CC BY
2
© Коллектив авторов, 2023
Тимотиевич Е.Д.1, Шиловский И.П.1, Юмашев К.В.1, Ковчина В.И.1, Никольский А. А.1, Каганова М.М.1, 2, Русак Т.Е.1, 3, Андреев С.М.1, Смирнов В.В.1, Сергеев И.В.1, Маерле А.В.1, Кофиади И.А.1, Шатилов А.А.1, Шатилова А.В.1, Кудлай Д.А.1, 3, Хаитов М.Р.1, 4
Подавление репликации респираторно-синцитиального вируса in vitro комплексом молекул малых интерферирующих РНК и бифункционального пептида-носителя
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, 109472, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) - один из самых распространенных патогенов, поражающих верхние и нижние дыхательные пути. Один из перспективных подходов к созданию противовирусных препаратов - применение молекул малых интерферирующих РНК (миРНК), способных специфично блокировать экспрессию генов вируса. Еще один подход - применение природных и синтетических пептидов в качестве противовирусных средств. Примечательно, что пептиды могут обладать несколькими биологическими свойствами. Например, мы показали, что катионный дендримерный пептид LTP не только обладал противовирусными свойствами в отношении РСВ, но и был способен транспортировать нуклеиновые кислоты в эпителиальные клетки.
Цели данного исследования - создание комплекса бифункционального пептида LTP и молекул миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ, а также изучение противовирусных свойств этого комплекса in vitro.
Материал и методы. Оптимальное соотношение компонентов в комплексе миРНК/ пептид определяли с помощью трансфекции клеток эукариот. Токсическое воздействие комплекса на клетки изучали стандартным методом in vitro (МТТ-тест). Противовирусные свойства комплекса оценивали в модели РСВ-инфекции in vitro, вирусную нагрузку - с помощью титрования на монослое чувствительных клеток и количественного ПЦР-анализа.
Результаты. Показано, что оптимальным соотношением компонентов в комплексе миРНК/LTP является 1/12,5 по массе. При таком соотношении молекулы миРНК и пептида образуют наноструктуры диаметром 714 ± 125 нм, которые имеют положительный заряд 16,9 ± 6,71 мВ. Такие физико-химические характеристики позволяют комплексу проникать внутрь клеток. По итогам изучения цитотоксичности продемонстрировано, что комплекс и его отельные компоненты являются нецитотоксичными в концентрациях, оказывающих противовирусный эффект. При изучении противовирусных свойств in vitro показано, что комплекс миРНК/пептид обеспечивал более выраженное подавление репликации вируса в сравнении со свободным пептидом. Усиленный противовирусный эффект комплекса достигается за счет того, что пептид обладает собственными противовирусными свойствами и дополнительно транспортирует в зараженные клетки молекулы миРНК, блокирующие репликацию генома вируса.
Заключение. Комплекс бифункционального пептида LTP и молекул миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ, обеспечивает более выраженный противовирусный эффект по сравнению со свободным пептидом.
Для корреспонденции
Тимотиевич Екатерина Драгановна -младший научный сотрудник лаборатории противовирусного иммунитета
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ed0594@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Ключевые слова: респираторно-синцитиальный вирус; катионные пептиды; противовирусные пептиды; трансфекция; миРНК; РНК-интерференция
Статья поступила 30.05.2023. Принята в печать 05.07.2023.
Для цитирования: Тимотиевич Е.Д., Шиловский И.П., Юмашев К.В., Ковчина В.И., Никольский А. А., Кага-нова М.М., Русак Т.Е., Андреев С.М., Смирнов В.В., Сергеев И.В., Маерле А.В., Кофиади И.А., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Подавление репликации респираторно-синцитиального вируса in vitro комплексом молекул малых интерферирующих РНК и бифункционального пептида-носителя. Иммунология. 2022; 44 (5): 545-556. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-5-545-556
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда № 22-25-00182, https://rscf.ru/project/22-25-00182.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Шиловский И.П., Смирнов В.В., Хаитов М.Р.; сбор и обработка материала - Тимотиевич Е.Д., Никольский А. А., Ковчина В.И., Юмашев К.В., Каганова М.М., Русак Т.Е., Шатилов А.А., Шатилова А.В.; статистическая обработка - Андреев С.М., Кофиади И. А.; написание текста - Тимотиевич Е.Д., Шиловский И.П.; редактирование - Кудлай Д. А., Сергеев И.В., Маерле А.В.
Timotievich E.D.1, Shilovskiy I.P.1, Yumashev K.V.1, Kovchina V.I.1, Nikolskii A.A.1, Kaganova M.M.1 2, Rusak T.E.1 3, Andreev S.M.1, Smirnov V.V.1 3, Sergeev I.V.1, Maerle A.V.1, Kofiadi I.A.1, Shatilov A.A.1, Shatilova A.V.1, Kudlay D.A.1 3, Khaitov M.R.1 4
Suppression of respiratory syncytial virus infection in vitro by small interfering RNAs complexed with bifunctional peptide carrier
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA named after K.I. Skryabin of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation, 109472, Moscow, Russian Federation
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
4 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Respiratory syncytial virus (RSV) is one of the most common pathogens affecting the upper and lower respiratory tract. One of the promising approaches to the creation of antiviral drugs is the use of small interfering RNA (siRNA) molecules that can specifically block the expression of virus genes. Another approach is the use of natural and synthetic peptides as antiviral agents. Notably, peptides can possess several biological properties. For example, we showed that the cationic dendrimeric peptide LTP not only exhibited antiviral properties against RSV, but was also able to transport nucleic acids into epithelial cells.
The aims of this study were to create a complex of bifunctional peptide LTP and siRNA molecules directed against vital RSV genes and to study its antiviral properties in vitro.
Material and methods. The optimal ratio of the component in the siRNA/peptide complex was determined by eukaryotic cell transfection. The toxic effect of the complex on cells was studied by the standard in vitro method (MTT-test). The antiviral properties of the complex were evaluated in the in vitro model of RSV infection. Viral load was assessed by titration on a monolayer of sensitive cells and by quantitative PCR analysis.
Results. We have shown that the optimal ratio of components in the siRNA/LTP complex is 1/12.5 by weight. With this ratio siRNA and peptide molecules form nanostructures with a diameter of 714 ± 125 nm, which have a positive charge of 16.9 ± 6.71 mV Such physicochemical characteristics allow the complex to penetrate into cells. It was demonstrated that the complex and its individual components are non-cytotoxic in concentrations that have an antiviral effect. We showed that the siRNA/peptide complex provided a more pronounced suppression of virus replication compared to the free peptide. The enhanced antiviral effect
For correspondence
Timotievich Ekaterina Draganovna -Junior Researcher of the Antiviral Immunity Laboratory, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ed0594@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
of the complex is achieved due to the fact that the peptide has its own antiviral properties and additionally transports siRNA molecules blocking the replication of the virus genome into infected cells.
