CC BY
36
УДК: 579.222
СРАВНЕНИЕ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЛИПИДОВ БАКТЕРИЙ ПРИ РОСТЕ НА СРЕДАХ С РАЗНЫМ ИСТОЧНИКОМ
УГЛЕРОДА
В. А. Афанасьева, С. В. Алферов, И. А. Нечаева
Произведена экстракция липидов, а также качественное и количественное определение трех жирных кислот (октановой, декановой и гексадекановой) в составе липидов бактерий при росте на среде с добавлением глюкозы/гексадекана в качестве источника углерода. При росте на глюкозе бактерии накапливают большее количество липидов в клетках, и жирнокислотный состав более разнообразен, чем при росте на гексадекане. При росте на гидрофобном субстрате в липидах преобладают две кислоты (октановая и декановая), которые входят в состав продуцируемых данными бактериями биосурфактантов.
Ключевые слова: липиды бактерий, жирнокислотный состав, адаптация.
Введение
Представители бактерий рода Rhodococcus широко встречаются в природе. Повсеместное распространение этих бактерий позволяет им обладать широкой биохимической пластичностью и различными приемами адаптации к стрессовым условиям. Эти актинобактерии хорошо известны как метаболически универсальные микроорганизмы с потенциальным применением в биоремедиации [1]. Они являются активными биодеструкторами токсичных и труднодоступных для многих микроорганизмов углеводородов (алифатических, ароматических, поли- и гетероциклических) и их производных [2].
Бактерии, подвергающиеся воздействию стрессовых сред, имеют разные адаптационные механизмы, которые до конца не изучены. Их изучение у родококков имеет потенциальное значение для восстановления окружающей среды. Один из предложенных механизмов представляет собой физиологическую реакцию в виде изменения в морфологии клеток и составе жирных кислот в липидах [2].
Так, бактерии демонстрируют способность приспосабливаться к солевой среде. В работе [3] показали, что клетки R. erythropolis способны быстро адаптироваться к высоким концентрациям хлорида натрия посредством изменения жирнокислотного состава. Изменения в составе липидных жирных кислот наблюдались уже после 6 минут экспозиции. Наиболее примечательной адаптивной реакцией был синтез полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), что необычно для мезофильных бактерий. В природе немногие бактерии способны синтезировать ПНЖК, большинство из них являются морскими бактериями, в частности выделенные из холодных, глубоководных отложений. В условиях солевой среды предполагается, что ПНЖК
способствуют поддержанию соответствующей текучести цитоплазматической мембраны.
Известно, что состав клеточных липидов играет важную роль в адаптации бактерий к разным субстратам и неблагоприятным условиям внешней среды [4]. Уникальность актинобактерий состоит в том, что внешний липидный барьер проницаемости для гидрофобных субстратов в клетку формируют высокомолекулярные гидроксикислоты - миколовые кислоты, которые способствуют проникновению углеводородов в клетку. Кроме того, при пониженной температуре происходит существенное изменение жирнокислотного состава мембранных липидов. Бактерии адаптируются к росту при низкой температуре за счет увеличения содержания липидов и уменьшения их степени насыщенности для сохранения оптимальной текучести мембран.
Цель работы заключается в количественном и качественном определении жирных кислот в составе выделенных липидов при росте бактерий Rhodococcus erythropolis X5 на среде с добавлением глюкозы/гексадекана.
Материалы и методы
Объект исследования и условия культивирования.
Исследования проводили на бактериях Rhodococcus erythopolis X5 из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино) под номером ВКМ Ас-2532 Д.
Культивирование проводили на твердых агаризованных средах LB и Эванса с добавлением глюкозы (гексадекана). Готовые среды титровали соляной кислотой до рН 7,0 и стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при 116°С и давлении 0,5 атм. Бактерии выращивали в течении 72 часов до отдельных колоний, после чего пересаживали на жидкую минеральную среду Эванса с добавлением глюкозы (гексадекана) - 5г/л (2% по объему). Выращивали в течении 72 часов при температуре 28oC на орбитальной качалке Excella 25. Клетки собирали центрифугированием 10000 об/мин 10 минут.
