CC BY
32
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 579.222 DOI: 10.24412/2071-6176-2021-2-14-21
ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS
В. В. Суворова, И. А. Нечаева
Анализ клеточных жирных кислот методом газовой хроматографии стал стандартным методом идентификации бактерий в лабораториях. Проведен анализ клеточных жирных кислот для изучения таксономической специфичности бактерий-нефтедеструкторов. Для этого произведены экстракция липидов, а также качественное и количественное определение жирных кислот в составе липидов бактерий при росте на среде с добавлением гексадекана в качестве единственного источника углерода и энергии. Выявлены преобладающие жирные кислоты исследуемых микроорганизмов.
Ключевые слова: хемотаксономия, липиды бактерий, жирнокислотный состав, Rhodococcus.
Хемотаксономия играет важную роль в систематике и идентификации тех групп прокариотных организмов, у которых морфологические и физиологические характеристики широко варьируются и недостаточны для проведения их точной идентификации [1]. Микроорганизмы рода Rhodococcus обладают широким спектром адаптивных особенностей, обеспечивающих их способность к деградации гидрофобных субстратов [2]. На основе бактерий - представителей рода Rhodococcus создаются различные биопрепараты для биоремедиации земель, воды, заболоченных мест [3]. Микроорганизмы рода Rhodococcus активно применяются в качестве продуцентов различных органических кислот, аминокислот, сахаров и полисахаридов, витаминов [4]. Выше перечисленные признаки подчеркивают важность быстро и однозначно идентифицировать виды микроорганизмов рода Rhodococcus, что требует их соответствующей классификации.
Таксономическая ценность состава жирных кислот бактериальных клеток долго подвергалась сомнению ввиду того, что состав жирных кислот в значительной мере зависит от возраста культуры, условий её выращивания, а именно состава среды, рН, температурного режима. Однако при строгом соблюдении общих требований к выращиванию культур качественный анализ групп жирных кислот достаточно постоянен [5]. Жирные кислоты определяют физико-химические свойства микроорганизмов: текучесть мембраны, устойчивость к температурам, гидрофобность. Наличие разветвлённых и ненасыщенных жирных кислот увеличивает текучесть мембраны микроорганизмов [6].
Спектр жирных кислот отдельных видов бактерий может быть настолько характерным, что определение его не составляет сомнений в видовой принадлежности культур. В рамках таксономии анализ жирных кислот бактериальных клеток полезен в качестве экспрессного и относительно недорогого метода, позволяющего сравнивать и группировать большое количество штаммов с минимальными усилиями и затратами, получать наглядную информацию по характеристике и идентификации бактериальных культур [7].
Целью данной работы является изучение таксономической специфичности состава жирных кислот бактерий рода Rhodococcus, на примере жирнокислотного состава четырех штаммов бактерий-нефтедеструкторов.
Материалы и методы
Объекты исследования и условия культивирования. Объектами исследований стали бактерии Rhodococcus pyridinivorans 5Ap [8], Rhodococcus qingshengii F2 [9], Rhodococcus erythropolis X5 и Rhodococcus erythropolis S67 [10] из коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид Института биохимии и микробиологии им. Г.К. Скрябина РАН, которые предоставлены для исследований сотрудниками лаборатории.
Культивирование проводили на агаризованных средах LB [11] и Эванса [12] с добавлением н-гексадекана в качестве единственного источника углерода и энергии. Готовые среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при 116 °С и давлении 0,5 атм. Бактерии выращивали в течении 72 часов до отдельных колоний, после чего пересаживали на жидкую минеральную среду Эванса с добавлением н-гексадекана в качестве единственного источника углерода и энергии - 5 г/л (2 % по объему). Культивировали в течении 72 часов при температуре 28 oC на орбитальной качалке Excella 25 (Eppendorf, Германия). Клетки собирали центрифугированием 10000 об/мин 10 минут [13].
