CC BY
0Ветеринарный врач. 2024. № 3. С. 34 - 40 The Veterinarian. 2024; (3): 34 - 40
Научная статья УДК 579.62
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_3_34
РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-РВ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА
Елизавета Алексеевна Громова, кандидат биологических наук, elizaveta-real@mail.ru Динис Анатолиевич Миргазов, dinis.mirgazov.96@mail.ru Екатерина Алексеевна Додонова, dodonovaekaterina82@gmail.com Инна Анатольевна Елизарова, eliinna@yandex.ru
Мария Евгеньевна Горбунова, кандидат биологических наук, maria.metax@bk.ru Константин Анатольевич Осянин, кандидат биологических наук, kostja-2003@yandex.ru
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Казань, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Елизавета Алексеевна Громова.
Аннотация. Бруцеллез является одним из самых опасных зоонозных заболеваний, поэтому требует своевременной точной и быстрой диагностики. Цель настоящей работы - разработка тестсистемы, предназначенной для индикации и дифференциации видов возбудителей бруцеллеза методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. На основе подобранных ранее ДНК-маркеров, одни из которых имеются только у бактерий рода Brucella, другие лишь у представителей вида B. canis, третьи у В. abortus, сконструированы праймеры и зонды для гидролиза, позволяющие выявлять и проводить дифференциацию видов возбудителя бруцеллеза. В ходе исследований был подобран оптимальный состав реакционной смеси и определены единые условия амплификации для проведения ПЦР в условиях одной реакции. При постановке мультиплексной ПЦР c ДНК штаммов различных видов установлено, что олигонуклеотидные затравки специфически амплифицируют ДНК целевых видов бруцелл. Исключением является разработанная нами комбинация праймеров CanF, CanR и зонда CanZ для амплификации B. canis, которая позволяет выявлять также бактерии вида B. suis. На основании проведенных исследований разработана мультиплексная тест-система, предназначенная для выявления и идентификации видов B. canis/B. suis и B. abortus методом ПЦР-РВ. Определены компоненты тест-системы, проведена оценка эффективности и стабильности ее компонентов. Установлено, что взаимное влияние нескольких реакций, объединенных в единой тест-системе, не приводит к снижению результативности ПЦР-РВ относительно моноплексных реакций. Тест-система сохраняет свою стабильность в течении всего срока годности (один год), а также устойчива к многократному замораживанию и оттаиванию.
Ключевые слова: бруцеллез, ПЦР-РВ, зооноз, диагностика, идентификация,
дифференциация, Brucella canis, Brucella abortus, Brucella suis
Для цитирования: Громова Е. А., Миргазов Д. А., Додонова Е. А., Елизарова И. А., Горбунова М. Е., Осянин К. А. Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза// Ветеринарный врач. 2024. № 3. С. 34 - 40. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_3_34
DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX RT-PCR TEST SYSTEM FOR DETECTING THE
CAUSATIVE AGENT OF BRUCELLOSIS
Elizaveta A Gromova, сandidate of biological sciences, elizaveta-real@mail.ru Ekaterina A Dodonova, dodonovaekaterina82@gmail.com Denis A Mirkhazov, dinis. mirgazov.96@mail.ru Inna A Elizarova, eliinna@yandex.ru
Maria E. Gorbunova, candidate of biological sciences, maria.metax@bk.ru Konstantin A. Osyanin, сandidate of biological sciences, kostja-2003@yandex.ru
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russian Federation Corresponding author: Elizaveta A Gromova.
Abstract. Brucellosis is one of the most dangerous zoonotic diseases, so it is requires timely, accurate and rapid diagnosis. The purpose of this work is development of the test system for indication and differentiation of types of brucellosis pathogens by the PCR method, taking into account the results in real time. Based on previously selected DNA markers, some of which are found only in bacteria of Brucella spp., others only in representatives of the species B. canis, and others in B. abortus, primers and hydrolysis probes were designed, allowing the identification and differentiation of species of the causative agent of brucellosis. During the research, the optimal composition of the reaction mixture was selected and common amplification conditions were determined for carrying out PCR under one reaction conditions. When performing of multiplex PCR with DNA from various species strains, it was found that oligonucleotide primers specifically amplify the DNA of the target Brucella species. An exception is the developed combination of primers CanF, CanR and CanZ probe for the amplification of B. canis, which also makes it possible to detect bacteria of the B. suis species. Based on the conducted research, the multiplex test system for the detection and identification of
B. canis/B. suis and B. abortus by RT-PCR was developed. The components of the test system were determined, and the effectiveness and stability of its components were assessed. It has been established that the mutual influence of several reactions combined in the single test system does not lead to a decrease in the effectiveness of RT-PCR relative to monoplex reactions. The test-system remains stable throughout the entire shelf life (one year), and is also resistant to repeated freezing and thawing.
