CC BY
128
УДК 619:614.31:615.3 5:636.5'65:579
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ МАКРОЛИДОВ И ß-ЛАКТАМОВ В ПРОДУКЦИИ ПТИЦЕВОДСТВА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
И. М. АЗЫРКИНА
Государственный НИИ лабораторной диагностике и ветеринарно-санитарной экспертизе,
г. Киев, Украина, 03151
(Поступила в редакцию 30.01.2017)
Резюме. В статье приведены данные по апробации и валидации метода по определению остаточного количества макролидов и ß-лактамов в продукции птицеводства микробиологическим методом.
Ключевые слова: макролиды, ß-лактамы, тилозин, мясо птицы, яйца, яичные продукты.
Summary. The article contains data on the approbation and validation of a method for determining the residual amount of macrolides and ß-lactams in poultry products by a microbiological method.
Key words: macrolides, ß-lactams, tylosin, poultry, eggs, egg products.
Введение. Антибиотики занимают важное место в системе безопасности продуктов питания, особенно - продукции птицеводства. Их влиянию на здоровье человека и окружающей среды уделяют большое внимание практически все страны Европы, Великобритания, Канада и США. Так, остатки тилозина из группы макролидов, который применяют в качестве кормовых добавок для животных, представляет риск для потребителя, так как его остатки могут вызывать перекрестную резистентность с антибиотиками, которые используются для человека, и вызывать разные токсичные явления. Кроме того, было определено, что именно антибиотики группы макролидов и ß-лактамов являются потенциальными аллергенами: могут вызывать нарушение обмена веществ, снижения или повышения образования ферментов в организме, нарушение баланса гормонов, который приводит к возникновению аллергических заболеваний.
Единая концепция и подход к применению лекарственных препаратов по принципу наистрожайшего контроля их использования, разработки и применения разных современных микробиологических методов анализа антибиотиков позволят организовать производство продуктов здорового питания, которые не будут содержать остатков препаратов и отвечать требованиям стандартов относительно безопасности и качества [3].
Анализ источников. Установлено, что на данное время в Украине в рамках периодического контроля продукцию птицеводства микробиологическим методом не исследуют на остаточные количества мак-ролидов и р-лактамов [4]. Однако с сентября 2016 г в связи со вступлением в силу Приказа «Об утверждении Параметров безопасности мяса птицы» от 06.08.2013 г. № 695 расширились критерии исследования продукции птицеводства в рамках периодического контроля на остаточные количества антибиотиков (табл. 1, 2).
Т а б л и ц а 1. Сравнение показателей и МДР макролидов и р лактамов в продукции птицеводства по действующим нормативным документам Украины и ЕС
Антибиотики САС/MRL 02 Alimentarius Commission, мкг/кг Регламент Комисии (ее) №37/2010, мкг/кг Обязательный минимальный перечень исследований, МБТ (национальное законодательство) Приказа .№695 от 06.08.13 г., мкг/кг
Мясо птицы
Ампицилин - 50 - 50
Амоксицилин - 50 - 50
Клоксацилин - 300 - 300
Дифлоксацилин - 300 - 300
Оксацилин - 300 - 300
Тилозин 100 100 - 100
Линкомицин 200 100 - 100
Тиамулин - 100 - 100
Спирамицин 200 200 - 200
Тилмикозин 150 75 - 75
Еритромицин 100 200 - 200
Яйця
Еритромицин 50 150 - -
Линкомицин - 50 - -
Тиамулин - 1000 - -
Тилозин 300 200 - -
Т а б л и ц а 2. Концентрация антибиотиков внесенных в пробы (М±т, п=20)
Антибиотики Мясо Яйца и яичные продукты
% МДР МДР % МДР МДР
Ампицилин 25±1 50±1 - -
Амоксицилин 25±1 50±1 - -
Клоксацилин 150±1 300±1 - -
Дифлоксацилин 150±1 300±1 - -
Оксацилин 150±1 300±1 - -
Тилозин 50±1 100±1 100±1 200±1
Линкомицин 50±1 100±1 25±1 50±1
Тиамулин 50±1 100±1 500±1 1000±1
Спирамицин 100±1 200±1 - -
Тилмикозин 38±1 75±1 - -
Еритромицин 100±1 200±1 75±1 150±1
В данное время в Украине в рамках периодического в контроля продукции птицеводства микробиологическим методом определяют лишь остаточные количества антибиотиков тетрациклиновой группы, мясо птицы дополнительно контролируют на наличие остатков цинкбацитрацина, а в яйцах и яичных продуктах определяют остатки стрептомицина [4].