Conclusion. The complex of bifunctional LTP peptide and siRNA molecules directed against the vital RSV genes provides a more pronounced antiviral effect compared to peptide alone.
Keywords: respiratory syncytial virus; cationic peptides; antiviral peptides; transfection; siRNA; RNA-interference
Received 30.05.2023. Accepted 05.07.2023.
For citation: Timotievich E.D., Shilovskiy I.P., Yumashev K.V., Kovchina V.I., Nikolskii A.A., Kaganova M.M., Ru-sak T.E., Andreev S.M., Smirnov V.V., Sergeev I.V., Maerle A.V., Kofiadi I.A., Shatilov A.A., Shatilova A.V, Kud-lay D.A., Khaitov M.R. Suppression of respiratory syncytial virus infection in vitro by small interfering RNAs com-plexed with bifunctional peptide carrier. Immunologiya. 2023; 44 (5): 545-56. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-5-545-556 (in Russian)
Funding. The study was supported by Russian Science Foundation grant No. 22-25-00182, https://rscf.ru/pro-ject/22-25-00182.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors contribution. Study conception and design - Shilovskiy I.P., Smirnov V.V., Khaitov M.R.; material collection and processing - Timotievich E.D., Nikolskii A.A., Kovchina V.I., Yumashev K.V., Kaganova M.M., Rusak T.E., Shatilov A.A., Shatilova A.V.; statistical processing - Andreev S.M., Kofiadi I.A.; manuscript preparation - Timotievich E.D., Shilovskiy I.P.; editing - Kudlay D.A., Sergeev I.V., Maerle A.V.
Введение
Заболевания, вызываемые вирусными инфекциями дыхательных путей, занимают первое место по распространенности среди всех вирусных патологий. Один из самых распространенных патогенов - респираторно-синцитиальный вирус (РСВ). Он поражает верхние и нижние дыхательные пути, часто приводя к брон-хиолиту и/или пневмонии, особенно у детей. Ежегодно в мире госпитализируется до 3 млн детей, инфицированных РСВ, при этом смертность от этой инфекции составляет 66-199 тыс. в год [1]. Экономический ущерб от РСВ-инфекции (по данным в США) оценивается в 1,15 млрд долларов ежегодно [2]. Кроме того, РСВ является значимым триггером обострений бронхиальной астмы, что в некоторых случаях приводит к летальному исходу [3].
Попытки создать профилактическую вакцину оказались неудачными [4], а для терапии РСВ в настоящее время применяется виразол (рибавирин) [5], который вызывает многочисленные побочные эффекты [6]. Существует опыт применения средств против РСВ на основе нейтрализующих моноклональных антител (МкАт). Препараты паливизумаб (Synagis) и мотавизумаб уже используются в клинической практике. Продолжаются испытания других препаратов: ЮГУ (Respigam), МББГ-524 (№таЪ) [7-9]. Однако применение подобных препаратов ограничено высокой стоимостью.
Существует несколько перспективных подходов к созданию противовирусных препаратов. Один из них - применение молекул малых интерферирующих РНК (миРНК), которые специфически подавляют экспрессию вирусных генов по механизму РНК-интерференции [10], уменьшая репликацию вируса в инфицированной клетке.
Такой подход был реализован в препарате МИР 19® для лечения СОУГО-19. Этот препарат в качестве фарма-
цевтической субстанции содержит молекулы миРНК, направленные против участка генома, кодирующего фермент репликации вируса - РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp). Препарат прошел основные стадии доклинических [11] и клинических исследований [12], в которых были продемонстрированы его безопасность и эффективность. В настоящее время МИР 19® одобрен для медицинского применения в России. Все это свидетельствует об успешном применении данного подхода к созданию противовирусных препаратов.
Другой перспективный подход к созданию противовирусных средств - использование природных и синтетических пептидов [13]. Ранее нами было создано несколько синтетических пептидов с линейной и ден-дримерной (разветвленной) структурами, активных в отношении РСВ [14,15]. Стоит отметить дендри-мерный пептид LTP, богатый аргинином и лизином, который значительно (более чем в 100 раз) подавляет репликацию РСВ [14].
Примечательно, что пептидные соединения часто обладают сразу несколькими биологическими свойствами. В частности, многие антимикробные и противовирусные пептиды могут выступать в роли транспортных клеточно-проникающих пептидов, и наоборот. Например, для пептидов NYAD (линейный пептид, модифицированный углеводородным сшиванием, получен методом фагового дисплея) и LK-3 (синтетический пептид с большим содержанием остатков лейцина и лизина, димер, получен методом фагового дисплея) установлена активность против ВИЧ-1, для пептидов G1 и G2 (пептиды с высокой плотностью положительного заряда, G1 - с чередующимися зарядами, G2 -с повторяющимися зарядами) - против вируса простого герпеса 1 типа. Показано, что Deca-(Arg)8, являющийся синтетическим аналогом Tat-1, проявляет антивирусную активность в отношении вируса гепатита В [16].
Таблица 1. Последовательности смысловой (S) и антисмысловой (aS) цепей молекул миРНК
миРНК Цепь Последовательность
siN S UGCCUAUGGUGCAGGGCAAtt
aS UUGCCCUGCACCAUAGGCAtt
siP S GCAAGUGCAGGACCUACAUtt
aS AUGUAGGUCCUGCACUUGCtt
Нашим коллективом была доказана бифункцональ-ность пептида LTP, который не только подавляет РСВ-инфекцию [14], но и способен транспортировать молекулы миРНК в эпителиальные клетки респираторного тракта млекопитающих, являющихся местом локализации РСВ [17].
Наличие у одного пептида двух активностей (противовирусной и транспортной) открывает возможность для усиления его противовирусного эффекта. В частности, пептид можно объединить с противовирусной молекулой миРНК в комплекс, который будет обладать усиленными противовирусными свойствами.
Целями данного исследования были создание комплекса бифункционального пептида LTP и молекул миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ, а также изучение его противовирусных свойств in vitro.
Материал и методы
Молекулы миРНК и пептида. В предыдущих работах мы создали молекулы миРНК siN-745 и б1Р4, обозначенные в данной работе как siN и siP, против жизненно важных генов РСВ и подтвердили их противовирусные свойства в экспериментах in vitro и in vivo [18]. В качестве мишени были выбраны 2 гена вируса - n и p. Первый кодирует нуклеопротеин N, необходимый для предотвращения деградации геномной вирусной РНК в цитоплазме инфицированной клетки, второй кодирует фосфопротеин Р, являющийся субъединицей РНК-полимеразы, необходимой для репликации вируса [19, 20]. Последовательности миРНК представлены ниже (табл. 1).