Keywords: brucellosis, RT-PCR, zoonosis, diagnostics, identification, differentiation, Brucella canis, Brucella abortus, Brucella suis.
Введение. Бруцеллез - особо опасная зоонозная инфекция, восприимчивыми к которой является многие млекопитающие, в том числе и человек. Данное заболевание часто протекает бессимптомно, имеет хроническое рецидивирующее течение и приводит к высокой инвалидизации носителей инфекции [1]. Возбудителем бруцеллеза являются бактерии рода Brucella, из которых для человека наиболее патогенными считаются виды B. melitensis (основной хозяин - мелкий рогатый скот), B. suis (1,2,3 биовары - свиньи), B. abortus (крупный рогатый скот) и B. canis (собаки) [2]. Заражение людей бруцеллезом чаще всего связано с профессиональной деятельностью и происходит при непосредственном контакте с инфицированными животными. Инфицирование также может происходить при употреблении непастеризованных продуктов питания, полученных из зараженного сырья, либо при нарушении технологии пастеризации при их производстве [2, 3].
В России эпидемиологическая ситуация по бруцеллезу остается достаточно напряженной, в частности наиболее неблагополучными районами считаются Северо-Кавказский, Южный и Сибирский федеральный округа. Перманентная циркуляция возбудителей бруцеллеза на данных территория чаще всего ассоциирована с интенсивно развитым животноводством и региональными особенностями его ведения [2, 5]. В настоящее время для диагностики бруцеллеза наиболее часто используются стандартные микробиологические и серологические методические подходы. В основе микробиологического подхода лежит непосредственное выделение бактерий Brucella spp. из биологических жидкостей и патологического материала зараженных особей, что сопряжено с высокими рисками для здоровья лабораторного персонала, а также является достаточно трудоемким и затратным по времени процессом. Серологические тесты являются более эффективными, но могут иметь свои ограничения, связанные с низкой спецификой ввиду возможных перекрестных реакций или недостаточного количества антител против инфекционного агента в образцах, полученных из районов с низкой или субклинической распространенностью бруцеллеза [6].
Наиболее оптимальным подходом к диагностике инфекционных заболеваний является использование молекулярно-генетических методов, в частности основанных на ПЦР. Данный метод является достаточно чувствительным и специфичным, что позволяет проводить быструю и точную идентификацию представителей рода Brucella, необходимую для обеспечения эффективной профилактики и борьбы с бруцеллезом.
Целью исследования являлось разработать тест-систему, предназначенную для индикации и дифференциации видов возбудителей бруцеллеза методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени.
Материалы и методы. Объектами исследования являлись образцы ДНК бруцелл B. canis RM 6/66, B. suis (1330,183-1, У-1), B. melitensis (1565, 1190) и B. abortus (19, R-1096) [4].
ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили на ДНК-амплификаторе С1000 с оптическим блоком CFX96 («Bio-Rad», Сингапур) с применением готовой реакционной смеси 5х qPCRmix-HS («Евроген», Россия).
Дизайн праймеров и зондов для гидролиза осуществляли с помощью программ Vector NTI 9.1 и баз данных ресурсов NCBI (https://www.ncbi.gov). Синтетические олигонуклеотиды были синтезированы в ЗАО «Синтол» (Россия).
Стабильность тест-системы оценивали с помощью коэффициента вариации значений порогового цикла (Ct), полученных в результате ПЦР-РВ амплификации контрольных и анализируемых образцов разрабатываемой тест-системы. Коэффициент вариации значений Q (V, %) вычисляли по формуле согласно ГОСТ Р 70150-2022. Тест-систему считали устойчивой к длительному хранению, а также к многократному замораживанию и оттаиванию, если значение коэффициента вариации не превышало 10%.
