CC BY
16
УДК 579.222 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-1-82-91
ПОДБОР ЭКСТРАГИРУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ИЗ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ
БАКТЕРИЙ
В.В. Суворова, Д.А. Колыхалов, И.А. Нечаева
В настоящей работе показано влияние состава системы экстрагирования на жирнокислотный состав бактерий рода Екойососсж. В качестве органических растворителей использовали хлороформ и метанол в разном соотношении. Определение жирных кислот в исследуемых экстрактах проводили методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием. Качественное и количественное определение жирных кислот в составе липидов бактерий проводили по стандартной смеси, содержащей 26 идентифицированных жирных кислот с длиной цепи от 11 до 20 атомов углерода. Жирнокислотный профиль анализируемых бактерий различался значительно при использовании разных систем экстракции, что связано с полярностью экстрагента и типом липидов.
Ключевые слова: липиды бактерий, экстракция, жирные кислоты, КИоёосос-сж, газовая хроматография.
Введение
Грамположительные бактерии рода ЯНо^соссш являются представителями эколого-трофической группы микроорганизмов, которые способны окислять широкий спектр природных и антропогенных загрязнителей [1]. На основе бактерий-деструкторов углеводородов нефти, дизельного топлива, сырой нефти создаются различные биопрепараты для биоремедиации загрязнённых земель, воды, заболоченных мест [2]. Они участвуют в различных биохимических процессах и обладают широким диапазоном адаптивных особенностей, что обеспечивает их способность к деградации гидрофобных субстратов. Установлено, что адаптивные реакции микроорганизмов на изменение условий окружающей среды осуществляются преимущественно за счет модификаций мембранных липидов и углеводородных радикалов их жирных кислот, которые определяют текучесть мембраны, устойчивость к температурам, гидрофобность [3].
Термин «липиды» по-разному истолковывается разными исследователями. В большинстве случаев под липидами понимают химически разнородные соединения, нерастворимые в воде и обладающие общим свойством: высокой растворимостью в неполярных органических растворителях (хлороформе, диэтиловом спирте или бензоле). Это свойство обусловлено тем, что в молекулах липидов преобладают длинные алифатические углеводородные цепи или бензольные кольца, то есть неполярные, гидрофобные компоненты. У ряда липидов эти компоненты
соединяются с полярной группой, что делает их амфифильными — сочетание гидрофильной, способной к образованию водородных связей, и гидрофобной, избегающей воды, частей одной и той же молекулы. Однако далеко не все липиды растворимы в этих растворителях [4]. Тем не менее, определение такого рода вводит в заблуждение, поскольку многие из веществ, которые в настоящее время широко рассматриваются как липиды, могут быть почти так же хорошо растворимы в воде, как и в органических растворителях. По мнению авторов [5], это определение ограничивает использование термина «липиды» по отношению к жирным кислотам и их производным, а также к веществам, биосинтетически или функционально подобным этим соединениям. Fahy с соавт. [6], в целях достижения всеобъемлющей системы классификации липидов определили липиды как небольшие гидрофобные или амфифильные молекулы, которые могут полностью или частично образовываться путем карбанионной конденсации тиоэфиров (жирные кислоты, поликетиды и т. д.) и карбкатионной конденсации единиц изопрена (пренол (2-метилбутен-2- ол-4), стерины и др.).
Наибольшим разнообразием в составе бактериальных липидов характеризуются жирные кислоты (алифатические карбоновые кислоты). В бактериях присутствует свыше 300 жирных кислот и родственных соединений. Жирные кислоты не только входят в состав сложных липидов, этерифицируют оксигруппы белков, полисахаридов, но и могут находиться в свободном виде. Жирные кислоты, обнаруженные в бактериальных клетках, чаще всего имеют четное (от 12 до 20) число атомов углерода и относительно просты по химической структур [4].
