ПОИСК И РЕКОНСТРУКЦИЯ БЕЛКОВ С ДОМЕНАМИ, УНИКАЛЬНЫМИ ДЛЯ ЦАРСТВА FUNGI, КАК ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ (АНТИГЕННЫХ) МАРКЕРОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЭКСПРЕСС-ТЕСТ-СИСТЕМ ИНДИКАЦИИ МУКОРОМИЦЕТОВ В БИОМАТЕРИАЛАХ ЧЕЛОВЕКА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 582.281.21: 547.96

DOI: 10.24412/1999-6780-2021-3-62-71

ПОИСК И РЕКОНСТРУКЦИЯ БЕЛКОВ С ДОМЕНАМИ, УНИКАЛЬНЫМИ ДЛЯ ЦАРСТВА FUNGI, КАК ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИММУНОХИ-МИЧЕСКИХ (АНТИГЕННЫХ) МАРКЕРОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЭКС-ПРЕСС-ТЕСТ-СИСТЕМ ИНДИКАЦИИ МУКОРОМИЦЕТОВ В БИОМАТЕРИАЛАХ ЧЕЛОВЕКА

Рябинин И.А. (м.н.с., ассистент кафедры)*, Аак О.В. (в.н.с.), Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой)

Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина; кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия

В представленной работе с помощью биоинформационного метода проведен поиск белковых антигенов — потенциальных маркеров для создания тест-систем экс-пресс-диагностики мукормикоза. В качестве основного критерия поиска, обеспечивающего специфичность кан-дидатных полипептидов и минимизирующего вероятность ложноположительного «срабатывания» тест-систем с метаболитами других микроорганизмов и тела человека, выбрано наличие в структуре белков доменов, уникальных для царства Fungi. Определен перечень таких доменов, обнаружены несущие их белки-представители, а с использованием их аминокислотных последовательностей найдены гомологи в протеомах мукоромицетов. Всего для 14-ти доменов обнаружено 8 белков-носителей у представителей подотдела Mucoromycotina. Дальнейший отбор проведен по дополнительным критериям: (1) принадлежность к протеому и/или наличие гомологов среди видов — возбудителей мукормикоза; (2) клеточная локализация; (3) отсутствие гомологов среди белков организма человека. Для реализации второго критерия у кандидатных белков, где это возможно, определили межбелковые взаимодействия. В результате работы выявлены «ядерный» белок — фактор транскрипции Rhi-zopus microsporus, перспективный для получения люмине-сцирующих антител с ifелью выявления мукоромицетов в гистологических срезах, а также цитоплазматические белки - фактор полисахаридного экспорта Lichtheimia corymbifera и механоселективный ионный канал Мисог circinelloides, перспективные для обнаружения в жидких биосубстратах организма человека. В последнюю группу растворимых маркеров после дополнительного изучения может также войти фактор несовместимости гетеро-карионов Мисог circinatus.

THE REVEALING AND RECONSTRUCTION OF PROTEINS WITH DOMAINS UNIQUE FOR THE KINGDOM FUNGI AS PROSPECTIVE IMMUNOCHEMICAL (ANTIGENIC) MARKERS FOR CREATION OF EXPRESS-TEST-SYSTEMS FOR MU-COROMYCETES INDICATION IN HUMAN BIOMATERIALS

Ryabinin I.A. (junior scientific researcher, assistant of the department), Aak O.V. (leading scientific researcher), Vasilyeva N.V. (director of the Institute, head of the department)

North-Western State Medical University named after I.I. Mech-nikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology; Department of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia

In the presented work the search for protein antigens as potential markers for creating test-systems for express-diagnostics of mucormycosis was carried out using bioinfor-matic methods. The presence in the protein structure of domains unique to the kingdom Fungi was chosen as the main search criterion that ensures the specificity of candidate polypeptides and minimizes the likelihood of false positive "triggering" of test-systems with metabolites of other microorganisms and the human body. The list of such domains has been determined, protein-representatives carrying them have been found, and using their amino acid sequences, homologues have been found in the proteomes of mucoromycetes. In total, for 14 domains, 8 carrier proteins were found in representatives of the Mucoromycotina. Further selection was carried out according to additional criteria: (1) belonging to the pro-teome and / or the presence of homologues among the species — the causative agents of mucormycosis; (2) cellular localization; (3) the absence of homologues among the proteins of the human body. To implement the second criterion, protein-protein interactions were determined in candidate proteins, where possible. As a residt of the work, a "nuclear" protein-transcription factor of Rhizopus microsporus, promising for the production of luminescent antibodies in order to detect mucoromycetes in histological sections, was revealed; as well as cytoplasmic proteins - the polysaccharide export factor of lichtheimia corymbifera and the mechanoselective ion channel of Mucor circinelloides, which are promising for detection in liquid biosubstrates of the human organism. The latter group of soluble markers, after additional study, may also include the heterokaiyon incompatibility factor of Mucor circinatus.