Подготовка образцов. Суммарные клеточные липиды экстрагировали неполярными органическими растворителями из влажной биомассы бактерий по методике [5]. Влажную биомассу, содержащую 4080 мг клеток (в расчете на сухой вес) разбавляли дистиллированной водой до объема 1 мл. Суспензию помещали в стеклянную пробирку с притертой крышкой и прибавляли 3,75 мл смеси хлороформ - метанол (1:2, по объему); смесь оставляли при комнатной температуре на 1,5-2 часа, периодически встряхивая. Далее смесь разливали по микроцентрифужным пробиркам и осаждали центрифугированием. Супернатант декантировали в стеклянную пробирку с притертой крышкой. Микробные клетки снова
суспендировали в 4,75 мл смеси хлороформ - метанол - вода (1:2:0,8 по объему), смесь встряхивали и центрифугировали. К объединенному супернатанту прибавляли 5 мл смеси хлороформ - вода (1:1 по объему). Слой хлороформа разделяли центрифугированием. Нижний хлороформный слой разбавляли 4 мл бензола и упаривали досуха в вакууме на роторном испарителе (30-35оС).
Жирнокислотный состав липидов определяли методом газовой хроматографии. Для этого проводили переэтерификацию эфиров жирных кислот метанолом по методике [6]. Навеску образца 30-40 мг ресуспендировали в 2 мл смеси концентрированной серной кислоты -метанол (5% по объему) и нагревали на водяной бане при 60оС в течение 2 часов. После охлаждения экстрагировали 5 мл гексана дважды. Остаток серной кислоты в экстракте отмывали дистиллированной водой до нейтрального значения рН. Экстракт использовали для испытаний.
Разделение и идентификация компонентов. Образец анализировали с помощью газового хроматографа Хроматэк «Кристалл-5000» с термоионным детектором. Начальная температура термостата колонки - 40°С; программирование температуры - от 40 до 250 °С в течение 30 минут. Выдержка при конечной температуре - 30 мин.
Времена выхода определяемых жирных кислот определены проведением анализа смеси чистых жирных кислот состава С(8:0), С(10:0), С(16:0) при тех же условиях разделения.
Результаты и их обсуждение
В результате проведения экстракции из биомассы бактерий и выпаривания экстракта получили сухой остаток липидов в количестве 90 мг (из 535 мг влажной биомассы при росте на глюкозе) и 40 мг (из 835 мг влажной биомассы при росте на гексадекане). Далее липиды подвергали процессу переэтерификации входящих в его состав жирных кислот. Полученный раствор метиловых эфиров жирных кислот подвергали хроматографическому анализу. Результаты анализа представлены на хроматограммах (рис. 1, 2).
При росте бактерий на глюкозе наблюдается характерный для вида жирнокислотный состав. Преобладающие компоненты жирнокислотного состава родококков - насыщенные прямоцепочечные кислоты с четным числом углеродных атомов, такие как С(8:0) , С(10:0) , С(12:0) , С(14:0) жирные кислоты. Также представители бактерий рода Rhodococcus независимо от их видовой принадлежности характеризуются повышенным содержанием гексадекановой кислоты С(160) [7].
Рис. 1. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот, входящих в состав липидов бактерий при росте на глюкозе
Рис. 2. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот, входящих в состав липидов бактерий при росте на н-гексадекане
Из рис.1 видно, что при росте на глюкозе у бактерий достаточно разнообразен жирнокислотный состав, тогда как при росте на н-гексадекане (рис. 2) преобладающими являются две жирные кислоты -октановая и декановая, эти кислоты входят в состав внеклеточных биосурфактантов, продуцируемых при росте на гидрофобных субстратах [8]. Также в небольшом количестве присутствует гексадекановая кислота,
которая является промежуточным метаболитом н-гексадекана. Данные количественного определения трех кислот представлены в таблице.
