CC BY
160
раздел БИОЛОГИЯ
УДК 577.214.625:578.853
ПРИМЕНЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ ПО ТИПУ КАТЯЩЕГОСЯ КОЛЬЦА И ДНК ШАФФЛИНГА ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕКОМБИНАЦИИ ПРОМОТОРНЫХ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ С НИЗКИМ УРОВНЕМ ГОМОЛОГИИ
© Б. Р. Кулуев 1а, А. В. Чемерис \ А. А. Ильясова 2, Р. И. Ибрагимов 2
1 Институт биохимии и генетики УНЦ РАН
Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450054, ул. Проспект Октября, 71.
Тел. +7 (347) 235 60 88.
E-mail: Kuluev@bk.ru
2 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450074, ул. Фрунзе, 32.
Тел. +7 (34 7) 273 6 7 78.
Промоторы вируса мозаики цветной капусты, вируса кольцевой гравировки гвоздики и вируса мозаики георгина были получены в одноцепочечной форме с помощью амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК полимеразы фага phi 29. Методом ДНК шаф-флинга были созданы их химерные формы в различных комбинациях. Эти химерные формы промоторов каулимовирусов могут быть применены при создании трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии белковых продуктов.
Ключевые слова: каулимовирус, промотор полноразмерного транскрипта, вирус мозаики георгина, вирус кольцевой гравировки гвоздики, ДНК гиаффлинг, ДНК-полимераза фага phi 29.
В генной инженерии растений для обеспечения высокого уровня экспрессии белков часто применяют промоторы полноразмерного транскрипта каулимовирусов, наиболее известным из которых является 35S промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) [1]. Однако для решения некоторых задач по созданию трансгенных растений и обеспечения достаточного уровня экспрессии белковых продуктов, «силы» 35S промотора оказалось недостаточно [2]. Кроме того, 35S промотор во многих бинарных векторах контролирует не только экспрессию целевого гена, но и часто селективного и маркерного генов. При получении трансгенных по нескольким генам растений число копий 35S промотора возрастает, что может приводить к уменьшению уровня экспрессии, ввиду того, что с энхансерным доменом данного промотора взаимодействуют одни и те же физиологически активные транскрипционные белковые факторы, ресурс которых может быть исчерпаем. В некоторых случаях описанный выше процесс может приводить к так называемому «молчанию» трансгена. В связи с этим были проведены эксперименты по созданию эффективных промоторных кассет, в состав которых были включены модифицированные и гибридные с другими промоторами формы 35S промотора [2]. Но до сих пор с применением метода ДНК шаффлинга, обеспечивающего максимальный мозаицизм, не были получены химерные промоторы калимовирусов, которые могут оказаться более эффективными, чем их природные аналоги или гибридные конструкции, полученные с помощью рестрикционных эндонуклеаз.
Одним из путей создания новых эффективных промоторов является метод направленной молекулярной эволюции in vitro. Представляет особый
интерес создание химерных форм промоторов методом ДНК шаффлинга - высокоэффективного метода рекомбинации генетического материала, кодирующих гомологичные белки или их домены [3], а также промоторные последовательности [4]. Для проведения экспериментов по направленной молекулярной эволюции in vitro с использованием большинства методов необходимым условием является наличие гомологии между нуклеотидными последовательностями [3]. Одной из трудностей при проведении ДНК шаффлинга является преимущественное восстановление родительских последовательностей, однако предложенный подход с использованием фрагментов одноцепочечной ДНК заметно повысил эффективность получения химерных молекул [5]. Для создания сильного промотора в качестве родительских последовательностей ДНК предпочтительно использовать эффективные природные промоторы каулимовирусов, все исследованные формы которых показали весьма высокий уровень экспрессии белков в трансгенных растениях. С этой целью нами были клонированы и секве-нированы промоторы вируса мозаики георгина (ВМГ) размером 442 пн (Accession number EF463101) и вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ), размером 501 пн (Accession number EF513492) [6]. Однако уровень гомологии выделенных нами промоторов с 35S промотором оказался довольно низким для проведения эффективного ДНК шаффлинга и составил не более 50%. По этой причине для подготовки этих промоторов к ДНК шаффлингу было решено наработать эти промоторы в одноцепочечной форме с многократно повторяющейся последовательностью промоторно-го участка без значительной примеси фагмидного вектора. Для этого нами был использован метод,
* автор, ответственный за переписку
который заключается в применении амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК полимеразы фага phi 29.
Экспериментальная часть
Одноцепочечную ДНК получали с помощью ДНК-полимеразы фага рЫ29, характеризующейся очень высокой процессивностью и обладающей свойством смещать цепь ДНК, приводя к наработке длинного одноцепочечного продукта при использовании в качестве матрицы кольцевой молекулы ДНК [7]. Промоторы каулимовирусов, клонированные в фагмидном векторе pKRX, были вырезаны с помощью эндонуклеазы рестрикции BsePI (изошизомер BssHI) (рис. 1). Далее было проведено само-лигирование в 15 мкл реакционной смеси: 1.5 мкл -буфер Т4 ДНК лигазы (10х, Fermentas), 1.5 мкл -ПЭГ 4000 (Fermentas), 0.3 мкл - БСА (10 мг/мл, Сибэнзим), 1 мкл - Т4 ДНК лигаза (30 ед/мкл, Fermentas), 10 мкл - раствор элюата промотора с липкими концами BsePI (1,5-2 мкг), 0.7 мкл - дистиллированная вода MilliQ.