Key words: mucormycosis, proteomics, bioinformatics, protein antigens, protein structure

ВВЕДЕНИЕ

Ключевые слова, мукормикоз, протеомика, биоин- Мукормикоз — наиболее тяжелая нозоформа ин-

форматика, белковые антигены, структура белка вазивных микозов, отличающаяся высокой леталь-

--ностью, ограниченным набором эффективных этио-

* Контактное лицо: Рябинин Игорь Андреевич, тройных средств, а в ряде случаев - необходимостью

e-mail: lgor.Ryabinin@szgmu.ru

применения агрессивных тактик хирургического пособия. Пандемия COVID-19 показала, что мукоро-мицеты в ряде случаев могут выступать опасными ассоциантами вируса SARS-CoV-2 при поражении органов дыхания [1, 2]. Традиционные средства лабораторной диагностики мукормикоза — микроскопическое и культурально-микологическое исследование биоматериала, даже с применением наиболее современных средств, имеют ограниченную эффективность. Так, диагностическая чувствительность культурального исследования не превышает 50% [3, 4]. Поэтому не вызывает сомнений актуальность разработки альтернативных средств диагностики, в том числе основанных на методах амплификации нуклеиновых кислот (PCR, LAMP, NASBA, NGS с пробой биоматериала), а также иммунологических методах (иммуноферментный анализ, иммунохеми-люминесценция, иммунохроматография). ПЦР-тест-системы для экспресс-диагностики мукормикоза интенсивно разрабатываются рядом исследовательских коллективов, в том числе НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина [5, 6]. В отношении антигенных маркеров мукоромицеты исторически оказались более сложными объектами, чем ряд других микромицетов. Так, высокую диагностическую эффективность показали приемы определения ман-нанового антигена для распознания инвазивного кандидоза, а также галактоманнана - для инвазивного аспергиллеза. Способы получения полисахарид-ных грибковых антигенов и их свойства детально разработаны и изучены научными школами заслуженных деятелей науки П.Н. Кашкина и Н.П. Блинова (Кашкин П.Н. Медицинская микология, 1962; Единое Н.П. и др. Способ получения маннана. Авторское свидетельство SU 580214 Al, 1977; Единое Н.П. Основы биотехнологии. 1995; Единое Н.П. Противовоспалительные, антисептические и химиотера-певтические средства, 2000). У мукоромицетов попытки найти подходящий полисахаридный маркер долгое время были безрезультатными, однако в литературе появилось сообщение об успешном выявлении в биосубстратах фукоманнана клеточной стенки мукоромицетов при модельной инфекции [7]. Будущие исследования покажут реальную диагностическую ценность такого приема. В качестве альтернативного выхода из сложившейся ситуации имеет смысл рассмотреть обнаружение не полисахарид-ных, а белковых антигенов. В исторической перспективе комплексные секретируемые белковые эк-зоантигены использовали для серодиагностики особо опасных микозов методами встречной иммуно-диффузии и перекрестного иммуноэлектрофореза (Ray J.G., 1967; Kleger В., Kaufman L„ 1973). В нашем оригинальном исследовании ранее для осуществления поиска кандидатного белкового антигенного маркера предложены адгезины мукоромицетов [8]. Важным аспектом выбора диагностических

маркеров является их уникальность, специфичность для конкретного таксона, группы возбудителей, что гарантирует минимизацию ложноположительных ответов исследования. В продолжении ранее проведенного анализа в данной работе поиск новых белковых антигенов проведен не по принципу их биологической функции, а исходя из принципа специфичности, что обусловлено примененным оригинальным критерием отбора кандидатных белков.

Цель исследования: выполнить поиск и реконструкцию белков с доменами, уникальными для царства Fungi, а также определить их гомологи среди мукоромицетов, имеющих медицинское значение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поиск царство-специфичных доменов в соответствии с целью работы выполнили в базе данных Pfam, а белковых последовательностей, у которых распознаны такие домены, — в UniProt. При использовании UniProt предпочтение в выборе отдавали тем последовательностям, которые принадлежат микромицетам, имеющим медицинское значение, либо родственным возбудителям микозов. Для воссоздания вторичной и третичной структуры применили редактор Swiss-Model [9, 10], при отображении результатов реконструкции использовали встроенный алгоритм NGL Viewer (построение «веревочной» диаграммы с маркированием типов вторичной структуры). Если при реконструкции получали несколько моделей для нескольких фрагментов изучаемого белка, то в редакторе Swiss-Model получали их суперпозицию. В тех случаях, когда суперпозиция была неинформативна (альтернативные модели для одного и того же фрагмента или белка целиком либо смоделированные фрагменты белковой молекулы находятся в молекуле на большом расстоянии), полученные модели выкопировали по отдельности. Фиксировали стандартные показатели точности реконструкции (GMQE, QMEAN4). Редактирование полученных диаграмм провели в XnView 2.35 и InfanView 4.38. Поиск гомологов данных белков у мукоромицетов осуществляли с применением ресурса protein-BLAST. В работе использовали белковые последовательности, доступные через ресурс NCBI и депонированные под №№

