CC BY
5чувствительных объектов (культуры клеток, куриные эмбрионы, восприимчивые животные) или ЦПД50 (CD50) - 50% цито-патогенная доза - минимальное количество микробных клеток или вируссодержащего материала, вызывающее цитопатогенное действие в половине взятых в опыт пробирок с культурой ткани.
Мы в своих исследованиях учитывали, однако, особенности клинического проявления анаплазмоза и, главное, процентное соотношение между числом заболевших и павших животных, т.е. процент летальности.
По нашим, и ряду других авторов, данным, летальность при анаплазмозе рогатого скота находится в пределах 10-30% и более, но она растянута во времени и часто очень длительном. Поэтому ориентиром для нас при выведении минимальной заражающей дозы возбудителя служило абортивное течение болезни, т.е. кратковременное проявление болезни в легкой форме без проявления некоторых (нередко основных симптомов): при анаплазмозе - отсутствие глубокой анемии - основного и ведущего признака болезни.
Минимальная заражающая доза возбудителя, при которой мы отмечали заболевание животных с проявлением полного симптомокомплекса, присущего анаплазмозу, - выраженной паразитемией, глубокой анемией, с последующим исхуданием заболевшего животного составила:
а) для овец - 2,5х104 А. оу1Б/животное,
б) для крс - 1,5х105 А. ша^та1е/животное.
Последующее двукратное снижение
дозы возбудителей от указанных выше (п.п. а., б.) приводило, как правило, к абортивному течению анаплазмоза:
а) 1,25х104 А. оу1Б/животное,
б) 0,75х 105 А. ша^шак/животное.
Поэтому в последующей работе при оценке иммуногенных свойств вакцины применяли, как правило, дозы возбудителей, соответствующие, по нашим данным, трем минимальным заражающим:
а) для овец - 7,5" 104 A. ovis /животное
б) для кр.рог.скота - 4,5' 105 А. marginale/ животное
Последовательность расчета заражающей дозы - 7,5х10 A. ovis /животное при оценке иммуногенных свойств вакцины против анаплазмоза овец.
Пример: количество эритроцитов в 1 мм3 - 6 786 000;
Количество эритроцитов в 100 п.з. микроскопа - 300x100 = 30 000;
Количество анаплазм в 100 п.з. микроскопа - 3;
Определим количество анаплазм в 1 мм3, составив пропорцию:
30 000 - 3 Х=6 786 000x3/30 000=678,6;
6 786 000 - х
Количество анаплазм в 1 см3 (мл) крови - 678,6x1000=678, 600.
Доза крови для заражения животных (опытных и контрольных):
75000:678,600 = 0,12 см3(мл) инфицированной крови.
Вакцины из антигенов соответственно:
A.ovis - для овец, A. marginale - для крупного рогатого скота вводили двукратно, с интервалами - 30 и 45 дней (в зависимости от применяемого адьюванта).
Напряженный иммунитет в 85% случаев формировался, в основном, к 60 дню после ревакцинации, предохранявший животных от заболевания как при контрольном введении инвазированной крови с возбудителями в указанных дозах, так и при нападении инвазированных клещей на животных при их пастбищном содержании.
УДК: 619:614.9-07 О.И. Кальницкая
Московский государственный университет прикладной биотехнологии
ПОДБОР МИКРОБНЫХ ТЕСТ-КУЛЬТУР К АНТИБИОТИКАМ
Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01, для продовольственного сырья животного происхождения обязательна информация об использовании (или отсутствии такового) пестицидов (гексахлорциклогексана, ДДТ и его метаболитов), антибиотиков, как до-
пущенных к применению в сельском хозяйстве (гризин, бацитрацин), так и лечебных, наиболее часто используемых в ветеринарии (тетерациклиновая группа, лево-мицетин, пенициллин, стрептомицин).