Реакцию с ДНК-полимеразой фага phi29 проводили в 30 мкл: 3 мкл - буфер ДНК-полимеразы фага phi29 (10х, New England Biolabs, Inc), 6 мкл -дНТФ (2.5 мМ, Promega), 10 мкл - раствор, содержащий кольцевые молекулы ДНК, 2 мкл - олиго-нуклеотидный праймер (2 о.е/мл), 8 мкл - дистиллированная вода MilliQ, 0.5 мкл - ДНК полимераза фага phi29 (10000 ед/мл, New England Biolabs, Inc.), 0.5 мкл - пирофосфатаза (1000 ед/мл, Сибэнзим).
ДНК шаффлинг проводили по Стеммеру [3], с модификациями [5] и [8]. Вначале смешивали полученные одноцепочечные ДНК различных промоторов каулимовирусов. Образцы ДНК обрабатыва-
ли ДНКазой I (1 е. а) в буфере (0.5 М Трис НС1 рН 7.4, 0.1 М MgC12) в течение 2 мин при 15 °С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 25 мМ и инкубацией смеси при 65 С, в течение 20 мин [20]. Затем осуществляли ПЦР без добавления праймеров в 30 мкл реакционной смеси: матричная ДНК, обработанная ДНКазой I (10 мкл), смесь всех четырех дезоксирибонуклеотидтрифос-фатов (0.2 мМ каждый), буфер для ДНК-полимеразы Taq (60 мМ Трис HC1, рН 8.5, 1.5 мМ MgC12, 25 мМ KC1, 10 мМ меркаптоэтанол, 0.1% тритон Х-100), Taq ДНК-полимераза (0.5-1 ед. акт.). 1 мкл из полученной реакционной смеси использовали для дальнейшего проведения ПЦР с добавлением праймеров. Полученный амплификат клонировали в специально приготовленные Т-навешенные фаг-мидные векторы pKRX.
Результаты исследования
С помощью описанного ранее метода были наработаны в одноцепочечной форме промоторы ВМЦК, ВКГГ и ВМГ (рис. 1).
Для удобства полученные промоторы каулимо-вирусов в одноцепочечной форме были обозначены нами согласно названию вируса и праймеру, с которого данную цепь ДНК нарабатывали (форвард - F, реверс - R): 35S-F, 35S-R, ВКГГ-F, ВКГГ-R, ВМГ-F, ВМГ-R. Для проведения ДНК шаффлинга, было решено использовать все 6 комбинаций разных цепей ДНК этих промоторов: 35S-F+ВКГГ-R
(смесь 1); ВКГГ-F+35S-R (смесь 2); 35S-F+ВМГ-R (смесь 3); ВМГ-F+35S-R (смесь 4); ВКГГ^+ВМГ-R (смесь 5); ВМГ-Р+ВКГГ-R (смесь 6).
Рис. 1. Общая схема получения одноцепочечной ДНК при помощи ДНК-полимеразы фага рЫ29.
В первую очередь были смешаны разные цепи ДНК промоторов ВМЦК и ВКГГ. Далее был проведен первый раунд амплификации без добавления праймеров, при котором происходит постепенное увеличение размеров восстанавливаемых фрагментов и образование их пула. В ходе первого раунда амплификации генерируется бибилиотека рекомбинантов, несущих точки состыковки - кроссоверы, где происходит перестановка отдельных частей матрицы с одной родительской последовательности на другую. Затем был проведен 2-й раунд амплификации с использованием специально подобранных праймеров, фланкирующих исходные гены. В результате при смешивании (+)-цепи промотора ВМЦК с (-)-цепью промотора ВКГГ (1 смесь) и двух раундов ПЦР получили амплификат размером больше 500 пн (рис. 2). С помощью электрофоретического анализа был показан неоднородный состав амплификата, содержащий ДНК различного размера. При втором раунде ПЦР использовали форвард праймер промотора ВМЦК и реверс праймер промотора ВКГГ, благодаря этому должны были амплифицироваться лишь химерные молекулы ДНК, полученные при ДНК шаффлинге. Для контроля смешали промоторы ВМЦК и ВКГГ в двуцепочечной форме и, пропустив этапы фрагментации и первого раунда ПЦР, использовали эту матрицу во втором раунде ПЦР, при этом амплификация, как и ожидалось, не происходила («минус » контроль). Таким образом, амплификация с форвард праймером промотора ВМЦК и реверс праймером промотора ВКГГ проходит только в случае проведения ДНК шаффлинга, то есть только с химерных молекул ДНК (кроссоверов). При смешивании (+)-цепи промотора ВКГГ и (-)-цепи промотора ВМЦК (смесь 2) получили однородный амплификат размером около 500 пн (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма амплификатов после проведения двух раундов амплификации ДНК шаффлинга промоторов ВМЦК и ВКГГ. 1 - результат ДНК шаффлинга смеси 1; 2 — «минус» контроль для смеси 1; 3 — результат ДНК шаффлинга смеси 2; 4 — «минус» контроль для смеси 2. Маркером служит ДНК фага расщепленная эндонуклеазой рестрикции Б^/БП.