Используя методические указания №3049-84 от 1984 г. трудоемкий, сложный метод, а главное чувствительность которого не отвечает европейским требованиям и не охватывает исследования макролидов и Р-лактамов Согласно европейского законодательства остатки антимикробных препаратов в сырье и продукции животного происхождения регламентируются такими нормативными документами: Регламентом Комиссии (ЕС) №37/2010, Директивой Совета №96/23/ЕЭС, САС/MRL 02, Codex Alimentarius Commission (Комиссией Кодекс Алиментариус), Commission Décision 2002/657/EC (Решение Комиссии 2002/657/EC), которые гармонизированы в Украине в Приказе №695 от 06.08.2013 г.
С марта в 2004 г. в странах ЕС с целью определения остаточных количеств макролидов и р-лактамов используют скрининговый микробиологический метод - «A new microbial screening method for the detection of antimicrobial residues in slaughter animals: The Nouws antibiotic test (NAT-screening)» [5, 9].
На остаточное количество антимикробных препаратов исследования проводятся микробиологическими, иммунологическим методами и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [3].
В основе микробиологического метода определения макролидов и Р-лактамов лежит принцип диффузии в агар, то есть способности антибиотиков диффундировать в плотную питательную среду, инокули-рованную специфическим чувствительным тестовым микроорганизмом, вызывая задержку его роста. Это проявляется появлением в агаре четко очерченных, чистых от роста тестовой культуры зон [5].
«NAT-screening» был валидирован и утвержден в соответствии с 2002/657/ЕС и аккредитован за Dutch Accreditation Council в ISO 17025. Чувствительность этого метода для макролидов и р-лактамов отвечает максимально допустимым уровням (МДР) нормативных документов ЕС (табл. 1, 2). Преимуществом данного метода является то, что обеспечивается идентификация остаточных количеств антимикробных препаратов к группе, тем же облегчая дальнейшее подтверждение методом жидкостной хроматографии [5-9].
Цель работы - сравнительный анализ национальных и европейских микробиологических скрининговых методов и проведение апробации, валидации качественного микробиологического метода «NAT-
screening» определения макролидов и ß-лактамов в мясе птицы, яйцах и яичных продуктах.
Материал и методика исследований. Анализ национальных и европейских микробиологических скрининговых методов относительно остаточного количества антибактериальных препаратов в продуктах птицеводства проводили согласно нормативно-законодательной базы и доступных литературных источников. Для установления предела чувствительности микробиологического метода «NAT-screening» из определения остатков макролидов и ß-лактамов было проведено исследование на моделируемых пробах мяса птицы, яиц и яичных продуктов: свободных от антибиотиков и с добавлением аналитов этих же антибиотиков в концентациях ^ МДР и МДР. Исследования проводились в 20 паралелях.
Подготовка тестовой культуры микроорганизма и чашек с тестовым агаром.
Для исследования использовали музейний штам тест-культуры Ko-curia rhizophila АТСС 9341, чувствительной к макролидам и ß-лактамам в концентрации 106КУО/см3. Использовали питательные среды Hi-Sensitivity Test Agar (производителя HIMEDIA, Индия) с рН 8,0. Агар наливали в чашки Петри слоем 2,5 мм.
Стандарт антибиотика.