Все перечисленные вещества использу-
ются во всем мире, в том числе и у нас, для коррекции (исправления) различных негативных факторов, присутствующих при выращивании животных и их переработке. Однако остаточные количества антибиотиков недопустимы в сырье и продуктах животного происхождения.
Чтобы принять обоснованное решение, ветеринарному врачу необходимы глубокие знания фармакокинетики антибиотиков в организме животных различных видов, а также методики выявления их остаточных количеств в мясе, молоке и других продуктах и способы их обезвреживания с целью предотвращения вредного действия на организм людей.
В настоящее время наиболее доступными диагностическими методами обнаружения антибиотиков являются микробиологические. Мы поставили перед собой задачу подобрать к антибиотикам, содержание которых в продуктах убоя нормируется СанПиН 2.3.2.1078-01 и рекомендациями ФАО ВОЗ, наиболее чувствительные тест-культуры.
Материалы и методы. Постановка теста на чувствительность проводилась с чистой культурой методом диффузии в агар и методом серийных разведений.
Для исследования были использованы эталонные штаммы микроорганизмов, полученные в ФГУ «ВГНКИ». Подбор микроорганизмов осуществлялся согласно литературных данных (1). Чувствительность определяли по отношению к следующим антибиотикам: бензилпенициллину, тетрациклину, неомицину, гентамицину, спек-тиномицину, левомицетину, линкомицину, гризину и бацитрацину.
Чашки с дисками инкубировали в течение 18 часов при температуре 35-37° С в перевернутом положении, чтобы предотвратить размывание газона конденсационной жидкостью.
Показателем чувствительности микроорганизма к антибиотику служил размер зоны задержки микробного роста вокруг бумажного диска.
Из всех исследуемых штаммов были отобраны те, у которых наблюдалась наибольшая зона задержки роста вокруг диска, пропитанного антибиотиком. К таковым относятся: В.биЫШб Ь2, В.шус^ёеБ 537, В.ришНш ЖГГС 8241, З.аигеш 209-Р и АТСС 6538, М.Меш АТСС 9341, ЗшЬег-шорЫ1ш и Str.faeciuш.
Следующим этапом нашей работы было тестирование степени чувствительности отобранных штаммов к изучаемым ан-
тибиотикам. Степень чувствительности микроорганизмов определяли методом серийных разведений в жидкой питательной среде. В качестве питательной среды использовали бульон на переваре Хоттинге-ра, содержащий 110 мг% аминного азота, с добавлением 1% глюкозы, рН 7,2.
Степень чувствительности определяли по минимальному количеству антибиотика, дающему полную видимую задержку роста культуры (прозрачный бульон).
Результаты исследования. Нами установлено, что к бензилпенициллину чувствительны стафилококки, микрококки, термофильный стрептококк. Эти микроорганизмы не способны развиваться при концентрации антибиотика в среде 0,001 ед/мл. В.БиЫШБ Ь2 перестает размножаться при концентрации бензилпенициллина 0,01 ед в 1 мл среды. Менее чувствительны В.шу^ёеБ 537, В.ришНш ^ТС 8241 и Str.faecium. Их чувствительность составила 0,1 и 0,5 ед/мл соответственно.
К тетрациклину высокочувствителен штамм В.БиЫШБ Ь2. Он прекращает регенерировать при концентрации тетерацик-лина в среде 0,01 мкг/мл. В.ришНш NCTC 8241, S.aureus 209-Р и M.1uteusATCC 9341 чувствительны к концентрации 0,1 мкг те-терациклина в мл среды. У остальных микроорганизмов чувствительность ниже.
B.subti1is Ь2 и B.шycoides 537 чувствительны только к 0,1 мкг антибиотика в мл среды. В.ришПм NCTC 8241 и S.aureus 209-Р имеют еще более низкую чувствительность, они прекращают размножаться при концентрации 0,5мкг неомицина в мл среды. Остальные микроорганизмы не размножаются при концентрации 1 мкг/мл и выше. Однако, поскольку допустимое содержание неомицина, согласно рекомендаций ФАО ВОЗ, составляет от 0,5 мг/кг в мясе до 20 мг/кг в субпродуктах, то можно считать, что все исследуемые культуры микробов чувствительны к этой концентрации.