tr | АО А2 G4T2Z01 АО А2 G4T2Z0RHIZD; tr |А0 A3 A2Z4F71 АО A3 A2Z4F79EURO; sp | Q4 WLB 91CFM A_ASPFU; tr|093865|093865_CANAX; tr|AOA5N6F3K6|AOA5N6F3K6_9EURO; tr|A0A0J5Q677|A0A0J5Q677_ASPFM; tr |A0 A1L2F5J11A0A1L2F5 J1 9AGAM; trjA0A319C3W1 |AOA319C3W1_9EURO; sp|P78742|BBl l_SCHCO; sp|Q6UlZ4|CMTl_CRYNJ; tr|A8N2S9|A8N2S9_COPC7; tr|A0A0J5Q677|A0A0J5Q677_ASPFM; KAG2218775.1; OBZ89654.1; EIE88714.1;

CDH56447.1; KAG1437500.1; OZJÛ1513.1; RUS35244.1. Моделирование межбелковых взаимодействий выполнили в редакторе STRING 11.5 с дополнительным анализом функциональных свойств белковых доменов с помощью базы SMART. Для каждого найденного белка-носителя уникального домена в ресурсе Protein BLAST выявляли разнообразие гомологов у других мукоромицетов, исключая тот род, к которому принадлежит первично установленный обладатель такого белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты анализа в кратком виде представлены в таблице 1 (итоги первичного поиска и показатели качества построения структуры белковой молекулы) и таблице 2 (гомологи определенных белков у мукоромицетов). А результаты структурной реконструкции белков-носителей уникальных доменов, найденных при первичном поиске, опубликованы нами ранее [11]. С картинами реконструкции можно ознакомиться по электронной ссылке: https://mycology.szgmu.ru/images/files/2021/posters_20 21/28_РябининИА_Структурная.рс^

Таблица 1

Белковые домены, специфичные для грибов, примеры белков, несущие такие домены, показатели точности их структурной реконструкции

ассоции-рованный с протеин-киназами 667 (ЕНА23 285.1) (Aspergillus niger)

N- концевой домен «Goodbye» PF17 109 А0А254 UFR7 Дезаминаза12 (Aspergillus niger) 0,23 -3,78 +

Домен несовместимости гетерока-рионов PF06 985 A2QF15 Белок типа несовместимости гете-рокариона1 (Aspergillus niger) 0,01 0,02 -3,50 -6,06 +

Белок регуляции прионной инфекции PF14 479 А0А318 ZQU1 Белок, участвующий в регуляции прионной инфекции1 (Aspergillus saccharolyticus) 0,24 0,07 -2,06 -6,08 +

CFEM-домен PF05 730 Q4WLB 9 Гликозилфосфа- тидилинозитол- связывающий белок-гемофор cfmA (Aspergillus fumigatus) 0,08 -4,99 -

Домен криптокок- ковых маннозил- трансфе- раз PF11 735 Q6U1Z4 а-1,3- маннозилтранс-фераза СМИ1 (Cryptococcus neoformans) 0,21 -8,27 -

С - терминальный гомеодо-мен 1 PF12 737 A8N2S9 Белок 1-ß, ассоциированный с половым процессом1 (Coprinopsis cinerea) 0,04 0,03 -2,45 0,08 + +

Домен грибковых феромонов PF08 015 Р78742 Феромон ВВР 1, ассоциированный с половым процессом (Schizophyllum commune) 0,09 -2.95 +

Примечания: (1) молекула реконструирована частично; (2 для

дезаминазы A. niger (A0A254UFR7) воссоздали 4 фрагмента, для краткости приведены данные по первому, который реконструирован наиболее достоверно. «GMQE» и «QMEAN» - показатели точности реконструкции в редакторе Swiss-Model.

В результате проведенного поиска обнаружили 14 уникальных доменов. Подбор белков-представителей удалось провести среди родов аско-мицетов, имеющих медицинское значение — Aspergillus, Rhizopus, Candida, дрожжевого базидиомицета рода Cryptococcus, а также мицслиальных базидио-мицетов Schizophyllum commune (условно-патогенный) и Coprinopsis cinerea (непатогенный). Белки с установленными уникальными доменами имеют различные, не связанные общим процессом биологические функции. Далее приведена их краткая характеристика по данным Pfam. Так, домены PF04082 и PF 11951 встречаются в факторах транскрипции и грибов, что отражено в их названии. Домены PF05792, PF07938 и PF07367 являются функ-

Эцен-

Домены № в Pfam Пример в Uni-Prot Белок - представитель и его продуцент GM QE QM EAN ка точности модели

