CC BY
28УДК: 577.2.086/087:579.62 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-2-39-44
СПЕЦИФИЧНЫЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОМА БРУЦЕЛЛ ДЛЯ ВИДОВОЙ ПЦР ИНДИКАЦИИ
Осянин К.А.- кандидат биологических наук, Хаммадов Н.И.- кандидат биологических наук, Миргазов Д.А.— младший научный сотрудник, КосаревМ.А. - кандидат биологических наук,
Софронова А.В.- кандидат биологических наук
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», (420075, г. Казань, Научный городок-2, е-mail: vnivi@mail.ru)
Цель исследованиянаправлена на поиск специфичных локусов генома бруцелл для индикации видов B.abortus, B.melitensis и рода Brucella методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Для определения специфичных локусов генома бруцелл в работе использовались ресурсы Национального центра биотехнологической информатизации (NCBI), с применением программных продуктов пакета VectorNTI 9.1.0 и утилиты BLAST. Для проведения амплификации использовалисьдезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК)B.abortus, B.melitensis, B.suis, выделенные при помощи набора ДНК-сорб-В. ПЦР проводили на амплификатореC1000 с оптическим блоком CFX96, BioRad. Были проанализированы нуклеотидные последовательности различных видов бруцелл. Определены специфичные участки генома, встречающиеся у всех представителей рода Brucella, а также маркерные локусы для видов B.abortus и B.melitensis. С учетом данных локусов был произведен дизайн и синтез праймеров и зондов для ПЦР. Для возможности проведения ПЦР в одной пробирке были использованы различные метки зондов для разных мишеней. Также был проведен ряд реакций с различными группами праймеров как в виде монотест-систем, так и в виде мультиплекса.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, бруцеллез, локусы, геном, мультиплекс.
Род Brucella объединяет несколько самостоятельных видов, вызывающих заболевание у различных видов животных, а также человека. В данный род входят следующие биологические виды: В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. neotomae, В. ovis, В. canis, В. ceti, В. pinnipedialis и В. microti [4]. Обнаружение в скотоводческом хозяйстве В. abortus, или овцеводческом хозяйстве и козьих фермах B. melitensis, на свинокомплексеВ. suis является причиной неблагополучия по бруцеллезу согласно санитарным правилам (СП 3.1.7.261310) [8].
Особую актуальность представляет индикация вида В. melitensis, представляющего опасность для человека. Наиболее высокий уровень заболеваемости по России, вызванный В. melitensis, отмечается в Северо-Кавказском и Южном федеральных округах [5].
Ограничения, накладываемые на продукцию животноводства при бруцеллёзе и подходы к его ликвидации, зависят от биологического вида возбудителя [1]. Быстрая и точная индикация вида возбудителя бруцеллеза возможна при использовании ПЦР, ос-
нову которой составляет биоинформационный анализ [2]. Мультипраймерный подход, с использованием различных флуоресцентных меток, при постановке ПЦР позволяет идентифицировать различные виды патогенов [3,7]. Цель исследования направлена на поиск специфичных локусов генома бруцелл для индикации видов B.abortus, B.melitensis и рода Bru-cella методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с использованием различных каналов амплификации для проведения анализа в одной пробирке.
Материал и методы. Сконструированные праймеры синтезированы в виде лио-филизата с концентрацией при разведении 100 пкМ. Для проведения полимеразной цепной реакции данный концентрат был разведен до значения 10 пкМ. Компоненты реакционной смеси (ddH2O, Буфер для ПЦР х10, MgCb 25мМ, dNTPs 2,5 мМ, Taqполимераза) применялись из набора R-412 (ЗАО Синтол). Для ПЦР амплификации использовались нуклеиновые кислоты, выделенные из бактериальных культур В. suis, В. abortus (штамм R1096), B. melitensis (штамм Revl). Выделение нуклеино-
вых кислот производили набором «ДНК-Сорб- Методика проведения ПЦР
В» согласно инструкции производителя. ПЦР амплификации применялась индивидуально
осуществляли на амплификаторе C1000 с оп- (специфично) для каждого вида.
тическим блоком CFX96 (BioRad, USA).