Полученные амплификаты были клонированы в вектор рКЯХ, белые колонии пересеяли, провели выделение, электрофорез, очистку и ПЦР анализ плазмид. Как и ожидалось, были получены ампли-фикаты различного размера (рис. 3), все они были приблизительно равны или больше по размеру, чем промоторы ВМЦК и ВКГГ.
Рис. 3. Электрофореграмма ПЦР анализа клонов, полученных при клонировании амплификата из смеси 1 после ДНК шаффлинга в фагмидный вектор рКЯХ. 1-7 - номера анализируемых клонов; 8 - амплификат промотора ВКГГ размером 501 пн (маркер).
Последовательности промоторов первых двух клонов были секвенированы. Анализ последовательности показал, что оба клона содержат химерные формы промоторов ВМЦК и ВКГГ. Размер промотора первого клона составил 905 пн, в начале которого располагается полноразмерный промотор ВМЦК (510 пн), затем идут начало (5’-конец) промотора ВКГГ размером 253 пн, часть фагмидного вектора рКЯХ размером 75 пн (область полилинкера) и в конце находится 3’-участок промотора ВКГГ размером 67 пн. Размер промотора 2-го клона составил 715 пн, в начале которого располагается 5’-конец промотора ВМЦК размером 214 пн, затем полноразмерный промотор ВКГГ (501 пн).
После получения этих результатов был проведен ДНК шаффлинг всех 6-ти смесей промоторов в одноцепочечной форме. После 2-го раунда ПЦР весь пул полученных амплификатов был клонирован в вектор рКЯХ. ПЦР и электрофоретический анализ показали большое разнообразие амплифика-тов по размеру нуклеотидной последовательности.
Наибольшее количество ПЦР продуктов мы клонировали из смесей 1, 4 и 6. Из смесей 2, 3 и 5 удалось клонировать лишь небольшое количество ПЦР продуктов, которые, как стало известно после секвенирования, почти полностью представляли собой полноразмерные промоторы того или иного кау-лимовируса. По 2 клона из смеси 4 и 6 также были секвенированы, и анализ последовательностей показал получение разнообразных химерных промоторов. На данный момент 7 из множества полученных
нами химерных форм промоторов каулимовирусов клонированы в специальные векторы с репортерным геном GUS и начата подготовка экспериментов по определению и сравнению их активности в «бородатых» корнях каланхоэ и трансгенных растениях табака.
Обсуждение результатов
Нами впервые получены химерные формы промоторов каулимовирусов методом ДНК шаф-флинга. Методика ДНК шаффлинга лишь единожды была использована для модификации промо-торной последовательности [4], но она была применена для функционального анализа взамен более трудоемкого промотор-делеционного анализа. Химерные же формы промоторов до этого никогда не получали методом ДНК шаффлинга, для этого исследователи использовали только стандартные методы генной инженерии, связанные с рестрикцией, лигированием и клонированием. Для ДНК шаф-флинга желательно получение родительских последовательностей в одноцепочечной форме, которую обычно получают с помощью фагмидных векторов, но при этом кроме промотора нарабатываются и все другие последовательности нуклеотидов, входящие в состав вектора, что в нашем случае может служить препятствием для эффективной рекомби-
нации. Исходя из этого, с целью наработки одноцепочечных матриц мы впервые применили методику амплификации по типу катящегося кольца. При этом мы получали большое количество ДНК, состоящей, в основном, из одноцепочечных молекул, содержащей огромное количество копий того или иного промотора. Видимо, благодаря этой методике подготовки исходных последовательностей нам удалось получить химерные молекулы методом ДНК шаффлинга, несмотря на низкий уровень гомологии промоторов каулимовирусов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pattanaik S., Dey N., Bhattacharyya S., Maiti I. // Plant Science. 2004. V. 167. P. 427-438.
2. Mitsuhara I., Ugaki M., Hirochika H. // Plant Cell Physiol. 1996. V. 37. P. 49-59.
3. Stemmer W.P.C. // Nature. 1994. V. 8. P. 389-391.
4. Remans T., Grof C.P.L., Ebert P.R. // Bioteaiiques. 2005.
V. 38. P. 209-216.
5. Kikuchi M., Ohnini K., Harayama S. // Gene. 2000. V. 243. P. 133-137.
6. Кулуев Б. Р., Чемерис А. В., Ибрагимов Р. И. // Вестник Башкирск. ун-та. 2007. №2. С. 24-26.
7. Esteban J. A., Salas M., Blanco L. // J. Biol. Chem. 1993.
V. 268. P. 2719-2726.
8. Zhao H., Arnold F. H. // Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. P. 1307-1308.
Поступила в редакцию 11.02.2008 г.
