов вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики. ССАСТ-бокс у промотора ВКГГ отличается от такового 35S промотора и представлен последовательностью СТАСТ. ТАТА-бокс представлен последовательностью ТАТАТАА, ТОЛСО-бокс - канонической последовательностью ТОЛСО, как и в 35S промоторе. У всех изолятов ВМЦК и ВКГГ на конце -18 +1 домена имеется консервативный участок ЛОТСТ(С/Л)ТСТСТ, который, возможно, выполняет какую-то важную функцию при инициации транскрипции. В энхан-серной области также был обнаружен консервативный участок ООЛТТССЛТ, который расположен в начале А-домена и начинается с нуклеотида 6779 генома ВКГГ и с нуклеотида 7132 генома ВМЦК. Благодаря выравниванию нуклеотидной последовательности промотора ВКГГ с промоторами других каулимовирусов стали известны как точные расположения основных доменов, так и границы самого промотора. Промотор ВКГГ начинается с 6750-го нуклеотида и заканчивается 7102-м. Таким образом, его размер составляет 352 пн. Гипотетически можно предположить, что это минимальный размер промотора ВКГГ, при котором проявляется экс-прессионная сила промотора. Для определения силы данного промотора, нами приготовлены генноинженерные конструкции на основе бинарных векторов семейства рСашЫа с маркерными генами и
Данная работа выполнена в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ-2217.2003.4, 2006.1003.4 и гранта РФФИ-Агидель №05-04-97914
ЛИТЕРАТУРА
1. Odell J.T., Nagy F., Chua N.H. // Nature. 1985. V.313. N6005. P.810-812.
2. Mitsuhara I., Ugaki M., Hirochika H. et al. // Plant Cell Physiology. 1996. V.37. N1. P.49-59.
3. Samac D.A., Tesfaye M., Dornbusch M. et al. // Transgenic Research. 2004. V.13. P.349-361.
4. Sanger M., Daubert S., Goodman R.M. // Plant Molecular Biology. 1990. V.14. P.433-443.
5. Черкасский Е.С. // Доклады Академии наук СССР. 1965. Т.165. №3. С.696-698.
6. Богунов Ю.В. // Молекулярная биология. 2006. Т.40. №1. С. 184-185.
7. Гнутова Р.В., Толкач В.Ф. // Микробиологический журнал. 2004. Т.66. С.48-55.
Поступила в редакцию 01.11.2006 г.