Количественное содержание жирных кислот в липидном экстракте
Жирная кислота Содержание при росте бактерий на глюкозе, % Содержание при росте бактерий на гексадекане, %
Октановая 16 16,3
Декановая 9,4 67,1
Гексадекановая 4,5 1,2
Выводы
Общее содержание выделенных липидов в перерасчете на грамм биомассы составило 168,2 мг/г(биомассы) при росте бактерий на среде с добавлением глюкозы. При росте на гексадекане - 47,9 мг/г(биомассы). Жирнокислотный состав разнообразнее у бактерий, растущих на глюкозе. Для Rhodococcus erythropolis X5 характерно преобладание короткоцепочечных жирных кислот с четным числом атомов, а также наличие гексадекановой кислоты. У бактерий, растущих на среде с добавлением н-гексадекана, декановая кислота является преобладающей жирной кислотой в липидном экстракте, также присутствует октановая кислота и обнаруживается гексадекановая кислота. Эти кислоты входят в состав продуцируемых бактериями биосурфактантов.
Список литературы
1. Solyanikova, I., Golovleva, L. Biochemical features of the degradation of pollutants by Rhodococcus as a basis for contaminated wastewater and soil cleanup // Microbiology. 2011. V. 80(5). P. 591-607.
2. R. der Geize, Dijkhuizen L. Harnessing the catabolic diversity of rhodococci for environmental and biotechnological applications // Current Opinion in Microbiology. 2004. V. 7(3). P. 255-261.
3. Rapid adaptation of Rhodococcus erythropolis cells to salt stress by synthesizing polyunsaturated fatty acids / de Carvalho C.C., Marques M.P., Hachicho N. [et al] // Appl Microbiol Biotechnol. 2014. V.98. P. 5599-5606.
4. Margesin R., Moertelmaier C., and Mair J. Low-temperature biodegradation of petroleum hydrocarbons (n-alkanes, phenol, anthracene, pyrene) by four actinobacterial strains // Int Biodeterior Biodegradation. 2013. V.84. P. 185-191.
5. Bligh E.G., Dyer W.J. Can. J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Biochem. Physiol. 1959. V.37. P. 911.
6. Eder K. Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters // Biomed Sci Appl. 1995, V. 671. P. 113-131.
7. Ившина И. Б. Бактерии рода Rhodococccus (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие): автореф. дис. ... д-ра биол. наук / И. Б. Ившина. Пермь. 1997. С. 30-40.
8. Влияние физиологических особенностей бактерий рода Rhodococcus на деградацию н-гексадекана / Лыонг Т.М., Нечаева И.А., Понаморёва О.Н. [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2016. № 1. С. 90-98.
Афанасьева Вера Александровна, магистрант, va vera afanaseva amail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Алферов Сергей Валерьевич, канд. хим. наук, доц., s.v.alferovaigmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Нечаева Ирина Александровна, канд. биол. наук, доц., песИне va1902agmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
FATTY ACID COMPOSITION COMPARISON OF LIPIDS EXTRACT FROM BACTERIA GROWN ON CULTURE MEDIUM WITH DIFFERENT CARBON
SOURCE
V. A. Afanasyeva, S. V. Alferov, I. A. Nechaeva
The qualitative and quantitative determination of three fatty acids (octane, decane and hexadecane fatty acids) in the composition of lipid extract was made. Bacteria was growing on a medium with the addition of glucose/hexadecane as a carbon source. When growing on glucose bacteria accumulate large amounts of lipids in cells and the fatty acid composition is more diverse than growing on glucose. When growing on a hydrophobic substrate lipids are dominated by two acids (octane and decane), which are part of the biosurfactants produced by these bacteria.
Key words: bacterial lipids, fatty acid composition, adaptation.
Afanasyeva Vera Aleksandrovna, master student [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Alferov Sergey Valerievich, candidate of chemical sciences, assistant professor, s.v.alferovaigmail. com, Russia, Tula, Tula State University,
Nechaeva Irina Aleksandrovna, candidate of biological sciences, assistant professor, nechaeva1902@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University