При выборе метода экстракции необходимо понимать, что липиды по химической структуре гетерогенны, обладают высокой растворимостью в неполярных растворителях, так как имеют гидрофобный характер. Среди них различают нейтральные липиды (свободные жирные кислоты и их эфиры, моно-, ди- и триацилглицерины, стероиды, воски, углеводороды) и полярные липиды (фосфолипиды, сфинго- и гликолипиды, цереброзиды). Поэтому, при экстракции липидов принимают во внимание тот факт, что они способны не только к гидрофобным взаимодействиям, но и к образованию водородных, электростатических и ковалентных (сложно-эфирные, амидные, гликозидные) связей [7].
Наиболее часто используемым методом экстрагирования является метод жидкостной экстракции. Набор веществ, полученных в липидном экстракте, зависит от используемого метода экстракции, особенно от выбранного растворителя. Плохо растворяясь в воде, липиды требуют особых подходов при их выделении и разделении. В качестве экстрагентов применяются различные растворители или их комбинации, при этом наиболее часто выделяют сочетание растворителей - смесь хлороформа и метанола в двухстадийной экстракции. Экстракция органическими раство-
рителями является первоочередным этапом в процессе анализа липидов, поэтому результаты разных исследователей, использующих различные методы выделения липидов, могут отличаться.
Целью данной работы является сравнение систем экстракции для анализа жирнокислотного состава бактерий рода Rhodococcus.
Материалы и методы
Объекты исследования. Для культивирования использовали штаммы бактерий Rhodococcus erythropolis X5 (Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2532 Д) и Rhodococcus erythropolis S67 (Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2533 Д), которые предоставлены сотрудниками лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
Условия культивирования. Культивирование проводили на агаризованных средах LB [8] и Эванса [9] с добавлением н-гексадекана в качестве единственного источника углерода и энергии. Среду Эванса доводили до рН 7,0 соляной кислотой. Готовые среды стерилизовали в автоклаве в течение 40 мин при 121 °С и давлении 0,5 атм. Бактерии выращивали в течении 72 часов до отдельных колоний, после чего пересаживали на жидкую минеральную среду Эванса с добавлением н-гексадекана (2% по объёму) в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование проводили в течение 3 суток при температуре 26 oC в шейкере-инкубаторе (Biosan, Латвия). Клетки собирали центрифугированием 10000 об/мин 10 минут, используя центрифугу MPW-351R (MPW, Польша).
Выделение липидов из бактерий. Суммарные клеточные липиды экстрагировали органическими растворителями из влажной биомассы бактерий по методике [4]. Влажную биомассу массой 500 мг разбавляли дистиллированной водой до объёма 1 мл. Суспензию помещали в стеклянную пробирку с притёртой крышкой и прибавляли 3,75 мл смеси хлороформ - метанол (1:2 по объёму); смесь оставляли при комнатной температуре на 2 часа, периодически встряхивая. Далее смесь разливали по микроцентрифужным пробиркам и осаждали центрифугированием. Супернатант декантировали в стеклянную пробирку с притёртой крышкой. Микробные клетки снова суспендировали в 4,75 мл смеси хлороформ -метанол - вода (1:2:0,8 по объему), смесь встряхивали и центрифугировали. К объединённому супернатанту прибавляли 5 мл смеси хлороформ - вода (1:1 по объему). Слой хлороформа разделяли центрифугированием. Нижний хлороформный слой разбавляли 4 мл бензола и упаривали досуха в вакууме на роторном испарителе UL-1100 (35оС) (Ulab, Китай).
Аналогично методике представленной выше, проводили экстракцию клеточных липидов из влажной биомассы бактерий смесью хлороформ - метанол (2:1 по объёму).
Переэтерификация липидов. Суммарные клеточные липиды ресуспендировали в 2 мл смеси метанол - концентрированная серная кислота (5% по объему) и нагревали на водяной бане при 60 оС в течение 2 часов. После охлаждения экстрагировали 5 мл гексана дважды. Остаток серной кислоты в экстракте отмывали дистиллированной водой до нейтрального значения рН. Экстракт использовали для испытаний [10].