Результаты исследований и их обсуждение. В качестве основы для конструирования ПЦР-РВ тест системы использовали подобранные нами ранее нуклеотидные последовательности из базы данных GenBank: «BSCP31» (идентификация бруцелл на родовом уровне), «BCAN_B0548» (идентификация представителей вида B. canis), «BAW-20082» (идентификация представителей вида B. abortus) [7, 8]. В пределах данных локусов разработали олигонуклеотидные праймеры и зонды для гидролиза, пригодные для ПЦР-индикации возбудителя бруцеллеза в режиме реального времени (таблица 1).
Таблица 1 - Характеристика разработанных олигонуклеотидов
Локус-мишень Обозначение олигонуклеотидов Канал детекции Тип зонда и гасителя флуоресценции
«BSCP31» BruF (прямой праймер) BrnR (обратный праймер) BruZ (зонд для гидролиза) HEX R6G-BHQ1
«BCAN_B0548» CanF (прямой праймер) CanR (обратный праймер) CanZ (зонд для гидролиза) CY5 Cy5- BHQ3
«BAW-20082» AbrtF (прямой праймер) AbrtR (обратный праймер) AbrtZ (зонд для гидролиза) ROX ROX-BHQ2
На первом этапе работы для выбора программы амплификации и соотношения концентрации праймеров и зонда в каждой реакционной смеси были проведены моноплексные реакции для каждого канала детекции отдельно. Подбор условий ПЦР проводили на штаммах B. canis RM 6/66 и B. abortus R-1096. На основании полученных результатов была составлена программа амплификации: первичная денатурация ДНК при 95 °С в течение 5 мин, 5 циклов: денатурация 95 °С - 15 с, отжиг олигонуклеотидов 61 °С - 35 с, далее 40 циклов: денатурация 94 °С - 15 с, отжиг олигонуклеотидов 61 °С - 35 с (учет флуоресцентного сигнала по каналам HEX/CY5/ROX). Также был определен оптимальный состав реакционной смеси: 3 мкл 5х qPCRmix-HS («Синтол», Россия), 0,3 пкМ прямого и обратного праймера, 0,1 пкМ зонда, 5 мкл ДНК-матрицы, ddH2O (до 15 мкл).
Анализ специфичности разработанных праймеров и зондов проводился на образцах ДНК бруцелл B. canis RM 6/66, B. suis (1330, 183-1, У-1), B. melitensis (1565, 1190) и B. abortus (19, R-1096). Результаты оценки специфичности олигонуклеотидов представлены в таблице 2.
При проведении ПЦР-РВ с образцами ДНК штаммов B. abortus 19 и R-1096 наблюдали ожидаемый рост сигнала флуоресценции по двум каналам - HEX (родовая идентификация) и ROX (видовая идентификация B. abortus). Стабильное нарастание уровня флуоресценции по каналам HEX и CY5 (видовая идентификация B. canis) регистрировалось не только у штаммов B. canis RM 6/66, но и у B. suis (1330, 183-1, У-1). Из данных литературы известно, что геномы видов В. suis и В. canis обладают высоким уровнем гомологии на уровне нуклеотидных последовательностей, что не позволяет в полной мере дифференцировать представителей данных видов между собой
молекулярно-генетическими методами [9]. Таким образом, разработанная нами комбинация праймеров CanF, CanR и зонда для гидролиза CanZ могут быть использованы для единовременного выявления видов B. suis и
B. canis в одной пробирке. При проведении амплификации с ДНК штаммов B. melitensis 1565 и 1190 значения порогового цикла Ct были получены только по каналу HEX (родовая идентификация). Что касается отрицательного контроля (ddH2O), флуоресценция не регистрировалась ни по одному из использованных каналов.