Домен фактора транскрипции 1 PF04 082 A0A2G4 T2Z0 Фактор транскрипции, специфичный для грибов (Rhizopus microsporus) 0,40 -5,79 -

Домен фактора транскрипции 2 PF11 951 B8N348 Фактор транскрипции, специфичный для грибов NosA1 (Aspergillus flavus) 0,05 0,02 -2,56 -1,66 + +

СапсИс/а-

специ-фичные агглюти-нин- подобные белки PF05 792 093865 Агглютинин-подобный белок1 (Candida albicans) 0,18 0,14 +

Фукозо-специ-фичный лектин PF07 938 Q4WW8 1 Фукозо- специфичный лектин (Aspergillus fumigatus) 0,98 0,07 +

Пектин плодового тела PF07 367 А0А5МЗ ZGS6 Белок типа лекти-на плодового тела (Aspergillus terreus) 0,68 -1,98 +

Домен, ассоциированный с протеин-киназами PF16 797 А0А319 C3W1 Сериновая/трео-ниновая протеин-киназа1 (Aspergillus uvarum) 0,08 0,07 -2,79 -0,99 + +

Домен, PF17 G3Y146 Протеинкиназа1 0,19 -5,14 -

циональной основой грибковых лектинов — адгезивных молекул; первый из них специфичен для Candida spp., а последний встречается в плодовых телах базидиомицетов. Такие лектины обладают инсектицидной активностью и, по-видимому, защищают плодовое тело от вредителей. Примечательно, что белок с доменом типа лектина плодового тела, которые считают типичными для высших базидиомицетов, удалось обнаружить у возбудителя аспер-гиллеза Aspergillus terreus. Белки с доменами PF06985 (белок несовместимости гетерокарионов у аскомицетов), PF12737 и PF08015 (преимущественно белки базидиомицетов, вероятно, связаны с распознаванием партнера) участвуют в половых процессах грибов. Два домена связаны с протеинкиназами: PF16797 характерен для С-концевой части септин-ассоциированных киназ дрожжей, тропен к кислым фосфолипидам, a PF17667 можно встретить в структуре различных протеинкиназ и высших грибов — аскомицетов и базидиомицетов. Домен PF11735, как полагали ранее, был характерен исключительно для а-1,3-маннозилтрансфераз Cryplococcus spp., где они участвуют в формировании капсулы. Настоящее исследование показало, что белки с таким доменом могут быть и у других микромицетов. Домен PF05730, или иначе CFEM-домен (домен, обогащенный цистеином), типичен для ряда белков, ассоциированных с цитоплазматической мембраной клетки гриба, внеклеточными липопротеидами, а в функциональном отношении - с патогенным действием гриба. Показано, что типы белков с CFEM-доменом более разнообразны у фитопатогенных грибов, чем у возбудителей микозов человека и животных; есть они и у грибов-аллергопродуцентов [12]. N-концевой домен PF14479 участвует в регуляции течения прионной инфекции у ряда грибов. Функция домена PF17109 («Goodby-домен») точно не установлена, по всей вероятности, он — представитель обширной группы «DUF» (домены неизвестной функции) — аминокислотные мотивы, закономерно повторяющиеся в структуре различных белков, но не снабженные точной функциональной характеристикой. Однако известно, что «Goodby-домен» входит в состав так называемых STAND-белков у микромицетов (англ. Signal Transduction ATPases with Numerous Domains, многодоменные сигнал-передающие АТФазы). Роли STAND-белков чрезвычайно многообразны — это регуляторы многих процессов, включая управление транскрипцией генов, клеточный ответ на инфекцию и запуск апоптоза; они встречаются у всех клеточных организмов — бактерий, архей и эукариот (Leipe D.D., et al. J. Mol. Biol., 2004).

Из 14-ти найденных на первом этапе белков у 9 (64,3%) реконструкцию удалось провести не для всей глобулы, а только для фрагментов. Этот эффект можно связать с наличием у реконструируемых бел-

ковых глобул такого типа строения, который еще не охватили рентгеноструктурным анализом. Также опосредованно данное обстоятельство указывает на очевидную антигенную уникальность исследуемых белков, для которых не нашли полных совпадений в базе оцифрованных кристаллографических структур Swiss Model Template Library. Аналогичную ситуацию наблюдали в отношении 4-х белков, модели которых получены с невысокими показателями достоверности (в соответствующей графе таблицы «-»).

В результате поиска белков-носителей 14-ти уникальных доменов среди мукоромицетов (подотдел Mucoromycotina) удалось обнаружить 8 представителей, один из них (фактор транскрипции) был найден еще на первом этапе поиска в протеоме Rhi-zopus microsporia (табл. 2).