В качестве носителя был выбран катионный дендри-мерный пептид LTP, который, как было показано ранее, способен транспортировать нуклеиновые кислоты, включая молекулы миРНК, в цитоплазму клеток млекопитающих [17, 21], а также обладает собственными противовирусными свойствами в отношении РСВ [14, 22].
Питательные среды, культуры клеток, штамм вируса. В работе использовали питательные среды Игла-МЕМ («ПанЭко», Россия) и DMEM (Gibco, США) с добавлением 25 мМ HEPES («ПанЭко», Россия), 300 мг/л L-глутамина («ПанЭко», Россия), 50 мкг/мл ген-тамицина (Gibco, США). Для получения полной питательной среды к вышеуказанному составу добавляли 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Филиппины). Среда Overlay: бессывороточная среда Игла-МЕМ/Б12 в соотношении 1 : 1 (600 мг/л L-глутамина,
50 мкг/мл гентамицина, 25 мМ HEPES, 8,8 мг/мл пирувата натрия, 120 мкг/мл бикарбоната натрия) и 0,6 % легкоплавкой агарозы в соотношении среда/агароза 1 : 1.
В работе использовали следующие клеточные линии: МА-104 (эмбриональная почка макака-резуса), HEp-2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека), HEK293Т (эмбриональная почка человека), ЛЭЧ (легкое эмбриона человека). Все клеточные линии были приобретены в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Респираторно-синцитиальный вирус штамм А2 был предоставлен ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Минобрнауки России.
Трансфекция клеток млекопитающих пептидом LTP. Подобрано оптимальное соотношение нуклеиновая кислота/пептид в составе комплекса. Для этого клетки HEK293Т трансфецировали комплексами, состоящими из плазмиды pGL3 (несет репортерный ген люциферазы светлячка) и LTP в различном массовом соотношении с последующим определением активности люциферазы в гомогенатах клеток. Были выбраны следующие соотношения нуклеиновая кислота/пептид по массе: 1/6,25; 1/12,5 и 1/25. Для трансфекции в 24-луночный планшет засевали 100 000 клеток ЖК293Т на лунку, инкубировали сутки, после чего к клеткам добавляли смесь, состоящую из 0,2 мкг pGL3 и LTP в 3 вариантах: 1,25 мкг (для соотношения 1/6,25); 2,5 мкг (для соотношения 1/12,5) и 5 мкг (для соотношения 1/25). Измерение уровней люминесценции производили с помощью коммерческого набора Bright-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, США) согласно инструкции. Данные представляли в виде RLU/100 000 клеток, где RLU - количество относительных световых единиц (RLU - relative light unit).
Определение размеров и заряда комплекса. Для
определения размеров и заряда комплекса использовали метод фотонной корреляционной спектроскопии (динамического светорассеяния). Измерение проводили на анализаторе Zetasizer Nano (Malvern Instruments Ltd, Великобритания). Комплекс миРНК/пептид был приготовлен в массовом соотношении 1/12,5. Измерение проводили в концентрациях: 1000, 500, 250 и 125 мкг/мл.
Оценка цитотоксичности. Цитотоксичность комплекса миРНК/пептид изучали с помощью МТТ-теста на клеточных линиях ЛЭЧ и HEp-2 в широком диапазоне концентраций. Для этого в 96-лучночный планшет засевали 15 000 клеток/лунку в объеме 100 мкл полной среды D МЕМ. На следующий день в лунки вносили комплекс пептида и миРНК. В качестве контроля вносили эквимолярные количества свободного пептида и свободных молекул миРНК. Через сутки в культуру клеток вносили 25 мкл раствора МТТ (AppliChem, США) (4 мг/мл) и инкубировали 4 ч. После чего клетки лизи-ровали раствором 20 % SDS (Thermo Fisher Scientific, США) на 0,02 н водном растворе H2SO4 (AppliChem, США). Далее измеряли оптическую плотность при длинах волн 570 и 650 нм и на основе этих данных
Таблица 2. Праймеры и зонд
Название праймера/зонда Последовательность
vRSV-G2-F ACACATAGCATTCATCAATCC
vRSV-G2-Z ROX CCTACCTCTTTACAACACCTCATTAACATCC RTQ2
vRSV-G2-R CAATGTTATTGTTAGTCTTGATATCC
рассчитывали значения CC50 (50 % цитотоксическая концентрация - концентрация тестируемого вещества, необходимая для гибели 50 % клеток).
Определение противовирусной активности. Противовирусную активность комплекса in vitro оценивали по уменьшению вирусной нагрузки на модели репликации РСВ. Для этого культуру клеток НЕр-2 в количестве 70 000 кл/лунку засевали в 24-луночный планшет в полной питательной среде DMEM и инкубировали до образования монослоя конфлюентностью 75 %. Далее заменяли среду на бессывороточную и вносили комплекс (siN + siP/LTP), состоящий из миРНК (siN и siP) и пептида LTP в соотношении 0,5/0,5/25 по массе, что соответствует соотношению 1/12,5 комплекса миРНК/ LTP. В качестве контроля вносили эквимолярные количества свободного пептида и свободных молекул миРНК. Испытывали различные концентрации комплекса: 50, 100 и 200 мкг/мл.
Комплекс и контрольные препараты инкубировали с клетками в течение 4 ч, после чего заменяли среду на свежую бессывороточную и осуществляли инфекцию клеток вирусом РСВ штамм А2 при MOI = 0,01 в течение 2 ч, а затем повторно обрабатывали клетки исследуемыми веществами.
В качестве положительного контроля вирус перед внесением в культуру клеток обрабатывали нейтрализующими МкАт против белка F (RSV Fusion Protein Antibody, MA1-7290, Invitrogen, США) в концентрации 1 мкг/мл в течение 1 ч. В качестве отрицательного контроля вместо комплекса с вирусом коинкубировали физиологический раствор соответствующего объема. Далее клетки инкубировали 6 сут при 37 °С, 5 % СО2, после чего отбирали супернатанты, а клетки лизиро-вали буфером из коммерческого набора Viral RNA Kit (Zymo Research, США).