Использовали стандарт «Тилозин» (производителя Sigma Aldrich) -основной раствор антибиотика розводили 1,5 М фосфатным буферным раствором с рН 8,0. Раствор тилозина с активностью 0,05 мкг вносили по 100 мкл в чашки з тестовым агаром на диск 12,7 мм, Whatman, Schleicher & Schuell, 's Hertogenbosch, Netherlands.
Приготовление проб к исследованию. Мясо: пробы мяса вынимали из морозильника за несколько минут перед исследованием, клали их на нержавеющий стальной поднос, поверхность мяса выравнивали и делали поперечные надрезы скальпелем, в которые вкладывали диски из фильтровальной бумаги диаметром 12,7 мм на 30 мин. с целью пропитки мясным соком.
При исследовании яиц отбирали желток, которым также пропитывали диски диаметром 12,7 мм, Whatman, Schleicher & Schuell, 's Hertogenbosch, Netherlands.
Яичный порошок предварительно разводили дистиллированной водой и прогревали в водяной бане при температуре 65±1°С на протяжении 10 минут. Пропитывали диски диаметром 12,7 мм, Whatman, Schleicher & Schuell, 's Hertogenbosch, Netherlands суспензией образца.
В каждой чашке с тестовым агаром делали по 2 лунки диаметром 14 мм, в которые заливали 1,5 М фосфатныйй буферный раствор
(рН 8,0) до границы луночки, после чего в них вкладывали, пользуясь пинцетом, диски, пропитанные соком одной пробы, друг напротив друга.
Чашки инкубировали в течение 16-18 часов при температуре 37±1°С. После инкубации чашки осматривали на наличие зон ингибирования тестовой культуры Kocuria rhizophila АТСС 9341 вокруг лунок.
Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с использованием программы «Microsoft Excel 2015» с вычислением среднего арифметического (М), стандартной погрешности^) и уровня достоверности (р) за таблицей Стьюдента. Разницу между двумя величинами считали достоверной при р<0,05; р <0,01; р <0,001.
Также определяли точность, специфичность, чувствительность метода, согласно ДСТУ ISO 16140:2006.
Для установления границы чувствительности микробиологического метода «NAT-screening» по определению остатков макролидов и ß-лактамов было проведено исследование на моделируемых пробах мяса птицы, яиц и яичных продуктов: пробах мяса, свободных от антибиотиков (негатив), и в пробах с внесенными стандартными растворами антибиотиков в концентрациях ^ МДР, МДР; пробах яичных продуктов и яйцах, свободных от антибиотиков и с добавлением антибиотиков в концентрациях ^ МДР и МДР этих же антибиотиков (табл. 2). Исследования проводились в 20 повторяемостях.
Спецефичность. Также к пробам внесли для определения специфичности антимикробные препараты в концентрации окситетрацик-лина - 0,6 мкг/кг, дигидрострептомицина - 0,5 мкг/кг, флюмеквина -0,4 мкг/кг, сульфадиазина - 0,5 мкг/кг.
Результаты исследований и их обсуждение. Проведя серию опытов, установлено, что вокруг луночек с внесенным стандартом наблюдаются четко очерченные, чистые от роста тестовой культуры Kocuria rhizophila АТСС 9341 зоны ингибирования, которые колеблются в пределах от 17,01±0,01 до 20,03±0,03 мм давали зону с задержкой роста. Вокруг дисков с негативной пробой наблюдали сплошной рост тестовых культур.
Вокруг дисков с пробами продукции птицеводства, в которые были внесены антибиотики группы макролидов и ß лактамов, наблюдались четко очерченные зоны задержки роста тестовой культуры Kocuria rhizophila АТСС 9341. Результаты относительно диаметров зон инги-бирования для разных продуктов и разных антибиотиков приведены в табл. 3 и 4.
