CC BY
112
УДК 615.322:582.287.237
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ.
XI. ЛИПИДЫ ВОДНОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЧАГИ
© М.А. Сысоева , В.Р. Хабибрахманова, В. С. Гамаюрова, А.Х. Тазеева
Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса, 68, Казань, Республика Татарстан, 420015 (Россия) E-mail: [email protected]
Статья посвящена исследованию свободных и слабосвязанных липидов коллоидной системы водного извлечения чаги. Липиды и сопутствующие им вещества отделяли исчерпывающей экстракцией водного извлечения чаги петролейным эфиром, хлороформом и хлороформ-этанольной смесью в соотношении 2 : 1. Исследование полученных экстрактов проведено с помощью тонкослойной хроматографии, газо-жидкостной хроматографии и спектрофотометрических методов. Проведено количественное определение липидов различной структурной организации. Установлено, что в свободном и слабосвязанном состоянии в коллоидной системе больше нейтральных липидов, чем полярных. Из биологически активных соединений этого класса показано наличие таких как стерины и их эфиры, ненасыщенные жирные кислоты, витамин К и кофермент Q, а также полярных липидов - фосфолипидов и гликолипидов.
Ключевые слова: чага, водная вытяжка, нейтральные и полярные липиды, тонкослойная хроматография (ТСХ), газожидкостная хроматография (ГЖХ).
Введение
Исследованию липидов чаги посвящено мало работ. Особенно актуально исследование этого класса соединений, переходящих в водные извлечения, поскольку их применяют для терапии предраковых состояний и рака различной этиологии. Рыжовой Г.Л. были идентифицированы высшие жирные кислоты в гидролизате ПФК [1]. В работах Шивриной А.Н. и Ловягиной Е.В. определено, что в состав чаги входят стерины и три-терпены в количестве 0,2% от сухого веса гриба [2].
Целью исследования является определение количества липидов отделяемых органическими растворителями из водных извлечений чаги, а также изучение их качественного состава для определения биологически активных веществ этого класса соединений, способных обеспечивать терапевтический эффект водных извлечений чаги.
Экспериментальная часть
Для экстракции использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети. Поставщик ЗАО «Фирма Здоровье» серия 020605, 2005 г. Московская область, Красногорский район. Вытяжки получали согласно методике [3]. Выделение липидов проводили экстракцией водной вытяжки чаги органическими растворителями согласно методике [4]. Содержание экстрактивных веществ определяли весовым методом [5]. Качественный состав липидов анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil» в следующих системах растворителей: петролейный эфир - диэтиловый эфир - уксусная кислота (90 : 10 : 1, для нейтральных липидов) и хлороформ - ацетон - метанол - уксусная кислота - вода (6 : 8 : 2 : 2 : 1, для полярных липидов). В качестве проявителей применяли: 20%-ный раствор сульфата аммония (все классы липидов); раствор хлорного железа (стерины и их эфиры); 0,25% раствор нингидрина в бутаноле (липиды, имеющие свободные аминогруппы, а также амино-фосфатиды в количестве не менее 1 мкг); анилинфталевый реактив (гликолипиды) [6].
Для количественного определения полярных липидов в хлороформном и хлороформ-этанольном экстрактах балластные соединения удаляли по методике [7]. Количественное определение стеринов, гликолипидов и липидов, содержащих в своем составе первичную аминогруппу, осуществляли согласно методикам [6-8]. Кислотное, йодное число и число омыления определяли по стандартной методике [9].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Жирнокислотный состав липидов устанавливали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Жирные кислоты анализировали в виде их метиловых эфиров на хроматографе «Шимадзу-ОС-8А» с плазменноионизационным детектором с использованием насадочной колонки (2,0 м *2,5 мм), заполненной с 5% ДЭГА (Р) на Chromaton N-super в режиме программирования температуры. В качестве газа-носителя применяли гелий со скоростью потока 30 мл/мин. Идентификацию кислот проводили сравнением относительных времен удерживания их метиловых эфиров по отношению к стандарту (18920 - LAMP).
Обсуждение результатов
Водное извлечение чаги - это полидисперсная коллоидная система. Липиды и сопутствующие им вещества могут находиться в ней в эмульгированном и связанном с дисперсной фазой состоянии - с полифено-локсикарбоновым комплексом (ПФК). Эффективность экстракции липидов в значительной степени зависит от химической природы липидных компонентов и от вида комплексов, которые образуют липиды в этой системе. Для экстракции нейтральных липидов использовали петролейный эфир. Извлечение как нейтральных, так и полярных липидов проводили хлороформом, а также смесью хлороформ - этанол в соотношении (2 : 1). Извлекаемые этими растворителями липиды и сопутствующие им вещества находятся в коллоидной системе водного извлечения чаги в свободном или слабосвязанном состоянии.