Газо-хроматографический анализ экстрактов. Анализ компонентов проводили на газовом хроматографе Хроматэк «Кристалл-5000» (ЗАО СКБ «Хроматэк», Россия) с пламенно-ионизационным детектором.
Условия хроматографического разделения:
- колонка капиллярная DB-FFAP размером 50 м х 0,25 мм (неподвижная фаза - полиэтиленгликоль, модифицированный нитротереф-талевой кислотой, толщина фазы 0,25 мкм);
- начальная температура термостата колонки - 150 °С;
- выдержка при начальной температуре - 1 мин;
- программирование температуры - от 150 до 200 °С;
- выдержка при конечной температуре - 10 мин;
- газ-носитель - азот, 20,9 мл/мин (постоянный расход);
- проба - 1 мкл;
- температура испарителя - 230 °С. [11].
Для идентификации жирных кислот использовали стандартную смесь метиловых эфиров жирных кислот.
Обсуждение результатов
Для экстракции липидов из биомассы грамположительных бактерий [12-17] чаще всего используют смеси неполярного и полярного растворителей, таких как: хлороформ-метанол в разном соотношении. Полярные растворители разрушают водородные и электростатические связи. Их применяют в смеси со слабополярными растворителями при экстракции липидов из плазматических мембран [18]. Неполярные органические растворители разрушают белково-липидные комплексы, образованные гидрофобными взаимодействиями. Липиды, находящиеся в комплексах и связанные ковалентными связями с молекулами других веществ, растворителями не экстрагируются. Их можно выделить только после гидролиза комплекса слабыми растворами кислот или щелочей в органическом растворителе [4]
В экстракт помимо липидов переходят не липидные вещества (сахара, аминокислоты, соли и т. д.). Для их удаления экстракт липидов промывают водой. При этом образуется двухфазная система, состоящая из
органической и водной фаз. В водную фазу переходит большая часть полярных соединений. Органическую фазу, содержащую большую часть экстрагируемых липидов, отделяют от водной части центрифугированием. При удалении не липидных примесей происходит частичная потеря кислых липидов.
Так, наиболее распространенными способами экстракции являются метод Фолча с различными его модификациями [19], а также метод Блайта-Дайера [20]. По методу Фолча экстракцию проводят смесью хлороформ-метанол 2:1. Как известно, данный метод позволяет получить достаточно высокий выход нейтральных липидов, диацилглицерофосфо-липидов и сфинголипидов. При этом лизофосфолипиды переходят в раствор частично, а более полярные кислые липиды могут теряться при промывке экстракта растворами солей и водой. В способе Блайта-Дайера экстракцию липидов осуществляют смесью хлороформ-метанол 1:1. Однако и в этом случае, как сказано выше, при промывке водой наиболее полярные кислые фосфолипиды и лизофосфолипиды переходят в водную фазу и теряются.
Из вышесказанного следует, что сложностью в выборе экстрагирующей системы может являться природа типов взаимодействия липидов конкретного вида бактерий. В данной работе для анализа жирнокислотного состава липидов бактерий использовали две экстрагирующие системы -хлороформ-метанол 2:1 и хлороформ-метанол 1:2. Таким образом, применяли полярную и неполярную системы экстрагирования для выявления особенностей в жирнокислотном составе родококков согласно схеме:
.ТТттттттттьт
Получение липидов из биомассы бактерий
Жирнокислотный состав полученных липидов определяли методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Хроматэк «Кристалл-5000» с пламенно-ионизационным детектором путём анализа соответствующих производных жирных кислот - метиловых эфиров жирных кислот. Для получения метиловых эфиров использовали реакцию переэтерифи-кации метанолом с серной кислотой в качестве катализатора.