Т а б л и ц а 3. Диаметры зон задержки роста тест-культуры Косипа гМ/орШа АТСС 9341 вокруг проб мяса с добавлением аналитов М±т, мм, п=20
Концентрация антибиотика в пробах
проба з добав- проба з добав-
Антибиотики негативный контроль лением аналита лением анали-
контроль (стандарт) на уровне % МДР та на уровне МДР
Ампицилин 17,03±0,01* 18,03±0,02*
Амоксицилин § ^ 1 & и РЗ >< 17,03±0,02* 18,03±0,02*
Клоксацилин 17,01±0,01* 18,01±0,01*
Дифлоксацилин Св 3 я _ ^ Я о 3 ^ 2 В, я 5 й я ° Й 0 о 8 8 17,03±0,03* 18,01±0,01*
Оксацилин 17,03±0,03* 18,03±0,03*
Тилозин " о 2 ё Ь & Й Я О , о 2 Я й й о, 18,01±0,01* 20,01±0,01*
Линкомицин £ 18,01±0,01* 20,01±0,01*
Тиамулин НИ 18,03±0,03* 20,03±0,03*
Спирамицин 18,01±0,01* 20,03±0,03*
Тилмикозин <5 а 18,03±0,03* 20,03±0,03*
Еритромицин 18,03±0,02* 18,03±0,02*
* - р <0,05; разница значений показателя концентраций антибиотика относительно негативного контроля.
Т а б л и ц а 4. Диаметры зон задержки роста тест-культуры Косипа гМ/орШа АТСС 9341 вокруг проб яиц с добавлением аналитов, М±т, мм, п=20
Антибиотики Концентрация антибиотика в пробах
Негативный контроль Контроль (стандарт) Проба з добавлением аналита на уровне % МДР Проба з добавлением аналита на уровне МДР
Еритромицин Отсутствующие зоны задержки роста тестовой культуры вокруг дисков, пропитанных жидкостью пробы 18±0,05 мм 18,01±0,01* 20,03±0,03*
Линкомицин 18,03±0,02* 20,03±0,03*
Тиамулин 18,03±0,02* 20,03±0,03*
Тилозин 18,03±0,02* 20,03±0,02*
* - р <0,05; разница значений показателя концентраций антибиотика относительно негативного контроля.
Анализируя полученные данные, следует отметить, что зоны инги-бирования вокруг проб мяса с '/2 МДР клоксацилина имели самые низкие зоны задержки роста и были 17,01±0,01 мм, наивысшие же зоны задержки роста 18,03±0,03 мм наблюдали вокруг дисков, пропитанных жидкостью проб с добавлением тиамулина, эритромицина, тилмикози-на на уровне / МДР.
В пробах яиц самые низкие зоны задержки роста были вокруг проб с добавлением 1 МДР эритромицина и составляет 18,01±0,01 мм, наивысшие же зоны задержки роста 18,03±0,02 мм были вокруг проб с добавлением на уровне / МДР линкомицина, тиамулина, тилозина.
Что же касается результатов с добавкой клоксацилина, дифлокса-цилина в пробах мяса на уровне 1 МДР, то зоны ингибирования были 18,01±0,01 мм, наивысшие же зоны задержки роста были 20,03±0,03 мм наблюдались вокруг дисков, пропитанных жидкостью проб с добавлением тиамулина, спирамицина, тилмикозина.
Однако в пробах яиц на уровне 1 МДР самые низкие зоны задержки роста 20,03±0,02 мм наблюдались вокруг дисков с пробой добавлением тилозина, наивысшие же задержки роста отмечались вокруг проб с добавлением антибиотика эритромицином, линкомицином, тиамули-ном - 20,03±0,03 мм.
Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что самый низкий уровень определения (/ МДР) остаточных количеств мак-ролидов и в лактамов для Косина rhizophila АТСС 9341 с помощью качественного микробиологического скринингового метода <^АТ-Бсгеет^» для мяса представляет 25 мкг/кг, для яиц и яичных продуктов - 50 мкг/кг Специфичность, точность и чувствительность данного метода была 100 %.
Специфичность. Пробы, в которые добавили окситетрациклин, ди-гидрострептомицин, флюмеквин, сульфадиазин отсутствовали зоны ингирования вокруг лунок добавлеными антимикробными препаратами.
Заключение. 1. В Украине с сентября 2016 года продукция птицеводства должна контролироваться (приказ № 695) на остаточные количества макролидов и в-лактамов, с сентября 2016 года становится обязательным определение макролидов и в-лактамов.