Титрование вирус-содержащих супернатантов. Супернатанты титровали на монослое клеток МА-104. Для этого клетки МА-104 предварительно засевали в 96-луночный планшет в количестве 20 000 клеток/ лунку в 100 мкл полной среды Игла-МЕМ и инкубировали 24 ч. Непосредственно перед титрованием клетки промывали физиологическим раствором («ПанЭко», Россия) и заменяли среду на бессывороточную. Далее осуществляли десятичное титрование супернатантов с последующей инкубацией в течение 4 ч, после чего среду с вирусом заменяли на полную среду Игла-МЕМ. После инкубации в течение ночи и отмывки сывороточную среду Игла-МЕМ заменяли на среду Overlay. Клетки инкубировали в течение 6 сут при 37 °С, 5 % СО2 с последующей фиксацией 10 % формальдегидом и окрашиванием нейтральным красным. С помощью
световой микроскопии подсчитывали количество образовавшихся бляшек (кластеров слившихся клеток) в монослое клеток. Результаты титрования выражали в виде БОЕ/мл.
Количественный ПЦР-анализ. В лизатах клеток с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) определяли количество вирусной РНК (vRNA) в лизатах клеток. Для этого из лизатов выделяли общую РНК с использованием коммерческого набора Viral RNA Kit (Zymo Research, США). Концентрацию РНК определяли спектрофотомет-рически с помощью NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Обратную транскрипцию осуществляли с помощью набора ОТ-1 («Синтол», Россия) с использованием специфического праймера vRSV-G2-F (табл. 2). Для проведения ПЦР использовали амплификатор IQ5 (BioRad, США) и следующую температурную программу: 95 °С - 300 с, 60 °С - 20 с и 95 °С - 20 с (5 циклов), 60 °С - 20 с и 95 °С - 20 с (35 циклов). Для детекции геномной РНК вируса использовали пару праймеров и зонд, представленные ниже (см. табл. 2), направленные на межгенный участок в геноме вируса.
В результате количественного ПЦР-анализа получены значения порогового цикла, которые были пересчитаны в количество копий vRNA на 1 мкг общей РНК. Пересчет проводили с использованием ранее подготовленной калибровочной кривой, описывающей зависимость порогового цикла от количества копий матрицы.
Статистический анализ данных проводили с использованием программы Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Статистическую значимость различий оценивали при помощи непараметрического критерия Кра-скела-Уоллиса. Отличия принимались значимыми при р < 0,05.
Результаты
Трансфекционная активность пептида LTP и физико-химические характеристики комплекса миРНК/LTP
В наших предшествующих экспериментах было установлено, что массовое соотношение нуклеиновая кислота/пептид имеет значение для эффективности проникновения комплекса [17]. В экспериментах по транс-фекции клеток HEK293T мы продемонстрировали, что оптимальное соотношение комплекса нуклеиновая кислота/пептид составляет 1/12,5 по массе. Люминесценция лизатов клеток при трансфекции их комплексом pGL3/LTP в данном массовом соотношении составило 191 ± 11 млн RLU/100 000 клеток (рис. 1). При этом про-
200 000 000
§ 150 000 000
¡с
0 0
о 100 000 000 0
RL50 000 000
0
Рис. 1. Эффективность трансфекции клеток HEK293T комплексом плазмиды pGL3 и пептида LTP
Была осуществлена трансфекция культуры клеток HEK293T комплексам pGL3/LTP в различных массовых соотношениях. Через сутки после трансфекции оценена интенсивность люминесценции лизатов клеток. Данные выражены в виде относительных световых единиц - RLU (relative light units) на 100 000 клеток. N = 3.
исходило снижение трансфекционной активности комплекса при массовом соотношении 1/6,25 и 1/25 (125 ± 9 и 21 ± 13 млн RLU/100 000 клеток).
Нуклеиновые кислоты, включая молекулы миРНК, имеют отрицательный заряд, в то время как пептид LTP -положительный. За счет разноименных зарядов миРНК и пептид взаимодействуют и формируют наноструктуры. Методом светодинамического рассеяния мы показали, что комплекс миРНК/LTP в массовом соотношении 1/12,5 формирует наноструктуры диаметром 714 ± 125 нм, которые имеют положительный заряд 16,9 ± 6,71 мВ.
Изучение цитотоксичности комплекса миРНК/LTP
Ранее продемонстрирована низкая токсичность пептида LTP и хорошие уровни его интернализации в клетки млекопитающих [14, 17]. В данном исследовании определены цитотоксические концентрации комплекса миРНК/пептид в сравнении с его компонентами на двух клеточных линиях. В результате тестирования выявлено, что СС50 на клетках ЛЭЧ для свободного пептида составляет 370 ± 150 мкг/мл, для комплекса миРНК/пептид на этой же клеточной линии -740 ± 180 мкг/мл, а для молекул миРНК - выше 160 мкг/мл. На культуре клеток HEp-2 СС50 для LTP составляет 400 ± 10 мкг/мл, для комплекса миРНК/ пептид - 510 ± 30 мкг/мл, для миРНК - выше 40 мкг/мл (рис. 2).
Противовирусная активность комплекса миРНК/пептид
Противовирусные свойства комплекса изучали в нетоксических концентрациях. В ходе эксперимента подтвердился противовирусный эффект пептида LTP, установленный ранее [14, 22]. На 6-е сутки после инфекции в супернатантах клеток, обработанных тремя концентрациями LTP (50, 100 и 200 мкг/мл), количество синцитиев снижалось до уровня положительного контроля (МкАт). Общее количество синцитиев после обработки пептидом в концентрации 200 мкг/мл составило 591 ± 354 БОЕ/мл, что в 23 раза ниже, чем в отрицательном контроле (0 мкг/мл), и в 1,8 раза ниже, чем в положительном контроле (МкАт). Количество синцитиев в необработанных клетках составило 8092 ± 573 БОЕ/мл, а в обработанных МкАт - 1072 ± 769 БОЕ/мл.
Наибольшим противовирусным эффектом обладал комплекс siN+siP/LTP, который дозозависимо снижал
-
6,25 12,50 25,00
Избыток пептида LTP по отношению к плазмиде pGL3 в комплексе
ЛЭЧ
HEp-2
100 -
50 -
0
LTP 0,00 siN+siP 0 siN+siP/LTP 0
100
50
С, мг/мл -¿-LTP ^-siN+siP
■ siN+siP/LTP
0,50 1,00 2,00 LTP 0 0,08 0,16 0,32 0,63 0,13 0,25 0,5
0,04 0,06 0,16 siN+siP 0 0,0006 0,001 0,02 0,05 0,01 0,02 0,04
0,54 1,06 2,16 siN+siP/LTP 0 0,0806 0,161 0,34 0,68 0,14 0,27 0,54
С, мг/мл
-¿-LTP siN+siP siN+siP/LTP Рис. 2. Изучение цитотоксичности комплекса siN+siP/LTP
Цитотоксичность комплекса в сравнении с индивидуальными компонентами (пептидом LTP и молекулами миРНК) изучалась при помощи стандартного МТТ-теста на культурах клеток ЛЭЧ (легкие эмбриона человека) и НЕр-2 (карцинома гортани человека). Представлены относительные данные в %. За 100 % принимали значения оптической плотности (ОП) лизатов клеток без добавления тестируемых веществ (0 мг/мл). ОП измеряли при длинах волн 570 и 650 нм (референтная длина волны). Статистический анализ проводился с использованием критерия Краскела-Уоллиса. N = 5. Отличия принимаются значимыми при р < 0,05. * - статистически значимо отличается от «siN+siP».