Таблица 1 - Последовательность синтезированных праймеров и зондов
Определяемый Кодировка Нуклеотидная последовательность 5' -> 3'
патоген праймера/зонда
род Brucella Bru F tcgaatggctcggttgcca
Bru R cgggtaaagcgtcgccagaa
Bru P (Fam)cgatcaagtcgggcgctctgga(BHQ 1)
В. abortus Bruabortus F gcaatcgtcgtattgccactataatcat
Bruabortus R gacggcgcagttctcgaacaa
Bruabortus P (ROX)ccgaaaggatcagcgtgccagaa(BHQ2)
B. melitensis Brumeli F tgcttggcacctcggaaacac
Brumeli R attcccgaaagccgatagagtttga
Brumeli P (R6G)tgaagcgctgcagacaaattttgacttcc(BHQ2)
Результаты исследований. В процессе исследований было проведено четыре различных эксперимента. Каждый из них осуществлялся согласно индивидуальному протоколу.
Все протоколы будут описаны ниже. Протокол №1. Проведение ПЦР с использованием монотест системы для индикации рода Brucella.
Таблица 2 - Состав реакционной смеси и протокол амплификации тест-системы для индикации рода Brucella
Реагент Кол-во, мкл Температура, Со Время
Состав реакционной смеси Амплификация
ddH2O 3,5 95 3 мин
Буфер для ПЦР х10 1,5 95 10 сек 40 циклов
MgCh25MM 1,5 60 30 сек
dNTPs 2,5 мМ 1,5 72 10 сек
Bru F 0,5
BruR 0,5
Bru P 0,5
Taq полимераза 0,5
ДНК 5
Рисунок 1 - Результат амплификации ДНК с использованием монотест-системы для определения рода Brucella. График №1 - ДНК Brucella abortus штамм R1096, график №2 - ДНК Brucella melitensis штамм Revl, график №3 - ДНК Brucella suis.
Как видно из рисунка 1, все пробы ДНК показали положительный результат ПЦР. Накопление флюоресценции доходило до значений 1400 у.е. Пороговые циклы графиков находились в диапазоне от 14 до 19. Таким образом, данная группа праймеров и зонда под-
ходит для индикации рода Brucella в качестве составляющей мультиплексной тест-системы.
Протокол №.2 Проведения ПЦР с использованием моно-тест системы для индикации вида Brucella abortus.
Таблица 3 - Состав реакционной смеси и протокол амплификации тест-системы для индикации вида B.abortus_
Реагент Кол-во, мкл Температура, Со Время
Состав реакционной смеси Амплификация
ddH2O 3,5 95 3 мин
Буфер для ПЦР х10 1,5 95 10 сек 40 циклов
Mga225мМ 1,5 60 30 сек
dNTPs 2,5 мМ 1,5 72 10 сек
Bruabortus F 0,5
BruabortusR 0,5
Bruabortus P 0,5
Taq полимераза 0,5
ДНК 5
Рисунок 2 - Результат амплификации ДНК с использованием моно тест-системы для определения вида Brucella abortus. График №1 - ДНК Brucellaabortus штамм R1096, график №2 -ДНК Brucella melitensis штамм Rev1, график №3 - ДНК Brucella suis.
На рисунке 2 можно отметить накопление флюоресценции в пробе, содержащей ДНК Brucella abortus, доходящее до значений 500 у.е. Пороговый цикл данного графика имел значение 22.
В свою очередь в пробах, содержащих ДНК B.suis и B.melitensis накопление
флюоресценции вовсе отсутствовало, что говорит о специфичности данной группы праймеров и зонда по отношению к близким видам микроорганизмов внутри рода Brucella.
Протокол №.3 Проведения ПЦР с использованием моно-тест системы для индикации вида Brucella melitensis.
Таблица 4 - Состав реакционной смеси и протокол амплификации тест-системы для индикации вида Brucella melitensis_
Реагент Кол-во, мкл Температура, Со Время
Состав реакционной смеси Амплификация
ddH2O 3,5 95 3 мин
Буфер для ПЦР х10 1,5 95 10 сек 40 циклов
Mga225мМ 1,5 60 30 сек
dNTPs 2,5 мМ 1,5 72 10 сек
Brumeli F 0,5
Brumeli R 0,5
Brumeli P 0,5
Taq полимераза 0,5
ДНК 5
Рисунок 3 - Результат амплификации ДНК с использованием моно тест-системы для определения вида Brucella melitensis. График №1 - ДНК Brucella abortus штамм R1096, график №2 -ДНК Brucella melitensis штамм Revl, график №3 - ДНК Brucella suis.
Как видно на рисунке 3, накопление флюоресценции происходило исключительно в пробе, содержащей ДНК B.melitensis. Значения флюоресценции были выше 700 у.е., пороговый цикл достигал значения 24. Таким обра-
зом, данный набор праймеров и зонда индицирует исключительно вид B.melitensis. Протокол №.4 Проведения ПЦР с использованием мультиплексной тест- системы для индикации видов B.abortus, B.melitensis и рода Brucella.