Выделение липидов из бактерий. Суммарные клеточные липиды экстрагировали неполярными органическими растворителями из влажной биомассы бактерий по методике [14]. Влажную биомассу, содержащую 400-800 мг клеток, доводили дистиллированной водой до объёма 1 мл. Суспензию помещали в стеклянную пробирку с притертой крышкой и прибавляли 3,75 мл смеси хлороформ - метанол (1:2 по объему); смесь оставляли при комнатной температуре на 1,5-2 часа, периодически встряхивая. Далее смесь разливали по микроцентрифужным пробиркам и осаждали центрифугированием. Супернатант декантировали в стеклянную пробирку с притертой крышкой. Микробные клетки снова суспендировали в 4,75 мл смеси хлороформ - метанол - вода (1:2:0,8 по объему), смесь встряхивали и центрифугировали. К объединённому супернатанту прибавляли 5 мл смеси хлороформ - вода (1:1 по объему). Слой
хлороформа разделяли центрифугированием. Нижний хлороформный слой разбавляли 4 мл бензола и упаривали досуха в вакууме на роторном испарителе (30-35 оС).
Переэтерификация липидов. Переэтерификацию эфиров жирных кислот проводили метанолом по методике [15]. Образец ресуспендировали в 2 мл смеси концентрированной серной кислоты - метанол (5 % по объему) и нагревали на водяной бане при 60 оС в течение 2 часов. После охлаждения экстрагировали 5 мл гексана дважды. Остаток серной кислоты в экстракте отмывали дистиллированной водой до нейтрального значения рН. Экстракт использовали для испытаний.
Разделение и идентификация компонентов. Жирнокислотный состав липидов определяли методом газовой хроматографии. Образец анализировали [16] с помощью газового хроматографа Хроматэк «Кристалл5000» (Хроматэк, Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Начальная температура термостата колонки - 150°С; программирование температуры - от 150 до 200 °С в течение 1 часа. Выдержка при конечной температуре - 10 мин. Времена выхода полученных жирных кислот определены с помощью анализа стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот, состава: С11:0, С10:0,2-0Н, С12:0, С13:0, С12:0,2-0Н, С12:0,3-0Н, С14:0, С15:0 iso, С15:0 anteiso, С15:0, С14:0,2-0Н, С14:0,3-0Н, С16:0 iso, С16:1, С16:0, С17:0 iso, С17:1, С17:0, С16:2-20Н, С18:2, С18:1 цис-9, С18:1 транс-9, С18:0, С19:0 цис, С19:0, С20:0, - при тех же условиях разделения.
Результаты и их обсуждение
В результате проведения экстракции из биомассы бактерий и выпаривания экстракта получили остаток липидов Я. pyridinivorans 5Ар в количестве 82 мг/г(биомассы), Я. qingshengii Б2 - 84 мг/г(биомассы), Я. erythropolis Х5 - 90 мг/г(биомассы), Я. erythropolis Б67 - 78 мг/г(биомассы). Далее липиды подвергали процессу переэтерификации входящих в их состав жирных кислот. Полученный раствор метиловых эфиров жирных кислот подвергали хроматографическому анализу.
Для определения жирных кислот проводили идентификацию метиловых эфиров жирных кислот сначала стандартной смеси, а затем сравнивали времена выхода компонентов исследуемых образцов с временами выхода компонентов стандартного образца. Времена выхода компонентов стандартного образца, описанных выше, представлены на рис. 1.
Хроматограмму метиловых эфиров жирных кислот бактерий Я. qingshengii Б2 является более типичной для бактерий рода Яhodococcus, но различается с хроматограммами других исследуемых микроорганизмов по положению и интенсивности хроматографических пиков. Результаты анализа хроматограмм суммированы в таблице.
Рис. 1. Хроматограмма стандарта метиловых эфиров жирных кислот
Времена выхода метиловых эфиров жирных кислот бактерий R. qingshengii Б2 представлены на рис. 2.