Таблица 2

Белки мукоромицетов с доменами, уникальными для цар-

ства Fungi

№ Домены, уникальные для микромицетов Белки-носители уникальных доменов у мукоромицетов

1 Домен фактора транскрипции 1 Фактор транскрипции, специфичный для грибов ЯЛ/горив т'югозрогиз (обнаружен при первичном поиске)

2 Домен фактора транскрипции 2 нет близких совпадений

3 CaMda-специфичные агглютинин-подобные белки нет близких совпадений

4 Фукозо-специфичный лектин нет близких совпадений

5 Пектин плодового тела нет близких совпадений

6 Домен, ассоциированный с протеинкиназами Гипотетический белок ЯЛ/горив с!е1етаг

7 Домен, ассоциированный с протеинкиназами Гипотетический белок Лтдегдетапша Ааттюогопа

8 N-концевой домен «Goodbye» Механоселективный ионный канал 10 СИоаперИога сисигЬНагит

9 Домен несовместимости гетерокарионов Гипотетический белок Мисог С/ГС/ЛЭ^5

10 Белок регуляции прионной инфекции Гипотетический белок ВШдига(ив ас/е/а/с/ае

11 CFEM-домен нет близких совпадений

12 Домен криптококковых маннозил-трансфераз Белок полисахаридного экспорта ИсМЬеШа согутЬМега

13 С-терминальный го-меодомен 1 Гипотетический белок ЯЛ/горив с!е1етаг

14 Домен грибковых феромонов нет близких совпадений

Результаты их структурной реконструкции показаны на рисунках 1, 2 и 3. Среди мукоромицетов, имеющих такие белки, — представители медицински значимых родов ЫсЫЬет^а, ЯЫгорш и Мисог, а также трех родов, медицинское значение которых не было показано (Н'ф^игаШн, СИоалерИога и Jimgerde-тапта). Однако такие микроскопические грибы имеют известное экологическое и хозяйственное значение, а именно: СИоаперИога сисигЬНагшп - фи-

топатоген, известный вредитель тыквенных [13]; Jimgerdemanma /1атт1согопа - симбионт растений семейства сосновых, с которыми отмечено формирование эктомикоризы на стадии саженца; кроме того, спорокарпами джимгердемании питаются некоторые лесные грызуны [14]. Н'ф^игаШн ade¡aidae

T.J. Torres-Cruz & A. Porras-Alfaro - недавно открытый мукоромицет (2017 г.), отличающийся способностью к диморфизму [15], его изоляты и генетический материал получали из почвы сосновых лесов.

С-концевой фрагмент (гомогептамер) механоселективного ионного канала 10 _Choanephora cucurbitarum_

аш.

Вид канала со стороны внешнего домена

Вид канала со стороны трансмембранного домена

Вид в условном цифровом «сечении» молекулы Вид в условном цифровом «сечении» молекулы через внутреннее кольцо бета-складчатых через внутреннее кольцо бета-складчатых структур на трансмембранный домен структур на внешний домен

Вид в боковой проекции: внешний домен слева, трансмембранный домен справа, между ними внутренне кольцо бета-складчатых

структур_

GMQE=0,10; QMEAN4= -4,88; общая оценка точности модели «-»__

Рис. 1. Результаты структурной реконструкции белков мукоромицетов с доменами, уникальными для царства Fungi. Часть 1.

GMQE=0,02; QMEAN4= -2,82; общая оценка точности модели «-»

Гипотетический белок ПЫгориБ с1е1етаг (ЯЛ. огугае йог. с1е1етаг) - гомолог сериновой/треониновой протеинкиназы: группа моделей в одной проекции

GMQE= 0,22; QMEAN4= -0,64; общая оценка точности модели «+»

GMQE= 0,22; QMEAN4= -1,80; общая оценка точности модели «+»

GMQE= 0,20; QMEAN4= -2,19; общая оценка точности модели «+»

GMQE= 0,20; QMEAN4= -2,18; общая оценка точности модели «+»

Белок экспорта полисахарида Lichtheimia corymbifera - гомолог а-1,3-маннозилтрансферазы

GMQE= 0,25; QMEAN4= -8,10; общая оценка точности модели «-»

GMQE= 0,09; QMEAN4= -5,50; общая оценка точности модели «-»

GMQE= 0,07; QMEAN4= -6,67; общая оценка точности модели «-»

Гипотетический белок Я/). Ье1етаг (Я/?, огугае \/аг. с!е1етаг) - гомолог белка скрещивания 1Р: суперпозиция двух альтернативных моделей

GMQE= 0,13; QMEAN4= -2,90; общая оценка точности модели «+»

GMQE= 0,25; QMEAN4= 0,03; общая оценка точности модели «+»

С-терминальные фрагменты (гомодимеры) гипотетического белка Мисог агстМиБ (возможно ДНК-связывающего, участвующего в регуляции транскрипции)

4. ^

L ¿У(г < ¡1

4

GMQE=0,05; QMEAN4=-5,37, общая оценка точности модели «-»

GMQE=0,05; QMEAN4=-4,80; общая оценка точности модели «-»

Рис. 2. Результаты структурной реконструкции белков мукоромицетов с доменами, уникальными для царства Fungi. Часть 2.