Максимальной экстрагирующей способностью для этой системы обладает петролейный эфир. Им удалось извлечь 22% веществ от сухого остатка водного извлечения чаги, взятого на экстракцию. Содержание экстрактивных веществ в хлороформном экстракте составляет 1,51%, а в хлороформ-этанольном - 8,34%. Низкое содержание экстрактивных веществ в хлороформном и хлороформ-этанольном экстрактах объясняется тем, что при применении для экстракции этих растворителей образуется эмульсионный слой, где липиды находятся в связанном состоянии.
Для установления качественного состава нейтральных и полярных липидов в полученных экстрактах использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ).
Как показано на рисунке 1, состав нейтральных липидов во всех объектах исследования одинаков. Применение в качестве проявителя раствора хлорного железа позволило обнаружить по фиолетовой окраске пятен на хроматограмме такие биологически активные липиды, как стерины и их эфиры, ненасыщенные жирные кислоты, витамин К и кофермент Q [6, 10].
Хроматограмма полярных липидов хлороформного и хлороформ-этанольного экстрактов представлена на рисунке 2. Их состав отличается. В хлороформ-этанольном экстракте обнаружено больше веществ этого класса соединений. Для проявления хроматограммы в одном случае применяли 20% раствор сульфата аммония, который является неспецифическим проявителем, позволяющим обнаружить все липидные вещества. В другом случае, хроматограмму проявляли 0,25% раствором нингидрина в бутаноле, а также анилинфталатным реактивом. Специфическое окрашивание пятен позволило подтвердить проведенное отнесение их к фосфати-дилэтаноламину и фосфатидилсерину, а также к цереброзидам. Можно предположить, что цереброзиды могут быть представлены фитосфингозидом, дигидросфингозином, или дегидросфингозином [6].
Проведено количественное определение биологически активных липидов, таких как стерины, гликолипиды и липиды, содержащие в своем составе первичную аминогруппу [6-8].
Как видно из данных, приведенных в таблице 1, наибольшее содержание определяемых липидов обнаружено в хлороформ-этанольном экстракте. Это может быть объяснено лучшей экстрактивной способностью этой смеси. Более высокое количество липидов, содержащих аминогруппу, по сравнению с гликолипидами, можно отнести за счет того, что в эту группу веществ входят фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и лизолецитин. Указанные соединения содержатся в хлороформ-этанольном экстракте в количестве 0,02% от сухих веществ водного извлечения чаги.
Выраженными биологическими свойствами обладают моно- и полиненасыщенные жирные кислоты. Проведен анализ жирнокислотного состава полученных экстрактов методом ГЖХ. По площадям пиков на хроматограммах определено процентное соотношение высших жирных кислот в объектах исследования. Полученные результаты приведены в таблице 2.
Таблица 1. Содержание липидов в экстрактах, полученных из водного извлечения чаги с помощью органических растворителей
Экстракт Стерины, %* Гликолипиды, %* Липиды, содержащие аминогруппу, %*
Петролейный 0,11 - -
Хлороформный 0,07 0,01 0,01
Хлороформ-этанольный 0,14 0,01 0,03
* в % от сухих веществ водного извлечения чаги.
8е9-
и
I •
9-0-^
Нг И* по [6] Отнесение
0,84-0,86 0,9-1,0 углеводороды, сквален
__ 0,79-0,81 0,85 воски, эфиры стеринов,
триалкиловые эфиры
глицерина
0,70; 0,73 0,70 о -диалкилмо н огл ице р иды
0,58; 0,57; 0,54 0,55 витамин К, высшие
алифатические альдегиды
0,42; 0,41; 0,38 0,30-0,40 триглицериды
0,30; 0,32; 0,31 0,25 ко фермент СЗ
0,21; 0,23 0,19 а-токофер ол
0,13; 0,14; 0,15 0,18 жирные кислоты
0,12; 0,12; 0,10 0,15 высшие алифатические
0,06; 0,08; 0,06 0,10 спирты
' 0,04; 0,02; 0,02 0,08 стерины
: 0,0; 0,0; 0,0 0,0 1,2- и 1,3 - диглицериды
мон оглицер иды,
1 -О-моноалкиловые
эфиры глицерина
Экстракты, полученные при обработке водного извлечения чаги: 1 - петролейным эфиром; 2 - хлороформом; 3 - смесью хлороформ - этанол (2 : 1)
Рис. 1. Хроматограмма нейтральных липидов
Экстракты, полученные при обработке водного извлечения чаги: 1 - хлороформом;
2 - смесью хлороформ - этанол (2 : 1)
Рис. 2. Хроматограмма полярных липидов
Наиболее разнообразен состав жирных кислот петролейного экстракта. В нем обнаружено 12 высших жирных кислот, из них три мононенасыщенные и две полиненасыщенные жирные кислоты. Содержание мононенасыщен-ных - пальмитиновой, олеиновой и эйкозеновой кислот составляет 58% от суммы обнаруженных жирных кислот.