Чувствительными к гентамицину можно считать штаммы В^иЬи^ Ь2 и В.ришНш NCTC 8241. Они прекращают размножение при концентрации антибиотика в растворе 0,01 мкг/мл. Умеренной чувствительностью также обладают штаммы B.mycoides 537 и М.1^еш АГСС 9341, прекращающие размножение при концентрации 0,5 мкг/мл гентамицина. Остальные культуры можно отнести к малочувствительным.
Предельно допустимый уровень спек-тиномицина в продуктах убоя (согласно рекомендаций ФАО-ВОЗ) - 0,5 мг/кг. Та-
Таблица
Нижний предел чувствительности микробных культур к антибиотикам
Антибиотик Концентрация антибиотика в питательной среде, ед/мл, мкг/мл
B.subtilis L2 B. micoi-des 537 B.pumilus NCTC8241 S.aureus 209-P S.aureus ATCC6538 M.luteus ATCC9341 Str.ter-mophilus Str.fae-cium
Пенициллин (не допуск)* 0,01 1 0,5 0,001 0,001 100 0,001 1
Тетрациклин (не допуск) 0,01 5 0,1 0,1 0,5 0,1 5 100
Неомицин (0,5 мг/кг) 0,1 0,1 0,5 0,5 1 1 100 5
Гентамицин (0,1мг/кг) 0,01 1 0,01 5 5 0,5 1 100
Спекти-номицин (0,5 мг/кг) 0,01 1 0,001 0,1 0,5 1 5 10
Левоми- цетин (не допуск) 0,1 0,1 0,1 10 10 0,001 0,001 0,01
Линкомицин (0,1мг/кг) 0,1 5 100 10 100 1 100 100
Гризин (не допуск) 0,1 1 0,5 10 10 100 10 100
Бацитрацин (не допуск) 0,5 1 0,5 5 10 0,01 100 100
* В скобках указаны максимальные уровни остатков антибиотиков, допускаемые в продуктах убоя согласно СанПиН 2.3.2.1078 - 01 и рекомендаций ФАО ВОЗ.
кой чувствительностью обладают штаммы В.БиЫШБ Ь2, В.шусо1ёев 537, В.ришИш ЖГГС 8241, S.aureus штаммы 209-Р и АТСС 6538. У остальных микроорганизмов чувствительность лежит за пределами требуемой.
Левомицетин - синтетический аналог хлорамфеникола - в продуктах убоя не допускается. Высокой чувствительностью к этому антибиотику обладают М.1^еш АТСС 9341 и Str.thermophi1us. Они чувствительны к содержанию в растворе 0,001 мкг/мл левомицетина. При концентрации 0,01мкг/мл не растет также S.faeciuш.
При содержании в растворе от 0,001 до 5 мкг/мл линкомицина способны размножаться практически все исследуемые культуры, за исключением М.1^еш АТСС 9341 (он чувствителен к концентрации 0,1 мкг/ мл) и В^Ьй^ Ь2 (предел чувствительности 1 мкг/мл).
В^Ьи^ Ь2 и В^шИш ЖГГС 8241 чувствительны к концентрации гризина в растворе 0,5 мкг/мл.
М.1^еш АТСС 9341 прекращает размножение при содержании в растворе 0,01
мкг/мл бацитрацина. Остальные аппроби-рованные культуры можно считать недостаточно чувствительными к бацитрацину.
В результате исследований были установлены пределы чувствительности восьми штаммов микроорганизмов к девяти антибиотическим препаратам, наиболее часто применяемым в ветеринарии и животноводстве. Пределы чувствительности изучаемых микробных культур представлены в таблице.