Фрагменты гипотетического белка ВфдигМи5 абе1а'1с1ае - гомолога белка, участвующего в _регуляции прионной инфекции: суперпозиция_

GMQE= 0,01; QMEAN4= -1,81; общая оценка точности модели «+»

Фрагмент гипотетического белка Jimgerdemannia flammlcorona - гомолог протеинкиназы _Aspergillus niger: представлены альтернативные модели_

6М0Е= 0,07; ЦМЕАЫ4= -6,19; СМЦЕ= 0,10; ОМЕАЫ4= -5,06;

общая оценка точности модели «-» общая оценка точности модели «-»

КАРТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ НЕКОТОРЫХ ОБНАРУЖЕННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ

Гипотетический белок Rh. delemar - гомолог сериновой / треониновой протеинкиназы

Гипотетический белок Rh. delemar - гомолог белка скрещивания lß

Рис. 3. Результаты структурной реконструкции белков мукоромицетов с доменами, уникальными для царства Fungi. Часть 3. Сети взаимодействий некоторых обнаруженных белков.

GMQE= 0,13;

QMEAN4=

-5,53; общая

оценка

точности

модели «-»

(гомодимер)

I1CPJ8

I1CMM2

I1C4B4

I1CDH9

I1CPB6

Ключом к пониманию функционального предназначения обнаруженных белков, большинство из которых выявлено только на этапе аннотирования генома и имеет статус «гипотетических», является анализ их взаимодействия с другими белками клетки на различных уровнях. Для подавляющего большинства найденных белков мукоромицетов такие данные установить не удалось, но у двух представителей — гомологов сериновой/треониновой протеинкиназы и белка полового процесса R. oryzae var. delemar удалось построить соответствующие функциональные сети. Так, полипептиды, связанные с гомологом сериновой/треониновой протеникиназы (I1CJT4, схема на Рис. 3), можно разделить на две группы: первая — связанные с поисковым белком и не взаимодействующие между собой, вторая — взаимодействующие с поисковым белком и между собой. В первую группу входят 5 белков, 4 из них (I1CMM2, I1CPJ8, I1C4B4 и I1C796) являются факторами сборки нуклеосом, еще один белок не снабжен подробной аннотацией (I1BVA6). Гены белков первой группы с поисковым белком с высокой вероятностью подверглись процессу слияния {англ. «gene fusion»). Во второй группе присутствует протеинкиназа I1CK04 и S-аденозил-Ь-метионин-(8АМ)-зависимая мети-

лтрансфераза класса I (с так называемой «складкой Россмана», I1CPB6), а также 3 белка неизвестной функции (I1CNS3, I1BQ31, I1CDH9). Белки второй группы с определенной вероятностью экспрессиру-ются совместно с поисковым белком. При расширении сети взаимодействия во второй группе обнаруживаются другие протиенкиназы, а также представитель семейства циклинов — белков-регуляторов клеточного цикла; на расширенной сети можно увидеть связи белков первой и второй групп.

У белка R. oryzae, ассоциированного с половым процессом, непосредственное взаимодействие происходит с тремя деацетилазами гистонов (I1C9K5, I1CFS9 и I1BR92), которые связаны между собой, а также с двумя белками неустановленной функции (I1BSE0, I1C6H0). Последние два, наряду с поисковым белком, обладают доменом «НОХ» (homeobox) — ДНК-связывающий домен белков-регуляторов транскрипции. При расширении сети взаимодействия удается выявить еще 10 белков, которые функционально связаны друг с другом, а с поисковым белком взаимодействие происходит не напрямую, а через одну из трех деацетилаз гистонов. Эти белки не имеют функциональной аннотации, однако в их структуре выявили консервативные домены. Среди таких доменов: «SANT» (ДНК-связывающий, участвует в ремоделировании хроматина), «WD40» ((3-трансдуциновый повтор, встречающийся в регуляторах транскрипции), «PHD» (цинковый палец, характерный для растений; типичен для ядерных белков, участвующих в эпигенетических процессах); «SET» (метилтрансферазный домен, необходим для

обмена гистонов), «РАН» (парная амфипатическая спираль, входит в состав ингибиторов транскрипции), «HDAC» (регулятор транскрипции, связанный с ацетилазами гистонов), «Sin3a_C» и «Sds3» (другие домены ингибиторов транскрипции), «CHROMO» и «MRG» (участвуют в ремоделировании хроматина).

Таким образом, оба белка, для которых удалось изучить карту взаимодействий, представляют собой ядерные факторы, участвующие в регуляции экспрессии генов микромицетов и R. oryzae, в частности.