Качественное определение жирнокислотного состава проводили по стандартной смеси, содержащей 26 идентифицированных жирных кислот. Количественное определение жирнокислотного состава бактерий Якойо-соссш вту^тороШ Х5 и Ккойососсш вту^тороШ Б67 проводили по концентрации известных компонентов стандартной смеси и площади пиков (табл. 1 и табл. 2, соответственно).
Таблица 1
Метиловые эфиры жирных кислот бактерий Я. вгуИггороШ Х5
Компонент Хлороформ-метанол - 1:2 (система 1) Хлороформ-метанол - 2:1 (система 2)
время, мин концентрация, % время, мин концентрация, %
С11:0 9,709 0,13±0,02 10,427 0,013±0,003
С10:0,2-0Н 11,949 0,067±0,009 11,807 0,27±0,02
С12:0 - - 13,812 0,111±0,006
С13:0 16,306 0,15±0,01 16,113 0,09±0,01
С12:0,3-0Н 17,773 0,171±0,006 - -
С14:0 18,184 0,049±0,009 - -
С15:0 ап-teiso - - 19,984 0,90±0,03
С15:0 21,796 0,77±0,04 21,506 0,53±0,04
С14:0,3-0Н - - 22,518 0,28±0,01
С16:0 iso 23,804 0,07±0,01 - -
С17:0 iso - - 26,389 0,48±0,02
С17:1 - - 29,918 0,209±0,003
С18:1 34,335 0,19±0,02 - -
Результаты представлены с доверительными интервалами (п=3; Р=0,95)
Для штамма Х5, используя систему хлороформ-метанол - 2:1, процентные концентрации жирных кислот выше, чем при соотношении экстрагирующих компонентов 1:2. При этом пентадекановая кислота является преобладающей в системе 1:2, а 13-метилтетрадекановая кислота - в системе 2:1 (табл. 1).
Жирнокислотный профиль штамма Б67 в двух экстракционных системах хлороформ-метанол значительно отличаются друг от друга.
Однако жирной кислотой с большим содержанием оказалась пентадекановая кислота для двух систем экстракции (табл. 2).
Таблица 2
Метиловые эфиры жирных кислот бактерий Я. вгуМгороШ 867
Компонент Хлороформ-метанол - 1:2 (система 1) Хлороформ-метанол - 2:1 (система 2)
время, мин концентрация, % время, мин концентрация, %
С11:0 9,737 0,134±0,003 10,013 0,036±0,007
С10:0,2-0Н 12,003 0,03±0,01 - -
С13:0 16,371 0,12±0,03 16,104 0,041±0,009
С12:0,3-0Н 17,834 0,093±0,009 - -
С14:0 - - 18,223 0,031±0,007
С15:0 iso - - 18,813 0,06±0,01
С15:0 ап-teiso - - 20,371 0,017±0,002
С15:0 21,845 0,56±0,05 21,461 0,5±0,2
С14:0,3-0Н - - 22,486 0,20±0,02
С16:0 iso 24,132 0,17±0,05 - -
С16:2-20Н - 31,124 0,034±0,005
С18:2 0,067±0,008
С18:1 34,400 0,05±0,02 - -
Результаты представлены с доверительными интервалами (п=3; Р=0,95)
Следует отметить, что полученный в данной работе профиль жирных кислот двух исследуемых бактерий в большей степени представлен насыщенными жирными кислотами с прямым (ундекановая, тридекановая и пентодекановая кислоты) и разветвлённым (13-метилтетра-декановая, 14-метилпентадекановая и др.) строением углеродной цепи, что согласуется со спектром жирных кислот родококков [21-24].
Бактерии Ккойососст вту^тороШ Х5 и Шойососсш вту^тороШ Б67 по жирнокислотному составу значительно различаются вне зависимости от используемой системы экстрагирования. Различия в составах жирных кислот двух штаммов бактерий, можно объяснить тем, что различные системы экстракции подходят для извлечения из бактериальных клеток жирных кислот близкой полярности. Так, более полярные растворители применяются для извлечения полярных липидов, таких как: фосфолипиды, гликолипиды. Соответственно, неполярные растворители используются для извлечения нейтральных липидов -триацилглицеролов, свободных жирных кислот, восков [5, 7, 18].