Таблица 2 - Результаты проведения ПЦР-амплификации
Штамм Пороговый цикл (Q)
HEX CY5 ROX
B. canis RM 6/66 16,35 17,31 N/A
B. suis 1330 (bv.1) 15,31 13,20 N/A
B. suis 183-1(bv.2) 14,74 13,41 N/A
B. suis У-1 (bv.3) 12,56 13,5 N/A
B. abortus 19 13,51 N/A 14,12
B. abortus R-1096 13,76 N/A 13,89
B. melitensis 1565 15,41 N/A N/A
B. melitensis 1190 15,69 N/A N/A
Отрицательный контрольный образец, ОКО (ddH2O) N/A N/A N/A
Примечания
1 - N/A - рост сигнала флуоресценции отсутствует
2 - Значения порогового цикла (Ct), при которых результат считается достоверным: < 30 для CY5; < 32 для ROX и HEX.
На основе разработанных праймеров сконструирована мультиплексная ПЦР-РВ тест-система «БРУЦЕЛЛА С/А», предназначенная для индикации и дифференциации видов возбудителей бруцеллеза (B. canis/suis и B. abortus) в режиме реального времени. В тест-системе объединены три ПЦР-РВ реакции, первая из которых позволяет детектировать возбудителя бруцеллеза на родовом уровне по каналу HEX, вторая - идентифицировать B. canis/suis по каналу CY5, третья - B. abortus по каналу ROX. В состав тест-системы входят: ПЦР-компонент 1 (5X qPCRmix-HS), ПЦР-компонент 2 (смесь трех комбинаций праймеров и зондов для гидролиза), положительный контрольный образец (смесь ДНК Brucella spp.), отрицательный контрольный образец (ddH2O), ddH2O.
Важным требованием, предъявляемым к любой мультиплексной ПЦР-РВ тест-системе, является ее эффективность. Взаимное влияние нескольких реакций, объединенных в единой тестсистеме, не должно приводить к значительному снижению результативности ПЦР-РВ, относительно моноплексных реакций [10]. Для оценки эффективности разработанной мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы «БРУЦЕЛЛА С/А» использовали образцы ДНК штаммов B. canis RM/66, B. abortus 19, B. suis 1330 и B. melitensis 1190, полученные путем серии десятикратных разведений ДНК данных бактерий из начальной концентрации 30 нг/мкл. Результаты проведения ПЦР-РВ с ДНК бруцелл в моно- и мультиплексном форматах представлены в таблице 3.
Сравнение результатов моно-и мультиплексной ПЦР показало отсутствие значимых различий между значениями порогового цикла (Ct) при проведении амплификации с ДНК одних и тех же образцов ДНК бруцелл. Средняя разница между значениями Ct составила менее одного цикла. Таким образом, результативность каждой из трех реакций, проводимых в формате мультиплесксной тестсистемы «БРУЦЕЛЛА С/А», полностью совпадала с аналогичными характеристиками для моноплексных ПЦР.
Также провели оценку стабильности компонентов, входящих в состав разрабатываемой тестсистемы при длительном хранении (в течении срока годности - 1 год) и при многократном замораживании/оттаивании. Оценку стабильности тест-системы в процессе хранения проводили методом ускоренного старения ее компонентов в течение семи дней при плюс 37 °С, что
соответствует результатам, получаемым при хранении набора в течение одного года при температуре от минус 18 °С до минус
20 °С [9]. По истечении семи дней проводили ПЦР-РВ положительного контроля в трех повторах с использованием тест-системы, хранившейся в условиях ускоренного хранения, а также с контрольными аликвотами аналогичных компонентов тест-системы, хранившихся при минус 18 °С. Для каждой реакции, входящей в состав мультиплексной ПЦР-РВ системы, на основании полученных значений Ct рассчитали коэффициент вариации данных значений. Результаты проведенного исследования стабильности компонентов тест-системы методом ускоренного старения представлены в таблице 4.