0
э
50 000
5000 -
-
S
Еа
§ 500
50 -
5E11
5E10 -
5E9 -
5E8
LTP 0 50 100 200 LTP 0 50 100 200
siN+siP 0 4 8 16 siN+siP 0 4 8 16
siN+siP/LTP 0 54 108 216 siN+siP/LTP 0 54 108 216
С, мкг/мл
-¿-LTP -ф-siN+siP -J-siN+siP/LTP -Q-МкАт
С, мкг/мл
-¿-LTP siN+siP -J-siN+siP/LTP -Q-МкАт
Рис. 3. Противовирусная активность комплекса siN+siP/LTP in vitro
Оценивали противовирусную активность комплекса в культуре клеток НЕр-2, для чего их обрабатывали различными концентрациями комплекса и индивидуальными компонентами (пептидом LTP и молекулами миРНК) с последующим заражением. Через 6 сут после инфекции оценивали вирусную нагрузку методом титрования супернатантов клеток (А) и методом количественного ПЦР-анализа (Б). Данные выражали в виде количества бляшкообразующих единиц в миллилитре супернатанта (БОЕ/мл) и количества копий вирусной РНК (vRNA) в 1 мкг общей РНК. Статистический анализ проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса. N = 7. Отличия принимаются значимыми прир < 0,05. * - статистически значимо отличается от «siN+siP».
вирусную нагрузку во всех протестированных концентрациях, а в концентрациях 108 и 216 мкг/мл проявлял значительно более выраженные противовирусные свойства, чем МкАт и свободный пептид. Количество синцитиев при обработке клеток комплексом в концентрации 200 мкг/мл на 6-й день инкубации составило 67 ± 50 БОЕ/мл, что в 200 раз ниже в сравнении с отрицательным контролем (0 мкг/мл) и в 18 раз ниже, чем в положительном контроле (МкАт) (рис. 3).
Противовирусная активность пептида также была подтверждена методом количественной ПЦР. Количество копий vRNA было статистически значимо ниже (в ~ 37 раз) в сравнении с отрицательным контролем и в 5 раз в сравнении с положительным контролем. При этом противовирусный эффект комплекса siN+P/ LTP был более выражен; комплекс уменьшал количество копий vRNA в 67 раз в сравнении с отрицательным контролем и в 11 раз в сравнении с положительным контролем (см. рис. 3).
Обсуждение
В предшествующих исследованиях мы продемонстрировали, что дендримерный (разветвленный) пептид LTP обладает двумя биологическими свойствами: противовирусным и транспортным [14, 17]. В данной работе мы попытались ответить на вопрос: будут ли усиливаться противовирусные свойства пептида, если при помощи его дополнительно доставлять внутрь клетки противовирусные молекулы миРНК?
Исходя из данных литературы [14], пептид LTP обладает высокой плотностью положительного заряда, благодаря чему оказывает прямое дестабилизирующее
действие на оболочку РСВ, что приводит к снижению жизнеспособности вируса. Кроме того, этот пептид способен взаимодействовать с рецептором вируса - белком нуклеолином, ингибируя инфекционный процесс. Благодаря своему положительному заряду, LTP способен взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и транспортировать их в цитоплазму клеток млекопитающих [17].
Проведя серию экспериментов in vitro, мы показали, что комплекс миРНК/пептид (siN+siP/LTP) имеет более выраженные противовирусные свойства в сравнении со свободным пептидом, тогда как «голые» миРНК не оказывали эффекта на репликацию РСВ (см. рис. 3). Усиленный противовирусный эффект комплекса достигается за счет того, что пептид обладает собственными противовирусными свойствами, предотвращая ранние стадии инфекции (слияние вируса с клеткой), а также транспортирует в зараженные клетки молекулы миРНК, которые при помощи механизма РНК-интерференции блокируют поздние стадии инфекции (подавляют трансляцию вирусной мРНК).
Известно, что нуклеиновые кислоты обладают отрицательным зарядом, вследствие чего не способны самопроизвольно проникать в цитоплазму клеток. Поэтому для их доставки применяют различные положительно заряженные векторы (липосомы, полимеры, наночастицы и пептиды) [23]. При этом для формирования комплекса используют избыток носителя, чтобы обеспечить суммарный положительный заряд комплекса - это необходимо для его проникновения внутрь клетки.
Используемый в данной работе пептид LTP обладает положительным зарядом, способен электроста-
тически взаимодействовать с миРНК и формировать наноструктуры, которые путем эндоцитоза проникают в цитоплазму клетки. В наших предшествующих экспериментах было установлено, что соотношение нуклеиновая кислота/пептид имеет значение для эффективности проникновения комплекса [17]. Мы продемонстрировали, что оптимальное соотношение нуклеиновая кислота/LTP составляет 1/12,5 по массе (см. рис. 1). При таком соотношении комплекс миРНК/LTP формирует наноструктуры диаметром 714 ± 125 нм, которые имеют положительный заряд 16,9 ± 6,71 мВ. Такой размер и заряд позволяют комплексу успешно проникать внутрь клеток. Уменьшение или увеличение массовой доли пептида в комплексе (1/6,25 или 1/25) снижает его способность транспортировать нуклеиновые кислоты в клетки (см. рис. 1).
Ранее нами было показано, что пептид LTP характеризуется низкой токсичностью и способен успешно проникать в клетки, перенося молекулы нуклеиновых кислот [14, 17]. Мы изучили цитотоксичность комплекса на культурах эпителиальных клеток человека (НЕр-2 и ЛЭЧ). Продемонстрировано, что в концентрациях, оказывающих противовирусный эффект, комплекс не проявлял цитотоксичности в отношении клеток млекопитающих.
Также ранее мы показали, что одновременное применение двух молекул миРНК против генов p и n оказывало аддитивный противовирусный эффект в сравнении с применением индивидуальных миРНК [24]. Данный эффект, возможно, связан с тем, что гены p и n играют разную роль в жизненном цикле вируса. Ген p кодирует фермент, участвующий в репликации, ген n - нуклеопро-теин, защищающий геном вируса от деградации. Таким образом, подавляя разные стадии жизненного цикла вируса (стадию репликации генома и процесс его упаковки), мы наблюдали усиленный (аддитивный) противовирусный эффект. Учитывая это, для создания комплекса с пептидом-носителем LTP мы использовали обе молекулы миРНК.