Заключение
При использовании двух систем экстракции в процессе анализа липидов грамположительных бактерий рода Rhodococcus жирнокислотные профили значительно отличались друг от друга. Из чего следует, что разные классы липидов должны быть проанализированы отдельно. Следовательно, в настоящее время не существует единого метода, благодаря которому за один эксперимент возможно было бы проанализировать все липидные компоненты клетки, несмотря на усовершенствование аналитического оборудования.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания в области научной деятельности проект № FEWG-2021-0013 (Биокаталитические платформы на основе клеток микроорганизмов, субклеточных структур и ферментов в сочетании с наноматериалами)
Список литературы
1. Kuyukina M.S., Ivshina I.B. Bioremediation of contaminated environments using Rhodococcus // Biology of Rhodococcus, 2019. P. 231-270.
2. Solyanikova I., Golovleva L. Biochemical features of the degradation of pollutants by Rhodococcus as a basis for contaminated wastewater and soil cleanup // Microbiology, 2011. V. 80. P. 591-607.
3. Adaptation mechanisms of Rhodococcus sp. CNS16 under different temperature gradients: Physiological and transcriptome / C. Wang, Y. Chen, H. Zhou [et al.] // Chemosphere, 2020. V. 238. P. 124571.
4. Ившина И. Большой практикум «Микробиология»: учебное пособие. Спб.: Проспект науки, 2014. 112 с.
5. Акмурзина В.А., Селищева А.А., Швец В.И. От анализа липидов к липидомике // Вестник МИТХТ им. МВ Ломоносова. 2012. Т. 7. № 6. С. 3-21.
6. A comprehensive classification system for lipids1 / E. Fahy, S. Subramaniam, H.A. Brown [et al.] // Journal of lipid research, 2005. V. 46. № 5. P. 839-861.
7. Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в гидробионтах с различным содержанием полиненасыщенных кислот методом газожидкостной хроматографии / А.А. Никонова, С.М. Шишлянников, Т.А. Шишлянникова [и др.] // Журнал аналитической химии, 2020. Т. 75. № 10. С. 907-920.
8. Обзор питательных сред, используемых для культивации рекомбинантной Escherichia coli / Ю.В. Юшин, Р.В. Подкопайло, Д.А.
Петрова [и др.] // Медицина экстремальных ситуаций, 2019. Т. 21. № 3. С. 444-453.
9. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat // Methods Microbiol, 1970. V. 2. P. 277-327.
10. ГОСТ 31665-2012 Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот. Введ. 2014-01-01. М.: Стандартинформ, 2019. 27 с.
11. ГОСТ 31663-2012 Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров жирных кислот. Введ. 2014-01-01. М.: Стандартинфор, 2019. 12 с.
12. Suzuki K.I., Komagata K. Taxonomic significance of cellular fatty acid composition in some corineform bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol, 1983. V. 83. I. 2. P. 188.
13. Analysis and optimization of triacylglycerol synthesis in novel oleaginous Rhodococcus and Streptomyces strains isolated from desert soil / A. Röttig, P. Hauschild, M.H. Madkour [et al.] // Journal of biotechnology, 2016. V. 225. P. 48-56.
14. Optimization of macroelement concentrations, pH and osmolarity for triacylglycerol accumulation in Rhodococcus opacus strain PD630 / H.J. Janßen, M.H.A. Ibrahim, D. Bröker [et al.] // AMB express, 2013. V. 3. P. 1-8.
15. Spanevello M., Yamamoto H., Patel B.K.C. Thermaerobacter subterraneus sp. nov., a novel aerobic bacterium from the Great Artesian Basin of Australia, and emedation of the genus Thermaerobacter // Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 2002. V. 52. P. 795.