Для понимания того, в какой степени те или иные обнаруженные белки можно использовать в качестве маркеров для детекции широкого круга мукоромицетов, либо, напротив, они обладают узкой таксономической специфичностью, представляет интерес круг гомологов. Как оказалось, фактор транскрипции R. microsporias, механоселективный ионный канал Choanephora cucurbitarum, а также белок-носитель гомеодомена 1 R. oryzae имеют не менее 100 близких гомологов (максимальное количество, отображаемое Protein BLAST «по умолчанию») среди нескольких десятков видов мукоромицетов. У неспецифической сериновой/треониновой протеинкиназы R. oryzae также не менее 100 гомологов, но значительная часть из них принадлежит непатогенным мукоромицетам. Гомологи (100) белка несовместимости гетерокарионов M. circinatus встречаются, главным образом, у различных представителей рода Rhizopus. В то же время белок экспорта полисахаридов L. corymbifera имеет всего 12 гомологов. БелкиJ. flammicorona и В. adelaidae имеют всего 21 и 3 гомолога соответственно среди мукоромицетов других родов, но почти исключительно у непатогенных видов.

Поскольку С. cucurbitarum — непатогенный для человека вид, в качестве маркерного белка имеет смысл использовать ее гомолог у M. circinelloides (последовательность №ЕРВ93018.1). Этот белок имеет более 100 гомологов среди других мукоромицетов, включая представителей всех основных возбудителей мукормикоза человека. Он также несет домен трансмембранного механоселективного канала. Его межбелковое взаимодействие своеобразно: непосредственная связь имеется только с фосфогли-цераткиназой (их гены соседствуют в геноме), но через нее отрывается связь с группой из 10 тесно взаимодействующих белков, связанных с реакциями превращения углеводов и гликолизом, в частности (их гены также соседствуют и экспрессируются совместно). Такие белки включают: енолазы, альдолазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, триозо-фосфатизомеразу, глюкозо-6-фосфат-изомеразу и фосфоглицерат-мутазу.

На следующем этапе для обнаруженных канди-датных белков выявляли гомологи в протеоме чело-

века, чтобы предупредить случаи ложного срабатывания тестов с нормальными компонентами клеток и тканей. Как оказалось, отдаленные гомологи имеются у сериновой/треониновой протеинкиназы и белка-носителя гомеодомена 1 К. огугае \>аг. с!е!етаг, хотя степень сходства с белками человека невелика (Е-уровень составил, соответственно, 5е-103 и Зе-21).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенного исследования установлены белки мукоромицетов, обладающие доменами, уникальными для царства Рип-gi, которые в разной степени подходят на роль маркеров для экспресс-диагностики мукормикоза. Про-теинкиназа J. /Iаттгсогопа и регулятор прионной инфекции В. а(]е1шс1ае следует однозначно исключить из перечня перспективных маркеров по причине распространения подобных белков лишь у немногих видов апатогенных мукоромицетов. Также целесообразно исключить из круга кандидатов для дальнейшей работы ядерные белки — серино-вую/треониновую протеинкиназу и белок-носитель гомеодомена 1 К. огугае уаг. с!е1етаг по причине наличия общих аминокислотных мотивов с некоторыми белками человека. Фактор транскрипции Я. тюгозрогия является ядерным белком, его выделение из растущих гиф возбудителей мукормикоза маловероятно. Такой белковый маркер можно рассматривать для получения люминесцирующих антител с целью обнаружения мукоромицетов в гистологиче-

ских срезах путем постановки реакции иммунофлуо-ресценции. Белок несовместимости гетерокарионов М. с1гс1па1ин может быть потенциальным маркером для выявления Мисог эрр. и Як^горш эрр., однако, поскольку он тесно связан с половым процессом, а вирулентная форма возбудителя в организме человека, как правило, находится в анаморфном состоянии, следует проверить факт выделения такого полипептида в биологические жидкости человека экспериментально. Аналогично следует проверить этот факт и для белка полисахаридного экспорта Ь. согутЫ/ега (узкоспецифичный маркер этого вида) и механосе-лективный ионный канал М. си"стеПо1ёе,н (широкий маркер). Эти белки являются трансмембранными, локализованными на ЦПМ, поэтому могут выделяться в биологические жидкости организма человека при росте гиф, следовательно, их следует рассматривать в качестве наиболее перспективных маркеров для создания тест-систем типа иммунофер-ментного анализа или иммунохемилюминесценции для экспресс-обнаружения мукоромицетов в исследованиях сыворотки, промывных вод бронхов и па-раназальных синусов, других биосубстратах.

Работа выполнена в рамках Государственного задания Минздрава России «Морфо-биологические особенности патогенных мукоромицетов - возбудителей микозов у пациентов с иммунодефицита-ми» (№АААА-А19-119053190038-8).

ЛИТЕРАТУРА

1. Singh А.К., Singh R., Joshi S.R., Misra A. Mucormycosis in COVID-19: A systematic review of cases reported worldwide and in India. Diabetes Metab. Syndr. 2021; 15 (4): 102146. doi:10.1016/j.dsx.2021.05.019.

2. Gupta A., Sharma A., Chakrabarti A. The emergence of post-COVID-19 mucormycosis in India. Indian Journal of Ophthalmology. 2021; 69 (7): 1645-1647. doi: 10.4103/ijo.IJ0 1392_21.

3. Skiada A., Pavleas I., Drogari-Apiranthitou M. Epidemiology and diagnosis of mucormycosis: an update. J. Fungi (Basel). 2020; 6 (4): 265. doi: 10.3390/jof6040265.

4. Lackner N., Posch W., Lass-Florl C. Microbiological and molecular diagnosis of mucormycosis: from old to new. Microorganisms. 2021; 9 (7): 1518. doi: 10.3390/microorganisms9071518.

5. Игнатьева C.M., Спиридонова В.А., Богомолова Т. С. и др. Апробация мультиплексной тест-системы «HRM-Zygo-Asp» на клиническом материале больных мукормикозами. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (4): 36-42. [Ignatieva S.M., Spiridonova V.A., Bogomolova T.S., et al. Approbation of multiplex test system «HRM-Zygo-Asp» on the clinical material of patients with mucormycosis. Problems in Medical Mycology. 2019; 21 (4): 36-42 (In Russ)]. doi: 10.24412/1999-6780-2019-4-36-42.

6. Игнатьева C.M. и др. Мультиплексная ПЦР-тест-система с детекцией в режиме реального времени для одновременного выявления и идентификации аспергиллов и мукоромицетов в клиническом материале больных микозами. «Молекулярная диагностика 2017». Сборник трудов IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. 2017: 442-443. [Ignatieva S.M., et al. Multiplex PCR test system with real-time detection for simultaneous detection and identification of Aspergillus and mucoromycetes in the clinical material of patients with mycoses. "Molecular Diagnostics 2017". Materials of the IV Ail-Russian Scientific and Practical Conference with international participation. 2017: 442-443 (In Russ)].

7. Orne ('. , Burnham-Marusich A., Baldin ('., et al. Cell wall fucomannan is a biomarker for diagnosis of invasive murine mucormycosis. 28th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Madrid, Spain, 21-24 April 2018: О 0121.

8. Рябинин И.А., Ковыршин С.В., Бузмакова А.Л., Васильева Н.В. Особенности белков-адгезинов Мисог lusitani-cus и Aspergillus clavatus в сравнении с адгезинами некоторых микромицетов и бактерий. Проблемы медицинской

микологии. 2021; 23 (1): 46-52. [Ryabinin I.A., Kovyrschyn S.V., Buzmakova A.L., Vasilyeva N.V. Features of Mucor lusitanicus and Aspergillus clavatus adhesive proteins in comparison with adhesins of some micromycetes and bacteria. Problems in Medical Mycology. 2021; 23 (1): 46-52 (In Russ)].

9. Studer G., et al. QMEANDisCo-distance constraints applied on model quality estimation. Bioinformatics. 2020; 36 (6):1765-1771. doi: 10.1093/bioinformatics/btz828.

10. Waterhouse A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Res. 2018; 46 (Wl): W296-W303. doi: 10.1093/nar/gky427.

11. Рябинин И.А., Васильева H.B. Структурная реконструкция белков микромицетов с доменами, уникальными для царства Fungi. Проблемы медицинской микологии. 2021; 23 (2): 133. [Ryabinin I.A., Vasilyeva N.V. Structural reconstruction of micromycetes proteins with domains unique for kingdom Fungi. Problems in Medical Mycology. 2021; 23 (2): 133 (In Russ)].

12. Рябинин И.А., Васильева H.В., Богданова T.B. Белки Pénicillium chrysogenum, выявляемые при MALDI-TOF-масс-спектрометрии клеточного экстракта. Микология и фитопатология. 2020; 54 (6): 436-445 [Ryabinin I.A., Vasilyeva N.V., Bogdanova TV. Proteins of Pénicillium chrysogenum detected by MALDI-TOF mass spectrometry of cell extract. Mycology and phytopathology. 2020; 54 (6): 436-445 (In Russ)]. doi: 10.31857/S0026364820060094.

13. Min В., et al. Genome analysis of a zygomycete fungus Choanephora cucurbitarum elucidates necrotrophic features including bacterial genes related to plant colonization. Sei. Rep. 2017; 7: 40432. doi: 10.1038/srep40432

14. Desirà A., et al. Multigene phylogeny of Endogonales, an early diverging lineage of fungi associated with plants. IMA Fungus. 2017; 8 (2): 245-257. doi: 10.5598/imafungus.2017.08.02.03.

15. Torres-Cruz T.J., et al. Bifiguratus adelaidae, gen. et sp. nov., a new member of Mucoromycotina in endophytic and soil-dwelling habitats. Mycologia. 2017; 109 (3): 363-378. doi: 10.1080/00275514.2017.1364958.

Поступила в редакцию журнала 23.08.2021 Рецензент: Т. С. Богомолова