Таблица 5 - Состав реакционной смеси и протокол амплификации мультиплексной тест-системы для определения видов B.melitensis, B.abortus и рода Brucella.
Реагент Кол-во, мкл Температура, Со Время
Состав реакционной смеси Амплификация
ddH2O 0,5 95 3 мин
Буфер для ПЦР х10 1,5 95 10 сек 40 циклов
MgCh25MM 1,5 60 30 сек
dNTPs 2,5 мМ 1,5 72 10 сек
Brumeli F 0,5
Brumeli R 0,5
Brumeli P 0,5
Bruabortus F 0,5
Bruabortus R 0,5
Bruabortus P 0,5
Bru F 0,5
BruR 0,5
Bru P 0,5
Taq полимераза 0,5
ДНК 5
Amplification
О 10 20 30 40
Cycles
Рисунок 4 - Результат амплификации ДНК с использованием мультиплексной тест-системы для определения видов B.melitensis, B.abortus и рода Brucella. График №1 - ДНК Brucella abortus штамм R1096, график №2 - ДНК Brucella melitensis штамм Revl, графики №3 - ДНК Brucella suis.
В заключении было произведено соединение моно тест-систем в мультиплексную тест-систему для индикации видов B.abortus, B.melitensis и рода Brucella.
На рисунке 4 видно накопление флюоресценции происходило по специфичным каналам амплификатора, согласно выбранным меткам. В пробе, содержащей ДНК B. аbortus накопление флюоресценции происходило по специфичному каналу ROX и по каналу, идентифицирующему род Brucella. В пробе, содержащей ДНК B.melitensis накопление сигнала происходило по специфичному каналу R6G и по каналу, индицирующему род Brucella. В свою очередь в пробе, содержащей ДНК B.suis накопление флюоресценции отме-
чалось только по каналу FAM, идентифицирующему род Brucella.
Заключение. На основании проведенной амплификации можно сделать вывод о возможности построения мультиплексной ПЦР тест-системы для диагностики видов B.melitensis, B.abortus и рода Brucella на основе разработанных моноплексных систем. Реакция может проводиться в одной пробирке, используя разные каналы амплификатора. Полученная тест-система снизит затраты на проведение диагностических исследований и ускорит процесс определения вида возбудителя, что позволит в короткие сроки принять необходимые мероприятия по ликвидации бруцеллеза в отдельных хозяйствах.
Литература
1. Aгольцев, ВА Эпидемиологические и эпизоотологические особенности бруцеллеза в Саратовской и в Западно-Казахстанской областях / ВА. Aгольцев, С.Ю.Веселовский, A.A.Частов, О.М.Попова // Научная жизнь. - 2017.- № 7.-С. 92-100.
2. Aдиева, A.A. Использование биоинформационных методов при конструировании праймеров конститутивного гена, кодирующего белок тубулин для проведения ОТ-ПЦР / A.A. Aдиева, Г.Р. Израилова, РА. Халилов, М.Г. Меджидова, ЮА. Умарова // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - № 6. - С. 526-535.
3. Желудков, М.М. Резервуары бруцеллезной инфекции в природе / М.М. Желудков, М.М. Церельсон // Зоологический журнал. - 2010. - № 1(89). - С. 53-60.
4. Лямкин, Г.И. Обзор эпизоотической и эпидемической ситуации по бруцеллезу в Российской Федерации в 2013 г. и прогноз на 2014 г. / Г.И. Лямкин, С.И. Головнева, A.A. Худолеев, Е.Н. Чеботарева, Л.И. Шакирова, AÄ Куличенко // Проблемы особо опасных инфекций. - 2014. - №2. - С. 29-32.
5. Ндайишимийе, Э.В. Биоинформационный анализ олигонуклеотидов для молекулярно-генетической индикации возбудителей аспергиллеза и аскосфероза пчел / Н.И. Хаммадов, КА. Осянин, Т.Х. Фаизов, ЭА. Шуралев, М.Н. Мукминов // Ветеринарный врач. -2015.-№ 2. - С. 3-9.
6. Mustafa, A.S. Speciesidentification and molecular typing of human Brucella isolates from Kuwait/N. Habibi, A.Osman, F. Shaheed, M.W.Khan // PLoS One journal.pone.-2017.-0182111.-№12(8): e0182111. DOI: 10.1371.