Известен лекарственный препарат ALN-RSV01, производства Alnylam Pharmaceuticals (США), который прошел фазу IIb клинических испытаний [25-27]. Действующим веществом в данном препарате является миРНК против гена n РСВ. Проведенные авторами исследования показали, что несмотря на высокую консервативность гена n, в 9 % случаев участок гена, к которому направлен препарат ALN-RSV01, несет мутации,
нивелирующие противовирусный эффект. Таким образом, применение двух молекул миРНК, направленных к двум различным генам РСВ, более оправдано не только с точки зрения большей активности, но и с точки зрения уменьшения вероятности ухода вируса от действия препарата за счет появления мутаций.
Кроме того, в препарате ALN-RSV01 отсутствовал носитель для молекул миРНК, что, скорее всего, негативно отражалось на его эффективности, так как для достижения клинического эффекта требовалось применять большие дозы препарата (до 0,6 мг/кг) [28]. Мы продемонстрировали, что молекулы миРНК без пептидного носителя не оказывают противовирусного эффекта in vitro, в то время как их комплекс с пептидом-носителем демонстрирует выраженный противовирусный эффект в эквимолярных концентрациях (см. рис. 3).
Недавно в России был зарегистрирован препарат МИР 19® (siR-7-EM/KK-46) для лечения COVID-19. Этот препарат представляет собой электростатический комплекс молекул миРНК против жизненно важного гена SARS-CoV-2 и катионного пептида-носителя КК-46 [11, 12]. Поскольку, в отличие от препарата ALN-RSV01, в составе МИР 19® используется пептидный носитель, для достижения клинического эффекта потребовалась значительно меньшая его доза. По данным клинических исследований, суточная доза составила 3,7 мг (0,053 мг/кг) комплекса siR-7-EM/KK-46, что соответствовало 0,176 мг (0,003 мг/кг) молекул миРНК, содержащихся в нем. Это существенно ниже по сравнению с эффективной дозой для препарата ALN-RSV01 (0,053 мг/кг против 0,6 мг/кг) [12]. При проведении доклинических исследований в экспериментах in vitro и in vivo было показано, что пептид КК-46 не проявлял противовирусных свойств по отношению к SARS-CoV-2, а выступал лишь в роли носителя для миРНК [11]. В данной работе мы продемонстрировали, что использование в качестве носителя пептида, который обладает собственными противовирусными свойствами, может значительно усилить противовирусный эффект комплексов миРНК/пептид.
Таким образом, комплекс бифункционального пептида LTP и молекул миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ, обеспечивает более выраженный противовирусный эффект по сравнению со свободным пептидом в исследованном диапазоне концентраций.
■ Литература
1. Shi T., McAllister D.A., O'Brien K.L., Simoes E.F., Madhi S.A., Gessner B.D., Polack F.P., Balsells E., Acacio S., Aguayo C., Alas-sani I., Ali A., Antonio M., Awasthi S., Awori J.O., Azziz-Baumgart-ner E., Baggett H.C., Baillie V.L., Balmaseda A. et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 2017; 390 (10098): 946-58. DOI:10.1016/S0140-6736(17)30938-8.
2. Halasa N.B., Williams J.V., Wilson G.J., Walsh W. F., Schaffner W., Wright P. F. Medical and economic impact of a respiratory syncytial virus
outbreak in a neonatal intensive care unit. Pediatric Infectious Disease Journal. 2005; 24 (12): 1040-4. D01:10.1097/01.inf.0000190027.59795.ac.
3. Watson A., Wilkinson T.A. Respiratory viral infections in the elderly. Ther Adv Respir Dis. 2021; 15: 1-17. D0I:10.1177/1753466621995050
4. Muralidharan A., Li C., Wang L., Li X. Immunopathogenesis associated with formaldehyde-inactivated RSV vaccine in preclinical and clinical studies. 2016; 16 (4): 351-60. D0I:10.1080/14760584.2017.1260452.
5. Tejada S., Martinez-Reviejo R., Karakoc H.N., Pena-Lopez Y., Manuel O., Rello J. Ribavirin for Treatment of Subjects with Respiratory Syncytial Virus-Related Infection: A Systematic Review and Meta-Anal-
ysis. Advances in Therapy. 2022; 39 (9): 4037-51. D01:10.1007/s12325-022-02256-5.
6. Janai H.K., Marks M.I., Zaleska M., Stutman H.R. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr Infect Dis J. 1990; 9 (3): 209-11. PMID: 2139930.
7. Paton J. To Palivizumab or not to Palivizumab - that is the question. Paediatric Respiratory Reviews. 2013; 14 (2): 126-7. D0I:10.1016/ j.prrv.2012.12.004.
8. Yang C.F., Wang C.K., Malkin E., Schickli J.H., Shambaugh C., Zuo F., Galinski M.S., Dubovsky F., Tang R.S. Implication of respiratory syncytial virus (RSV) F transgene sequence heterogeneity observed in Phase 1 evaluation of MEDI-534, a live attenuated parainfluenza type 3 vectored RSV vaccine. Vaccine. 2013; 31 (26): 2822-7. D0I:10.1016/j.vaccine.2013.04.006.
9. Huang K., Incognito L., Cheng X., Ulbrandt N.D., Wu H. Respiratory Syncytial Virus-Neutralizing Monoclonal Antibodies Motavi-zumab and Palivizumab Inhibit Fusion. J Virol. 2010; 84 (16): 8132-40. D0I:10.1128/JVI.02699-09.
10. Hannon G.J. RNA interference. Nature. 2002; 418 (6894): 244-51. DOI: 10.1038/418244a.
11. Khaitov M., Nikonova A., Shilovskiy I., Kozhikhova K., Kofiadi I., Vishnyakova L., Nikolsky A., Gattinger P., Kovchina V., Barvinskaya E., Yumashev K., Smirnov V., Maerle A., Kozlov I., Shatilov A., Timofeeva A., Andreev S., Koloskova O., Kuznetsova N., Vasina D., Nikiforova M., Rybalkin S., Sergeev I., Trofimov D., Martynov A., Berzin I., Gushchin V., Kovalchuk A., Borisevich S., Valenta R., Khaitov R., Skvortsova V. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14850
12. Khaitov M., Nikonova A., Kofiadi I., Shilovskiy I. Smirnov V., Elisytina O., Maerle A., Shatilov A., Shatilova A., Andreev S., Sergeev I., Trofimov D., Latysheva T., Ilyna N., Martynov A., Rabdano S., Ruzanova E., Savelev N., Pletiukhina I., Safi A., Ratnikov A., Gorelov V., Kaschenko V., Kucherenko N., Umarova I., Moskaleva S., Fabrichnikov S., Zuev O., Pavlov N., Kruchko D., Berzin I., Goryachev D., Merkulov V., Shipulin G., Udin S., Trukhin V., Valenta R., Skvortsova V. Treatment of COVID-19 patients with a SARS-CoV-2-specific siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2023; 78 (6): 1639-53. DOI:10.1111/all.15663.
13. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Nikol-skii A.A., Khaitov M.R. Prospects for the Use of Peptides against Respiratory Syncytial Virus. Mol Biol. 2019; 53 (4): 484-500. DOI:10.1134/ S002689841904013X.
14. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva A.V., Turetskiy E.A., Vishniakova L.I., Nikolskii A.A., Barvinskaya E.D., Karthikeyan S., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Andreev S.M., Khaitov M.R. Linear and dendrimeric antiviral peptides: design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J Mater Chem B. 2020; 8 (13): 2607-17. DOI:10.1039/c9tb02485a.
15. Шиловский И.П., Юмашев К.В., Вишнякова Л.И., Смирнов В.В., Гудима Г.О., Брылина В.Е., Каганова М.М., Никольский А. А., Тимотиевич Е.Д., Ковчина В.И., Русак Т.Е., Шатилова А.В., Шатилов А.А., Андреев С.М., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Синтетический пептид, имитирующий антигенный сайт белка F, подавляет инфекцию респираторно-синцитиального вируса в экспериментах in vitro. Иммунология. 2023; 44 (2): 134-46. DOI:10.33029/0206-4952-2023-44-2-134-146.
16. Parn K., Eriste E., Langel Ü. The Antimicrobial and Antiviral Applications of Cell-Penetrating Peptides. Cell-Penetrating Peptides. 2015; 1324: 223-45. DOI:10.1007/978-1-4939-2806-4_15.
17. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V. Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V., Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org Biomol Chem. 2018; 16 (43): 8181-90. D01:10.1039/c8ob02039f.
18. Шиловский И.П., Мазуров Д.В., Хаитов М.Р. Разработка векторных конструкций для сайленсинга Р-гена респираторного синтициального вируса. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2010; 4: 11-6.
19. Hacking D., Hull J. Respiratory syncytial virus - Viral biology and the host response. Journal of Infection. 2002; 45 (1): 18-24. D0I:10.1053/ jinf.2002.1015.
20. Van Drunen Littel-Van Den Hurk S., Watkiss E.R. Pathogenesis of respiratory syncytial virus. Current Opinion in Virology. 2012; 2 (3): 300-5. D0I:10.1016/j.coviro.2012.01.008.
21. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N. Kamyshnikov O.Y., Babakhin A.A., Zverev V.V, Johnston S.L., Khai-tov R.M. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum Gene Ther. 2014; 25 (7): 642-50. D0I:10.1089/hum.2013.142.
22. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Barvin-skaia E.D. Nikolskii A.A., Khaitov R.M., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Dendrimeric peptide LTP exhibits potent antiviral properties against respiratory syncytial virus. Allergy. 2019; 74 (S106): 1544.
23. Koloskova O.O., Nosova A.S., Sebyakin Y.L., Ilyukhina A.A. Shilovskiy I.P., Khaitov M.R. Liposomal siRNA delivery systems (Review). Russian Journal of Biopharmaceuticals. 2017; 9 (5): 3-10.
24. Шиловский И.П., Башкатова Ю.Н., Мазуров Д.В., Файзу-лоев Е.Б., Хаитов М.Р. Лентивирусная система доставки shRNA обеспечивает подавление репликации РСВ in vitro посредством активации механизма интерференции РНК. Иммунология. 2011; 32(1): 6-11.
25. DeVincenzo J., Cehelsky J.E., Alvarez R., Elbashir S., Harborth J., Toudjarska I., Nechev L., Murugaiah V., Vliet A.V., Vaishnaw A.K., Meyers R. Evaluation of the safety, tolerability and pharmacokinetics of ALN-RSV01, a novel RNAi antiviral therapeutic directed against respiratory syncytial virus (RSV). Antiviral Res. 2008; 77 (3): 225-31. DOI:10.1016/j.antiviral.2007.11.009.
26. DeVincenzo J., Lambkin-Williams R., Wilkinson T., Cehelsky J., Nochur S., Walsh E., Meyers R., Gollob J., Vaishnaw A. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010; 107 (19): 8800-5. DOI:10.1073/pnas.0912186107.
27. Simon A., Glanville A., Zamora M., Hodges T., Arcasoy S., Musk M., Sommerwerck U., DeVincenzo J., Karsten V., Shah S., Cehelsky J., Nochur S., Gollob J., Vaishnaw A., Gottlieb J. Results of a phase 2b multi-center, randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi therapeutic, ALN-RSV01, in respiratory syncytial virus (RSV)-infected lung transplant patients. European respiratory journal. 2012; 40: 1-17.
28. Gottlieb J., Zamora M.R., Hodges T., Musk A.W., Sommerwerk U., Dilling D., Arcasoy S., DeVincenzo J., Karsten V., Shah S., Bettencourt B.R., Cehelsky J., Nochur S., Gollob J., Vaishnaw A., Simon A.R., Glanville A.R. ALN-RSV01 for Prevention of Bronchiolitis Obliterans Syndrome after Respiratory Syncytial Virus Infection in Lung Transplant Recipients. The Journal of Heart and Lung Transplantation 2016; 35 (2): 213-21. DOI:10.1016/J.HEALUN.2015.08.012.
■ References
1. Shi T., McAllister D.A., O'Brien K.L., Simoes E.F., Madhi S.A., Gessner B.D., Polack F.P., Balsells E., Acacio S., Aguayo C., Alassani I., Ali A., Antonio M., Awasthi S., Awori J.O., Azziz-Baumgartner E., Baggett H.C., Baillie V.L., Balmaseda A. et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 2017; 390 (10098): 946-58. DOI:10.1016/S0140-6736(17)30938-8.
2. Halasa N.B., Williams J.V., Wilson G.J., Walsh W. F., Schaffner W., Wright P. F. Medical and economic impact of a respiratory syncytial virus outbreak in a neonatal intensive care unit. Pediatric Infectious Disease Journal. 2005; 24 (12): 1040-4. D0I:10.1097/01.inf.0000190027.59795.ac.