Рис. 2. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот бактерий
R. qingshengii Г2
Количественное содержание жирных кислот в липидных экстрактах*
М ассовая доля жирных кислот, %
Жирные кислоты Я. pyridinivorans 5Ар Я. qingshengii Б2 Я. erythropolis Х5 Я. erythropolis Б67
С11:0 2,7±0,1 10,9±0,6 9,1±0,5 5,7±0,3
С10:0,2- 2,4±0,1 — 4,4±0,2 2,7±0,1
ОН
С13:0 2,7±0,1 2±0,1 8,7±0,4 10,2±0,5
С12:0,3- 1,8±0,1 1,0±0,1 10,7±0,5 8,7±0,4
ОН
С14:0 8,9±0,5 1,0±0,1 2,0±0,2 —
С15:0 26±1 — 47±2 52±3
С15:0 iso — 6,8±0,3 — —
С15:0 — 41±2 — —
anteiso
С16:0 iso 23±1 1,3±0,1 4,3±0,2 16±1
С16:1 — 1,0±0,1 — —
С17:0 iso — 1,7±0,1 — —
С17:1 — 5,3±0,3 — —
С17:0 — 5,0±0,3 — —
С18:1 33±2 — 12,2±0,6 5,2±0,3
С16:2- — 2,5±0,1 — —
20Н/
С18:2
С20:0 — 21±1 — —
*Результаты представлены с доверительными интервалами ( п=1, Р=0,95).
По полученным данным можно сделать вывод, что для бактерий Rhodococcus qingshengii Б2 преимущественными кислотами являются 12-метилтетрадекановая кислота (40,6 %) и эйкозановая кислота (21 %). Преобладающими для бактерий Rhodococcus pyridinivorans 5Ар являются пентадекановая (26 %), 14-метилпентодекановая (23 %), олеиновая (33 %) кислоты. Для бактерий Rhodococcus erythropolis Б67 доминирующей является пентадекановая кислота (52 %), а также 14-метилпентодекановая (15,9 %) и тридекановая кислота (10,2 %). А для бактерий Rhodococcus erythropolis Х5 в результате анализа метиловых эфиров жирных кислот основными оказалась пентадекановая кислота (47 %),так же в заметных количествах обнаружены: олеиновая (12,2 %), 3-гидроксидодекановая (10,7 %) и ундекановая кислота (9,1 %).
Сопоставление жирнокислотных профилей микроорганизмов Rhodococcus pyridinivorans 5Ap, Rhodococcus qingshengii F2, Rhodococcus erythropolis X5 и S67 выявляет их отличительные особенности. Так, Rhodococcus pyridinivorans 5Ap успешно различают по максимальному (33,28%) содержанию олеиновой кислоты (С18:1) по сравнению с таковым содержанием у Rhodococcus erythropolis X5 и S67 (12,2 и 5,2 % соответственно). Своеобразие жирнокислотного состава Rhodococcus qingshengii F2 проявляется более высоком содержании 12-метилтетрадекановая (С15:0 anteiso) и эйказановой кислот (C18:1) (40,61 и 21,06 %, соответственно) по сравнению с Rhodococcus pyridinivorans 5Ap, Rhodococcus erythropolis X5 и S67, у которых данные кислоты не обнаруживаются. Rhodococcus erythropolis успешно различают по максимальному содержанию тридекановой (С13:0), 3-гидроксидодекановая (С12:0,3-ОН) и пентадекановой (С15:0) кислот по сравнению с таковым содержанием у R. pyridinivorans и R. qingshengii, и по минимальному содержанию олеиновой кислоты по сравнению с R. pyridinivorans. Штаммы Rhodococcus erythropolis X5 и S67 успешно различают по содержанию тетрадекановой (миристиновой) (С14:0) кислоты, у Rhodococcus erythropolis X5 её содержание минимально (2,9 %), а у Rhodococcus erythropolis S67 её не обнаруживается.
Выводы
Выявленные особенности жирнокислотного состава родококков можно использовать для построения частной таксономической системы, позволяющей дифференцировать Rhodococcus на видовом уровне и даже на уровне штаммов.
Список литературы
1. Kuyukina M. S., Ivshina I. B. Rhodococcus biosurfactants: biosynthesis, properties, and potential applications // Biology of Rhodococcus. -Springer, Berlin, Heidelberg, 2010. P. 291-313.
2. van der Geize R., Dijkhuizen L. Harnessing the catabolic diversity of rhodococci for environmental and biotechnological applications // Current opinion in microbiology. 2004. V. 7. № 3. P. 255-261.