16. Fatty acid composition of six freshwater wild cyanobacterial species / T. Rezanka, I. Dor, A. Prell [et al.] // Folia Microbiol, 2003. V. 48. I. 1. P. 71.
17. Polar lipids and fatty acids of three wild cyanobacterial strains of the genus Chroococcidiopsis / T. Rezanka, I. Viden, J.V. GO [et al.] // Folia Microbiol, 2003. V. 48. I. 6. P. 781.
18. Вострикова Н.Л., Кузнецова О.А., Куликовский А.В. Методические аспекты извлечения липидов из биологических матриц // Теория и практика переработки мяса, 2018. Т. 3. № 2. С. 4-21.
19. Folch J., Lees M., Stanley G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem., 1957. V. 226. № 1. P. 497.
20. Blight E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Canadian J. Biochem. Physiol, 1959. V. 37. № 8. P. 911.
21. Rhodococcus qingshengii sp. nov., a carbendazim-degrading bacterium / J.L. Xu, J. He, Z.C. Wang [et al.] // International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2007. V. 57. № 12. P.2754-2757.
22. Rhodococcus artemisiae sp. nov., an endophytic actinobacterium isolated from the pharmaceutical plant Artemisia annua L / G.Z. Zhao, J. Li,
W.Y. Zhu [et al.] // International jour-nal of systematic and evolutionary microbiology, 2012. V. 62. № 4. P.900-905.
23. Rhodococcus lactis sp. Nov., an actinobacterium isolated from sludge of a dairy waste treatment plant / P.K. Singh, A. Kumari, N. Chawla [et al.] // International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2015. V. 65. № 11. P.4215-4220.
24. Rhodococcus pyridinivorans sp. nov., a pyridine-degrading bacterium / J.H. Yoon, S.S. Kang, Y.G. Cho [et al.] // International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2000. V. 50. № 6. P.2173-2180.
Суворова Виктория Васильевна, младший научный сотрудник лаборатории экологической и медицинской биотехнологии НИЦ «БиоХимТех», [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Колыхалов Денис Алексеевич, младший научный сотрудник лаборатории химической конверсии возобновляемой биомассы и органического синтеза НИЦ «БиоХимТех», Laften_ 71rus@,mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Нечаева Ирина Александровна, старший научный сотрудник лаборатории экологической и медицинской биотехнологии НИЦ «БиоХимТех», доцент кафедры Биотехнологии, nechaeva1902@gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
SELECTION OF EXTRACTING COMPONENTS FOR THE EXTRACTION OF FATTY ACIDS FROM GRAM-POSITIVE BACTERIA
V.V. Suvorova, D.A. Kolykhalov, I.A. Nechaeva
This paper shows the effect of the extraction system composition on the fatty acid composition of bacteria of the genus Rhodococcus. Chloroform and methanol in different ratios were used as organic solvents. Determination of fatty acids in the studied extracts was carried out by gas chromatography with flame ionization detection. Qualitative and quantitative determination of fatty acids in bacterial lipids was carried out using a standard mixture containing 26 identified fatty acids with a chain length from 11 to 20 carbon atoms. The fatty acid profile of the analyzed bacteria differed significantly when using different extraction systems, which is associated with the polarity of the extractant and the type of lipids.
Key words: bacterial lipids, extraction, fatty acids, Rhodococcus, gas chromatog-
raphy.
Suvorova Victoria Vasilyevna, Junior researcher at the Laboratory of Environmental and Medical Biotechnology of SIC "BioChemTech", [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Kolykhalov Denis Alekseevich, Junior researcher at the Laboratory of Chemical conversion of Renewable Biomass and Organic Synthesis of SIC "BioChemTech", Laften_71rus@,mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Irina Nechaeva, Senior Researcher at the Laboratory of Environmental and Medical Biotechnology of the Research Center "BioChemTech", Associate Professor of the Department of Biotechnology, nechaeva1902@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University