2. <^АТ-Бсгеет^» - более дешевый и доступный скрининговый микробиологический метод.
3. Установлена чувствительность скринингового микробиологического метода <^АТ-Бсгеет^» остаточных количеств макролидов и в-лактамов для мяса она составляет для тилозина - 100 мкг/кг, линкоми-цина - 100 мкг/кг, тиамулина 100 - мкг/кг, спирамицина - 200 мкг/кг,
тилмикозина - 75 мкг/кг, эритромицина - 200 мкг/кг, ампициллина -50 мкг/кг, амоксицилина - 50 мкг/кг, клоксацилина - 300 мкг/кг, дик-локсацилина - 300 мкг/кг, оксациллина - 300 мкг/кг, для яиц и яичных продуктов эритромицина - 150 мкг/кг, линкомицина - 50 мкг/кг, ти-амулина - 1000 мкг/кг, тилозина - 200 мкг/кг, который отвечает МДР европейского законодательства и приказа №695 от 06.08.2013 г.
4. Установлено, что специфичность, точность «NAT-screening» представляет 100 %.
В связи с расширением критериев исследования продукции птицеводства на остаточные количества макролидов и р-лактамов в рамках периодического контроля следует внедрить в работу лабораторий ветеринарной медицины метод «NAT-screening».
ЛИТЕРАТУРА
1. Влиявление остаточных количеств антибиотиков в мясе убойных животных и птицы / Ю.А. Сосина [и др.] // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии. - 2012. - Вып. 6. - С. 178-180.
2. Наказ Державного департаменту ветеринарно!' медицини N° 87 вщ 18.11.2003 року «Обов'язковий мишмальний перелж дослщжень сировини, продукцп тваринного та рос-линного походження, комбжормово!' сировини, комбiкормiв, вгтам^зованих препаратов та in., яю слщ проводити в державних лаборатс^ях ветеринарно!' медицини» [Електрон-ний ресурс] - Режим доступа: http://document.ua/obovjakovii-minimalnii-perelik-doslidzhen-sirovini-produkciy-nor8259.html. - Дата доступа: 23.01.2016 г.
3. Степна, О. О. Ветеринарно-саштарна оцшка продукпв ш^вництва при асоцшо-ваному перебшу ешерихiозу i еймерiозу [Електронний ресурс] - Режим доступу: http://repo.sau.sumy.ua/handle/123456789/908. - Дата доступа: 23.01.2016 г.
4. Шершнев, Е. С. Особенности подхода США к вопросам контроля качества продовольствия / Е. С. Шершнев, М. Л. Мамиконян, В. Г. Ларионов // Пищевая промышле-ность. - 1998. - № 7. - С. 52-55.
5. A new microbial screening method for the detection of antimicrobial residues in slaughter animals: The Nouws antibiotic test (NAT - screening) [Електронний ресурс] - Режим доступа: htt://www.elsevier.com/locate/foodcont. - Дата доступа: 23.01.2016 г.
6. Commission Regulation (EU) № 37/2010 // Official journal of the European Commission. - 2010. - L 15. - Р. 72.
7. Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Commission, L 221, Р. 8-28.
8. Gondova Zuzana. The NAT test - screening for antibiotic residues in the tissues of food-producing animals / Zuzana Gondova, Ivona Kozarova.//Institute of Meat Hygiene and Technology University of Veterinary Medicine and Pharmacy Kosice, Slovak Republic. [Електронний ресурс] - Режим доступа: http://www.maso-international.cz/download/maso-international-2012-2-page-095-100.pdf. - Дата доступа: 24.01.2016 г.
9. Nico COPPENS. Microbial screening tests for antibiotic residues in meat: compared with the European technologies / Ghent university veterinary faculty [Електронний ресурс] -Режим доступа: http://lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/001/893/681/RUG01-001893681_2012_ 0001_AC.pdf. - Дата доступа: 24.01.2016 г.