7.Shevtsova, E. Epidemiology of brucellosis and genetic diversity of Brucella abortus in Kazakhstan / E. Shevtsova, A. Shevtsov , K. Mukanov, M. Filipenko, D. Kamalova , I. Sytnik, M. Syzdykov, A. Kuznetsov, A. Akhmetova, M. Zharova, T. Karibaev, P. Tarlykov, E.Ramanculov // PLoS One journal.pone. - 2016. -0167496. - №11 (12): e0167496.DOI: 10.1371.
SPECIFIC NUCLEOTIDE SEQUENCES OF THE BRUCELLA GENOME FOR SPECIES-SPECIFIC
PCR INDICATION
Osyanin K.A. - Candidate of Biological Sciences, Khammadov N.I. - Candidate of Biological Sciences, Mirgazov D.A.- Junior Researcher, Kosarev M.A. - Candidate of Biological Sciences, Sofronova A.V. - Candidate of Biological Sciences
FSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety», (420075, Kazan, Nauchnyi gorodok-2, e-mail:vnivi@mail.ru)
The aim of the study is to search for specific loci of the brucella genome to indicate species of B. abortus, B. melitensis and the genus Brucella by real-time polymerase chain reaction. To determine the specific loci of the brucella genome, we used the resources of the National Center for Biotechnological Informatization (NCBI), using software products of the Vector NTI 9.1.0 package and the BLAST utility. For amplification, the DNA used was B. abortus, B. melitensis, B.suis, isolated using a DNA-sorb-B kit. The polymerase chain reaction was carried out on a C1000 thermocycler with a CFX96 optical unit, BioRad. The nucleotide sequences of various types of brucella were analyzed. Specific genome regions found in all representatives of the genus Brucella, as well as marker loci for the species B. abortus and B. melitensis, were determined. Based on these loci, design and synthesis of primers and probes for PCR was performed. To allow for PCR in a single tube, different probe labels were used for different targets. A series of reactions was also carried out with different groups ofprimers both in the form of mono test systems and in the form of a multiplex.
Keywords: polymerase chain reaction, brucellosis, loci, genome, multiplex.
References
1. Agol'cev, V.A. Epidemiological and epizootological features of brucellosis in the Saratov and West Kazakhstan regions/ V.A.Adofcev, S.YU.Veselovskij, A.A. CHastov, O.M. Popova //Scientific life.- 2017.-№ 7.- P. 92-100.
2. Adieva, A.A. The use of bioinformation methods in the design of primers for the constitutive gene encoding the tubulin protein for OT-PCR / A.A. Adieva,G.R.Izrailova R.A. Halilov, M.G. Medzhidova, YU.A.Umarova // Modern problems of science and education.- 2016.- № 6.-P.526-535.
3. Zheludkov, M.M. Rezervoirsofbrucellosisinfectionin nature/M.M.Zheludkov,M.M. Cerel'son // Zoologicaljournal. - 2010.-№ 1(89).-P. 53-60.
4. Lyamkin, G.I. Overview of the epizootological and epidemic situation of brucellosis in the Russian Federation in 2013 and the forecast for 2014g. / G.I. Lyamkin, S.I. Golovneva, A.A. Hudoleev, E.N. CHebotareva, L.I. SHakirova, A.N. Kulichenko // Especially dangerous infection.- 2014.- № 2.- P. 29-32.
5. Ndajishimije, E.V. Bioinformational analysis of oligonucleotides for molecular genetic indication of pathogens of aspergillosisandaskosferosisof bees / E.V. Ndajishimije, N.I. Hammadov, K.A. Osyanin, T.H. Faizov, E.A. SHuralev, M.N. Mukminov //The Veterinarian. - 2015.-№ 2.-P.3-9.
6. Mustafa, A.S. Species identification and molecular typing of humanBrucella isolates from Kuwait / A.S.Mustafa, N.Habibi, A.Osman, F.Shaheed, M.W.Khan //PLoS Onejournal.pone.-2017.-0182111.-№12(8): e0182111. DOI: 10.1371.
7. Shevtsova, E. EpidemiologyofbrucellosisandgeneticdiversityofBrucellaabortusinKazakhstan / E.Shevtsova, A. Shevtsov, K. Mukanov, M. Filipenko, D. Kamalova, I. Sytnik, M. Syzdykov, A. Kuznetsov, A. Akhmetova, M. Zharova, T. Karibaev, P. Tarlykov, E. Ramanculov //PLoSOnejournal.pone.-2016.-0167496.-№11(12): e0167496.DOI: 10.1371.