Хлороформный и хлороформ-этанольный экстракты содержат в основном тридекановую кислоту. Кроме этого, их применение позволило обнаружить в водном извлечении чаги гептадекановую, стеариновую и ли-ноленовую кислоты.
Для петролейного экстракта определено кислотное число - 2,02 мг/г и число омыления - 6,88 мг/г. Используя эти значения и то, что в петролейном экстракте преобладает пальмитиновая кислота, рассчитали [9] процентное содержание свободных жирных кислот - 0,92% от сухого остатка экстракта. Соответственно, содержание высших жирных кислот в свободном или слабосвязанном состоянии составляет 0,2% от сухого остатка водного извлечения чаги. В свободном или слабосвязанном состоянии в водном извлечении чаги содержится 0,12%
мононенасыщенных и 0,02% полиненасыщенных жирных кислот. Йодное число для петролейного экстракта составляет 23,78 г/100 г, оно выше, чем йодное число подсолнечного масла - 10-15 г/100 г. Его высокое значение можно объяснить тем, что в экстракте, кроме ненасыщенных жирных кислот, присутствуют стерины (0,5%) и другие сопутствующие липидам вещества, имеющие кратные связи, такие, например, как терпены.
Проведенный анализ позволил установить, что в свободном или слабосвязанном состоянии в водном извлечении чаги находятся биологически активные липиды различных классов.
Таблица 2. Жирные кислоты, содержащиеся в экстрактах органических растворителей после обработки ими
водного извлечения чаги
Жирная кислота Петролейный экстракт Хлороформный экстракт Хлороформ-этанольный экстракт
Содержание жирной кислоты, %
Лауриновая (С12:0) следы - -
Тридекановая (С13:0) следы 90,50 86,26
Миристиновая (С14:0) следы - -
Пентадекановая (С15:0) 18,32 Следы -
Пальмитиновая (С16:1) 26,71 3,56 3,80
Гептадекановая (С17:0) следы 2,50 -
Стеариновая (С18:0) следы 1,72 -
Олеиновая (С18:1) 20,30 - 6,83
Линолевая (С18:2) 8,40 - 3,11
Линоленовая (С18:2) следы 1,72 -
Эйкозеновая (С20:1) 11,00 - -
Неидентифицированная 15,27 - -
Выводы
1. Максимальное количество липидов удается выделить из водного извлечения чаги петролейным эфиром, следовательно, в свободном и слабосвязанном состоянии в этой коллоидной системе больше нейтральных липидов, чем полярных.
2. Нейтральные липиды в водном извлечении чаги в свободном и слабосвязанном состоянии представлены биологически активными соединениями - стеринами и их эфирами, ненасыщенными жирными кислотами, витамином К и коферментом р. Содержание стеринов составляет 0,14% от сухого остатка водного извлечения чаги. Содержание мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот составляет 0,12 и 0,02% от сухого остатка водного извлечения чаги соответственно.
3. Определен состав жирных кислот, находящихся в коллоидной системе водного извлечения чаги в свободном и слабосвязанном состоянии.
4. Полярные липиды в водном извлечении чаги в свободном и слабосвязанном состоянии представлены такими биологически активными соединениями, как фосфо- и гликолипиды. Фосфатидилэтаноламина, фос-фатидилсерина и лизолецитина содержится в водном извлечении чаги 0,02%, гликолипидов - 0,01%.
Список литературы
1. Рыжова Г. Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В. и др. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С. 44-47.
2. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В. Характеристика древоразрушающих грибов по содержанию в них стероидных соединений // Кормовые белки и физиологически активные вещества для животноводства. М, Л., 1965. С. 59-64.
3. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вест-
ник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-179.
4. Юмаева Л.Р., Хабибрахманова В.Р., Сысоева М.А., Гамаюрова В.С. Извлечение липидов из водной вытяжки чаги // Пищевые технологии: мат. общерос. конф. Казань, 2006. С. 118-119.
5. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. М., 1989. 509 с.
6. Кейтс М. Техника липидологии. М., 1975. 324 с.
7. Полевой В.В. Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. 192 с.
8. Антипов Л.В. Физические методы контроля сырья и продуктов в мясной промышленности. СПб., 2006. 200 с.
9. Арутюнян Н.С. Лабораторный практикум по химии жиров. СПб., 2004. 264 с.
10. Степанов А.Е., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Физиологически активные липиды. М., 1991. 136 с.
Поступило в редакцию 21 августа 2007 г.
После переработки 4 сентября 2008 г.