Таблица 3 - Результаты проведения ПЦР-амплификации при оценке эффективности разработанной мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы
Штамм Разведение Bru, Ct Can, Ct Abrt, Ct
3 « 1 Pi « о S Тест-система «БРУЦЕЛЛА С/А» 3 « 1 Pi « о s Тест-система «БРУЦЕЛЛА С/А» 3 « 1 Pi « о s Тест-система «БРУЦЕЛЛА С/А»
B. canis RM/66 100 16,13 16,02 16,34 16,59 N/A N/A
10-1 23,64 23,4 20,4 20,63 N/A N/A
10-2 26,25 26,58 27,9 28,5 N/A N/A
B. abortus 19 100 13,48 13,91 N/A N/A 13,86 14,32
10-1 20,13 20,45 N/A N/A 22,63 22,55
10-2 23,53 23,76 N/A N/A 25,89 26,01
B. suis 1330 100 11,18 11,56 15,77 15,9 N/A N/A
10-1 18,15 18,8 19,44 19,62 N/A N/A
10-2 21,32 21,4 25,03 25,44 N/A N/A
B. melitensis 1190 100 15,61 15,97 N/A N/A N/A N/A
10-1 21,38 21,51 N/A N/A N/A N/A
10-2 26,39 26,48 N/A N/A N/A N/A
Примечания
1 - N/A - рост сигнала флуоресценции отсутствует.
2 - Ct - значение порогового цикла
Таблица 4 - Оценка стабильности компонентов тест-системы в процессе ускоренного хранения
Канал флуоресценции Показатели, Ct Коэффициент вариации Ct, V, %
Контрольная точка Ускоренное хранение
HEX 15,2±0,21 15,8±0,36 1,93 %
CY5 12±0,3 14,58±0,32 8,7 %
ROX 12,3±0,38 12,69±0,29 2,1 %
Примечания
1 - Тест-систему считали стабильной, если значение коэффициента вариации не превышало
10 %
2 - ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.
Установили, что значение коэффициента вариации для ПКО не превышает 10%, следовательно, тест-система является устойчивой к процессу длительного хранения. Устойчивость компонентов разрабатываемой ПЦР-РВ тест-системы к многократному замораживанию и оттаиванию оценивали по результатам амплификации, полученным для положительного контроля после 51 цикла их замораживания (60 мин) и оттаивания (30 мин при комнатной температуре). ПЦР-РВ проводили в
первый день эксперимента (нулевая точка), а также после завершения 20, 40 и 51 цикла замораживания/оттаивания компонентов тест-системы в трех повторах. На основании полученных значений Ct для каждой реакции, входящей в состав мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы, рассчитали коэффициент вариации значений Ct. Результаты проведенного исследования стабильности тест-системы при многократном замораживании и оттаивании представлены в таблице
5.
Установили, что значение коэффициента вариации для ПКО не превышает 10%, следовательно, тест-система является устойчивой к многократному замораживанию и оттаиванию.
Результаты проведенных исследований легли в основу проекта технических условий и инструкции по применению тест-системы «БРУЦЕЛЛА С/А», предназначенной для индикации и дифференциации видов возбудителей бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Таблица 5 - Оценка стабильности компонентов тест-системы при их многократном замораживании и оттаивании
Канал флуоресценции Показатели, Ct Коэффициент вариации, V, %
Нулевая точка Цикл замораживания/оттаивания
20 30 40 51
HEX 15,2±0,21 15,4±0,26 15,62±0,34 15,59±0,33 15,8±0,28 1,27 %
CY5 12±0,3 11,92±0,32 14±0,26 14,24±0,37 13,76±0,42 8,1 %
ROX 12,3±0,38 11,89±0,4 12,1±0,31 12,14±0,36 12,38±0,19 2,1 %
Примечания
1 - Тест-систему считали стабильной, если значение коэффициента вариации не превышало
10 %
2 - ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.
Заключение. На основании проведенных исследований разработана мультиплексная тестсистема, предназначенная для выявления и идентификации видов B. canis/B. suis и B. abortus методом ПЦР-РВ. Определены компоненты тест-системы, проведена оценка ее стабильности, разработан проект технических условий и инструкции по ее применению. Установлено, что тест-система сохраняет свою стабильность в течении всего срока годности и устойчива к процессу многократного замораживания и оттаивания. Использование данной тест-системы в рутинной практике ветеринарных лабораторий значительно ускорит процесс видовой идентификации возбудителя бруцеллеза, что позволит в короткие сроки принять необходимые меры по ликвидации данного заболевания в отдельных хозяйствах.
Список источников
1. Бруцеллез: его распространение и профилактика / Р. Ю. Насибуллин [и др.] // Ветеринарный врач. 2021. №1. C. 38-43.
2. Анализ заболеваемости бруцеллезом и молекулярно-генетическая характеристика популяции бруцелл на территории Российской Федерации / Д.Г. Пономаренко [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2023. № 2. С. 61-74.