3. Gürtler V., Seviour R. J. Systematics of members of the genus Rhodococcus (Zopf 1891) emend Goodfellow et al. 1998 // Biology of Rhodococcus. 2010. V. 16. P. 1-28.
4. Solyanikova I., Golovleva L. Biochemical features of the degradation of pollutants by Rhodococcus as a basis for contaminated wastewater and soil cleanup // Microbiology. 2011. V. 80. № 5. P. 591-607.
5. Siliakus M.F., van der Oost J., Kengen S.W.M. Adaptations of archaeal and bacterial membranes to variations in temperature, pH and pressure // Extremophiles. 2017. V. 21. №. 4. P. 651-670.
6. Трапезникова Б. В., Иванова Т. Н., Кожедуб А. П. Бактерии рода Rhodococcus: клиническое значение, диагностика и возможности антибактериальной терапии // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2013. Т. 15. №. 3. С. 173-183.
7. The genus Rhodococcus / K.S. Bell, J.C. Philp, D.W.J. Aw [et al.] // Journal of Applied Microbiology. 1998. V. 85. № 2. P. 195-210.
8. Rhodococcus pyridinivorans sp. nov., a pyridine-degrading bacterium / J.H. Yoon, S.S. Kang, Y.G. Cho [et al.] // International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2000. V. 50. № 6. P. 2173-2180.
9. Rhodococcus qingshengii sp. nov., a carbendazim-degrading bacterium / J.L. Xu, J. He, Z.C. Wang [et al.] // International journal of systematic and evolutionary microbiology. - 2007. V. 57. № 12. P. 2754-2757.
10. Rhodococcus erythropolis septicaemia in a patient with acute lymphocytic leukaemia / S.D. Park, Y. Uh, I.H. Jang [et al.] // Journal of medical microbiology. - 2011. V. 60. № 2. P. 252-255.
11. Обзор питательных сред, используемых для культивации рекомбинантной Escherichia coli / Ю.В. Юшин, Р.В. Подкопайло, Д.А. Петрова [и др.] // Медицина экстремальных ситуаций. 2019. Т. 21. №3. С. 444-453.
12. Деструкция нефти бактериями рода Pseudomonas, содержащими различные плазмиды биодеградации / А.А. Ветрова, А.А. Овчинникова, А.Е. Филонов [и др.] // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2008. №2. С. 186-193.
13. Kuyukina M.S., Ivshina I.B. Application of Rhodococcus in bioremediation of contaminated environments // Biology of Rhodococcus. Springer, Berlin, Heidelberg, 2010. № 3. P. 231-262.
14. ГОСТ 31665-2012 Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот. Введ. 2014-01-01. М.: Стандартинформ, 2019. 27 с.
15. Eder K. Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 1995. V. 671. №. 1-2. P. 113-131.
16. ГОСТ 31663-2012 Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров жирных кислот. Введ. 2014-01-01. М.: Стандартинформ, 2019. 12 с.
Суворова Виктория Васильевна, бакалавр, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Нечаева Ирина Александровна, канд. биол. наук, доц., nechaеva1902@gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
TAXONOMIC SPECIFICITY OF THE COMPOSITION OF FATTY ACIDS OF BACTERIA OF THE GENUS RHODOCOCCUS
V. V. Suvorova, I. A. Nechaeva
Analysis of cellular fatty acids by high-resolution gas chromatography has become a standard method of bacterial identification in laboratories. In the study described here, cellular fatty acid analysis was performed to study the taxonomic specificity of petroleum destructor bacteria. For this purpose, lipid extraction and qualitative and quantitative determination of fatty acids in the lipids of bacteria when growing on medium with the addition of hexadecane as the sole source of carbon and energy were performed. The predominant fatty acids of the studied microorganisms were revealed.
Key words: chemotaxonomy, bacterial lipids, fatty acid composition, Rhodococcus.
Suvorova Viktoria Vasilevna, bachelor student, suvorova.victoria. 2()l()/amail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Nechaeva Irina Aleksandrovna, candidate of biological sciences, assistant professor, nechae va 19((2agmail. com, Russia, Tula, Tula State University