Заключение
Штамм В^Ьй^ Ь2 является одновременно чувствительным к наличию в среде бензилпенициллина, тетрациклина, не-омицина, гентамицина, спектиномицина, линкомицина и гризина, охватывая, таким образом, достаточно широкий спектр антибиотиков. Для определения наличия в субстрате левомицетина и бацитрацина может быть использован штамм М.1^еш АТСС 9341, как наиболее чувствительный. У остальных изучаемых микроорганизмов интервал антибиотикочувствительности уже или же степень чувствительности ниже требуемой.
РЕЗЮМЕ
В статье приведены результаты изучения чувствительности восьми штаммов микроорганизмов к
антибиотикам, применяемым в ветеринарии и животноводстве.
SUMMARY
This article is about the microorganizm's sensation to the main veterinarian antibiotics. B.subtilis L2 and M.luteus ATCC 9341 may be used for the identification of the antibiotics in meat.
Литература
1. Аксенов В.И., Ковалев В.Ф. Антибиотики в про- щевой ценности пищевых продуктов. СанПиН дуктах животноводства. М.:Колос, 1977. 160 с. 2.3.2.1078-01. М., 2002. 164 с.
2. Гигиенические требования безопасности и пи-
УДК 619:614.9-07 О.И. Кальницкая
Московский государственный университет прикладной биотехнологии
ВЛИЯНИЕ ПАРАМЕТРОВ ТЕРМИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ МЯСА НА УМЕНЬШЕНИЕ В НЕМ ОСТАТКОВ АНТИБИОТИКОВ
В Российской Федерации действуют санитарно-эпидемиологические правила и нормативы «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (СанПиН 2.3.2.1078-01), где четко регламентируется содержание ряда антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения.
Лабораториям для практической работы на сегодняшний день требуются легко доступные экспресс-методы с высокой чувствительностью и удовлетворительными метрологическими характеристиками, которые позволили бы обнаруживать остаточные количества антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения.
Разработка и применение различных современных методов анализа антибиотиков гарантируют выпуск продуктов, свободных от присутствия лекарственных препаратов и отвечающих требованиям стандартов по качеству и безопасности [1,2,3].
В задачи ветеринарных специалистов входит ветеринарно-санитарный контроль продукции животноводства при обнаружении остаточных количеств антибиотиков, а также разработка способов технологической обработки продуктов убоя для уменьшения содержания в них наиболее часто встречающихся антибиотиков [4].
Материалы и методы. Для изучения влияния температурной обработки на разрушение антибиотиков в мышечной ткани нами исследованы 140 образцов мышечной ткани различных видов животных и птицы. Тушки птицы получены из АО «Леггорн» г. Тараклия.
Убой опытных животных и птицы проводили в различные сроки после введения препарата. Отбор образцов тканей проводили по ГОСТ 26668-85. Содержание анти-
биотиков определяли по МУ 3049-84 «Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства», экспресс-методом определения антибиотиков в пищевых продуктах (МУК 4.2.026-95), методом иммуноферментного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4.1.1912-04).
Для термической обработки применяли режимы и параметры, утвержденные «Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов». Мясо убойных животных проваривали кусками массой не более 2 кг в течение 3 ч. при достижении температуры внутри куска не менее 80°С. Тушки птицы разрубали вдоль позвоночника на две половины и проваривали при 100°С в течение 1 ч.
После проварки образцы повторно исследовали на содержание остаточных количеств антибиотиков. Исследованию также подвергали бульон, полученный после варки.
Результаты исследований. «Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1983 г.) не содержат рекомендаций по ветсанэкспер-тизе продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков. Даны лишь следующие указания: «В случае вынужденного убоя животных, подвергшихся отравлению ядовитыми веществами химического происхождения, решение о возможности использования в пищу мяса от таких животных принимается в каждом отдельном случае, с учетом степени и клинических признаков отравления животных, токсичности и остаточного количества яда, вы-