3. Салмаков К. М., Косарев М. А. Совершенствование системы специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота с применением вакцины из штамма B. abortus 82 и препарата из штамма B. abortus R-1096 // Ветеринария. 2023. № 8. С. 9-13.
4. Применение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл / Е. А. Анисимова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2023. № 4. С. 42-49.
5. Анализ заболеваемости людей бруцеллёзом и молекулярно-биологическая характеристика изолятов Brucella melitensis на длительно неблагополучных по бруцеллёзу территориях юга европейской части России / А.А. Хачатурова [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022. 99(1). С. 63-74.
6. Polymerase chain reaction-based assays for the diagnosis of human brucellosis / Y. Wang [et al.] // Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2014. No 13. P. 13-31.
7. Специфичные нуклеотидные последовательности генома бруцелл для видовой ПЦР индикации / К. А. Осянин [и др.] // Ветеринарный врач. 2020. № 2. С. 39-44.
8. Подбор оптимальных условий постановки ПЦР для идентификации возбудителя бруцеллеза собак / Е.А. Анисимова [и др.] // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2023. № 12(230). С. 55-59.
9. Кулаков Ю.К., Цирельсон Л.Е., Желудков М.М. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделенных от собак и оленей в различных регионах России. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. № 4. С. 28-33.
10. Разработка и валидация набора для мультиплексного ПЦР-РВ анализа регуляторных элементов (промотора SsuAra и терминатора Е9) для обнаружения генетически-модифицированных (ГМ) линий рапса, сои, картофеля и других растений / Ю. С. Аляпкина [и др.] // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2018. № 3. С. 5-16.
References
1. Brucellosis: its spread and prevention / R. Yu. Nasibullin [et al.] // The Veterinarian. 2021. No. 1. P.3843.
2. Analysis of the incidence of brucellosis and molecular genetic characteristics of the Brucella population on the territory of the Russian Federation / D.G. Ponomarenko [et al.] Problemy Osobo Opasnykh Infektsii. 2023. No. 2. P. 61-74.
3. Salmakov K. M., Kosarev M. A. Improving the system of specific prevention of brucellosis in cattle using a vaccine from the B. abortus 82 strain and a drug from the B. abortus R-1096 strain // Veterinary Medicine. 2023. No. 8. P. 9-13.
4. Use of HRM-analysis of the melting curves obtained after amplification of VNTR-loci for identification and differentiation of Brucella strains/ E. A. Anisimova [et al.] // Problemy Osobo Opasnykh Infektsii. 2023. No. 4. P. 42-49.
5. Analysis of human incidence of brucellosis and molecular biological characteristics of Brucella melitensis isolates in long-term brucellosis-prone areas in the south of the European part of Russia / A.A. Khachaturova [et al.] // Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2022. 99(1). P. 6374.
6. Polymerase chain reaction-based assays for the diagnosis of human brucellosis / Y. Wang [et al.] // Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2014. No. 13. P. 13-31.
7. Specific nucleotide sequences of the Brucella genome for species-specific PCR indication / K. A. Osyanin [et al.] // The Veterinarian. 2020. No. 2. P. 39-44.
8. Selection of optimal conditions for performing PCR to identify the causative agent of brucellosis in dogs / E.A. Anisimova [et al.] // Bulletin of the Altai State Agrarian University. 2023. No. 12(230). P. 55-59.
9. Kulakov Yu.K., Tsirelson L.E., Zheludkov M.M. Molecular genetic characteristics of Brucella isolates isolated from dogs and deer in various regions of Russia. Molecular genetics, microbiology and virology. 2012. No. 4. P. 28-33.
10. Development and validation of a kit for multiplex RT-PCR analysis of regulatory elements (SsuAra promoter and E9 terminator) for the detection of genetically modified (GM) lines of rapeseed, soybeans, potatoes and other plants / Yu. S. Alyapkina [et al.] / / News of the Timiryazev Agricultural Academy. 2018. No. 3. P. 5-16.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 21.02.2024;
© Громова Е. А., Миргазов Д. А., Додонова Е. А., Елизарова И. А., Горбунова М. Е., Осянин К. А. 2024