3. Watson A., Wilkinson T.A. Respiratory viral infections in the elderly. Ther Adv Respir Dis. 2021; 15: 1-17. D0I:10.1177/1753466621995050
4. Muralidharan A., Li C., Wang L., Li X. Immunopathogenesis associated with formaldehyde-inactivated RSV vaccine in preclinical and clinical studies. 2016; 16 (4): 351-60. D0I:10.1080/14760584.2017.1260452.
5. Tejada S., Martinez-Reviejo R., Karakoc H.N., Pena-Lopez Y., Manuel O., Rello J. Ribavirin for Treatment of Subjects with Respiratory Syncytial Virus-Related Infection: A Systematic Review and Meta-Analy-sis. Advances in Therapy. 2022; 39 (9): 4037-51. DOI:10.1007/s12325-022-02256-5.
6. Janai H.K., Marks M.I., Zaleska M., Stutman H.R. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr Infect Dis J. 1990; 9 (3): 209-11. PMID: 2139930.
7. Paton J. To Palivizumab or not to Palivizumab - that is the question. Paediatric Respiratory Reviews. 2013; 14 (2): 126-7. DOI:10.1016/j. prrv.2012.12.004.
8. Yang C.F., Wang C.K., Malkin E., Schickli J.H., Shambaugh C., Zuo F., Galinski M.S., Dubovsky F., Tang R.S. Implication of respiratory syncytial virus (RSV) F transgene sequence heterogeneity observed in Phase 1 evaluation of MEDI-534, a live attenuated parainfluenza type 3 vectored RSV vaccine. Vaccine. 2013; 31 (26): 2822-7. D0I:10.1016/ j.vaccine.2013.04.006.
9. Huang K., Incognito L., Cheng X., Ulbrandt N.D., Wu H. Respiratory Syncytial Virus-Neutralizing Monoclonal Antibodies Motavi-zumab and Palivizumab Inhibit Fusion. J Virol. 2010; 84 (16): 8132-40. D0I:10.1128/JVI.02699-09.
10. Hannon G.J. RNA interference. Nature. 2002; 418 (6894): 244-51. DOI: 10.1038/418244a.
11. Khaitov M., Nikonova A., Shilovskiy I., Kozhikhova K., Kofi-adi I., Vishnyakova L., Nikolsky A., Gattinger P., Kovchina V., Barvin-skaya E., Yumashev K., Smirnov V., Maerle A., Kozlov I., Shatilov A., Timofeeva A., Andreev S., Koloskova O., Kuznetsova N., Vasina D., Niki-forova M., Rybalkin S., Sergeev I., Trofimov D., Martynov A., Berzin I., Gushchin V., Kovalchuk A., Borisevich S., Valenta R., Khaitov R., Skvortsova V. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://doi. org/10.1111/all.14850
12. Khaitov M., Nikonova A., Kofiadi I., Shilovskiy I. Smirnov V., Elisytina O., Maerle A., Shatilov A., Shatilova A., Andreev S., Sergeev I., Trofimov D., Latysheva T., Ilyna N., Martynov A., Rabdano S., Ruzanova E., Savelev N., Pletiukhina I., Safi A., Ratnikov A., Gorelov V., Kaschenko V., Kucherenko N., Umarova I., Moskaleva S., Fabrichnikov S., Zuev O., Pavlov N., Kruchko D., Berzin I., Goryachev D., Merkulov V., Shipulin G., Udin S., Trukhin V., Valenta R., Skvortsova V. Treatment of COVID-19 patients with a SARS-CoV-2-specific siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2023; 78 (6): 1639-53. DOI:10.1111/all.15663.
13. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Nikol-skii A.A., Khaitov M.R. Prospects for the Use of Peptides against Respiratory Syncytial Virus. Mol Biol. 2019; 53 (4): 484-500. DOI:10.1134/ S002689841904013X.
14. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva A.V., Turetskiy E.A., Vishniakova L.I., Nikolskii A.A., Barvinskaya E.D., Karthikeyan S., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Andreev S.M., Khaitov M.R. Linear and dendrimeric antiviral peptides: design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J Mater Chem B. 2020; 8 (13): 2607-17. DOI:10.1039/c9tb02485a.
15. Shilovskiy I.P., Yumashev K.V., Kozhikhova K.V., Vishnya-kova L.I., Smirnov V.V., Gudima G.O., Brylina V.E., Kaganova M.M., Nikolsky A.A., Timotievich E.D., Kovchina V.I., Rusak T.E., Shati-lova A.V., Shatilov A.A., Andreev S.M., Kudlay D.A., Khaitov M.R. A synthetic peptide that mimics the antigenic site of F protein suppresses respiratory syncytial virus infection in experiments in vitro. Immunologiya. 2023; 44 (2): 134-46. DOI:10.33029/0206-4952-2023-44-2-134-146. (in Russian)
16. Pärn K., Eriste E., Langel Ü. The Antimicrobial and Antiviral Applications of Cell-Penetrating Peptides. Cell-Penetrating Peptides. 2015; 1324: 223-45. DOI:10.1007/978-1-4939-2806-4_15.
17. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V. Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V., Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently
Сведения об авторах
Тимотиевич Екатерина Драгановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ed0594@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Шиловский Игорь Петрович - д-р биол. наук, зам. директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
facilitates transfection of mammalian cells. Org Biomol Chem. 2018; 16 (43): 8181-90. D01:10.1039/c8ob02039f.
18. Shilovskiy I.P., Mazurov D.V., Khaitov M.R. Development of vector constructs for respiratory syncytial virus P-gene silencing. Pathological physiology and experimental therapy. 2010; 4: 11-6. (in Russian)
19. Hacking D., Hull J. Respiratory syncytial virus - Viral biology and the host response. Journal of Infection. 2002; 45 (1): 18-24. D0I:10.1053/ jinf.2002.1015.
20. Van Drunen Littel-Van Den Hurk S., Watkiss E.R. Pathogenesis of respiratory syncytial virus. Current Opinion in Virology. 2012; 2 (3): 300-5. D0I:10.1016/j.coviro.2012.01.008.
21. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N. Kamyshnikov O.Y., Babakhin A.A., Zverev V.V, Johnston S.L., Khaitov R.M. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum Gene Ther. 2014; 25 (7): 642-50. D0I:10.1089/hum.2013.142.
22. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Barvin-skaia E.D. Nikolskii A.A., Khaitov R.M., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Dendrimeric peptide LTP exhibits potent antiviral properties against respiratory syncytial virus. Allergy. 2019; 74 (S106): 1544.
23. Koloskova O.O., Nosova A.S., Sebyakin Y.L., Ilyukhina A.A. Shilovskiy I.P., Khaitov M.R. Liposomal siRNA delivery systems (Review). Russian Journal of Biopharmaceuticals. 2017; 9 (5): 3-10.
24. Shilovskiy I.P., