CC BY
0
DOI: 10.48612/sbornik-2024-1-50 УДК 579.62:636.3
ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА
Громова Елизавета Алексеевна, канд. биол. наук
Додонова Екатерина Алексеевна
Миргазов Динис Анатолиевич
Елизарова Инна Анатольевна
Осянин Константин Анатольевич, канд. биол. наук
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань, Российская Федерация
В рамках настоящей работы проведен биоинформационный анализ нуклеотидных последовательности геномов видов B. melitensis и B. ovis, представленных в базе данных GenBank. Определены маркерные последовательности, позволяющие идентифицировать представителей данных видов бруцелл. Сконструированы праймеры и TaqMan-зонды для ПЦР-РВ индикации возбудителей бруцеллеза в условиях одной пробирки. При постановке ПЦР с ДНК B. melitensis 16M и B. ovis 90 показано, что разработанные праймеры обладают 100 % специфичностью. Также установлено, что результативность мультиплексной ПЦР-РВ полностью совпадает с эффективностью аналогичных моноплексных ПЦР-РВ.
Ключевые слова: бруцеллез; мелкий рогатый скот; Brucella melitensis; Brucella ovis ПЦР; идентификация
SELECTION OF PRIMERS AND OPTIMIZATION OF CONDITIONS FOR CARRYING OUT THE POLYMERASE CHAIN REACTION FOR DETECTING THE CAUSE OF BRUCELLOSIS IN SMALL CATTLE
Gromova Elizaveta Alekseevna, PhD Biol .Sci.
Dodonova Ekaterina Alekseevna
Mirgazov Dinis Anatolievich
Elizarova Inna Anatolyevna,
Osyanin Konstantin Anatolyevich, PhD Biol .Sci.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russian Federation
In this work, a bioinformatic analysis of the nucleotide sequences of the genomes of the species of B. melitensis and B. ovis from the GenBank database was carried out. Marker sequences have been determined that make it possible to identify representatives of these Brucella species. Primers and TaqMan probes were designed for RT-PCR indication of brucellosis pathogens in one tube. When performing PCR with DNA of B. melitensis 16M and B. ovis 90, it was shown that the developed primers had 100% specificity. It was also found that the effectiveness of multiplex RT-PCR completely coincides with the effectiveness of similar monoplex RT-PCR.
Key words: brucellosis; small cattle; Brucella melitensis; Brucella ovis; PCR; identification
Бруцеллез мелкого рогатого скота - это опасное зоонозное инфекционное заболевание, этиологическим агентом которого являются бактерии видов Brucella melitensis (основной хозяин - козы, овцы) и Brucella ovis (бараны, овцы) [4, 6]. Инфицирование человека данными патогенными бактериями ассоциировано, как правило, с профессиональной
деятельностью и происходит при непосредственном контакте с зараженными животными. Также инфицирование может происходить при употреблении в пищу не пастеризованных продуктов питания, полученных из зараженного сырья [3, 6]. В основе традиционного подхода к диагностике бруцеллеза лежит непосредственное выделение возбуди-
теля данного заболевания из биологических жидкостей и патологического материала, что является достаточно трудоемким и затратным по времени процессом, а также сопряжено с высокими рисками для здоровья проводящего исследования персонала. Наиболее эффективными и безопасными подходами лабораторной диагностики являются методики, основанные на молекулярно-генетических методах [2]. Быстрая и точная идентификация вида возбудителя возможна при использовании ПЦР, основу которой составляет биоинформационный анализ [1, 37]. Целью данной работы явился подбор праймеров и флуоресцентно-меченных зондов, пригодных для обнаружения и дифференциации видов B. melitensis и B. ovis с помощью ПЦР в режиме реального времени.
Методика исследований. Объектом исследования явились образцы ДНК бруцелл, выделенные нами ранее из бактерий B. suis 1330, B. melitensis 16M и B. ovis 90 [1]. Биоинформационный анализ проводили с помощью
Для определения оптимальной температуры отжига праймеров использовали образцы ДНК штаммов В. твШвпз1з 16M и В. 90. С этой целью проводили ПЦР с использованием температурного градиента амплификации (от 58°С до 65°С). На основании полу-
приложения AlignX программного пакета «Vector NTI 9.1.0» и в программе «BLASTn». Дизайн синтетических олигонуклеотидов праймеров и зондов проводили, используя программу «Vector NTI 9.1.0». ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили на ДНК-амплификаторе С1000 с оптическим блоком CFX96 («Bio-Rad», Сингапур) с применением готовой реакционной смеси 5х qPCRmix-HS («Евроген», Россия).
Результаты исследований и их обсуждение. Путем поисковых запросов в банке данных GenBank найдено 70 полногеномных сиквенса B. melitensis и три - B. ovis. В результате множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей геномов бруцелл были определены маркерные локу-сы, пригодные для идентификации видов B. melitensis и B. ovis. В пределах данных локусов произведен дизайн праймеров (прямой и обратный) и зондов для ПЦР-РВ. Данные о подобранных локусах, красителях и гасителях флуоресценции представлены в таблице 1.
ченных результатов была определена оптимальная температура отжига праймеров -61°С и TaqMan-зондов - 64°С, а также составлена рабочая программа амплификации (таблица 2).
Этап Температура Продолжительность
Начальная денатурация 95 °C 5 мин
5 циклов:
Денатурация 95 °C 15 с
Отжиг 61°C 35 с
40 циклов:
Денатурация 94 °C 15 с
Отжиг 61°C 35 с
Таблица 1 - Характеристика специфических локусов, подобранных для индикации видов В. melitensis и В. ovis
Вид Локус Локализация в геноме (GenBank) Канал детекции Комбинация зонда и гасителя флуоресценции
B. melitensis C0R52_12390 II хромосома: CP026006.1: 906042906524 Cy5 Cy5-BHQ2
B. ovis BOV_A0504 II хромосома: CP000709.1:523428-525023 HEX R6G- BHQ1
Таблица 2 - Программа амплификации для разработанных праймеров
Определение специфичности разработанных праймеров проводили путем амплификации ДНК штаммов бруцелл B. melitensis 16M, B. ovis 90 и B. suis 1330 в условиях мультиплексной ПЦР. Как видно из результатов, представленных в таблице 3, при проведении ПЦР-РВ с ДНК B. melitensis 16M и B. ovis 90 происходит стабильное нарастание уровня
Также провели оценку результативности мультиплексной ПЦР-РВ в сравнении с ПЦР, проводимой в моноплексном формате. Для оценки эффективности мультиплексной ПЦР-РВ использовали образцы ДНК штаммов B. suis 1330, B. ovis 90 и B. melitensis 16M, полученные путем серии десятикратных разведений ДНК данных бактерий из начальной концентрации 30 нг/мкл.
Установили, что средняя разница между значениями порогового цикла (Ct) при проведении амплификации с ДНК одних и тех же образцов ДНК бруцелл составила менее одного цикла. Таким образом, эффективность каждой реакций, проводимой в формате мультиплексной ПЦР-РВ, полностью совпадала с аналогичными характеристиками для моноплексных ПЦР.
Выводы. Разработанные в рамках данного исследования праймеры и зонды могут быть использованы в качестве основы для построения мультиплексной ПЦР тест-системы, пригодной для идентификации представителей видов B. melitensis и B. ovis.
Список литературы
1. Пономаренко Д. Г. Анализ заболеваемости бруцеллезом и молекулярно-генетическая характеристика популяции бруцелл на территории Российской Федерации / Д. Г. Пономаренко, А. А. Хачатурова, Д. А. Ковалев [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2023. -№ 2. - С. 61-74.
2. Насибуллин Р. Ю. Бруцеллез: его распространение и профилактика / Р. Ю. Насибуллин, Л. А. Тухватуллина, Я. А. Богова [и др.] // Ветеринарный врач. - 2021. - № 1. - С. 38-43.
3. Анисимова Е. А. Использование кривых
флюоресценции по каналам Су5 и HEX, соответственно. Для штамма B. suis 1330, использованного нами в качестве отрицательного контроля, флуоресценция не регистрировалась ни по одному из каналов. Таким образом, можно заключить, что разработанные праймеры обладают 100 % специфичностью.
плавления ампликонов VNTR-локусов для идентификации бруцелл / Е. А. Анисимова, Д. А. Миргазов, Е. А. Додонова [и др.] // Перспективы развития современной ветеринарной науки: Сборник научных трудов по итогам Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 55-летию Прикаспийского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиал ФГБНУ «ФАНЦ РД», 22-23 сентября 2022 года: изд-во «АЛЕФ». Махачкала. - 2022. - С. 22-26.
4. Анисимова Е. А. Подбор оптимальных условий постановки ПЦР для идентификации возбудителя бруцеллеза собак / Е. А. Аниси-мова, Е. А. Додонова, К. А. Осянин [и др.] // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2023. - № 12(230). - С. 55-59.
5. Анисимова Е. А. Применение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл / Е. А. Анисимова, Д. А. Миргазов, Е. А. Додонова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2023. - № 4. - С. 42-49.
6. Осянин К. А. Специфичные нуклеотид-ные последовательности генома бруцелл для видовой ПЦР индикации / К. А. Осянин, Н. И. Хаммадов, Д. А. Миргазов [и др.] // Ветеринарный врач. - 2020. - № 2. - С. 39-44.
7. Khammadova A. V. Investigating nano particles in bioinformatic analysis of the Brucella genome for indication and differentation by qPCR / A. V. Khammadova, N. I. Khammadov, M. A. Kosarev [et al.] // International Journal of Engineering and Technology(UAE). - 2018. - Vol. 7. -No. 4.7. - P. 227-230.
Таблица 3 - Результаты проведения ПЦР-амплификации
Штамм Пороговый цикл (Ct)
HEX Cy5
B. melitensis 16М Флуоресценция отсутствует 16,56
B. ovis 90 25,1 Флуоресценция отсутствует
B. suis 1330 Флуоресценция отсутствует Флуоресценция отсутствует
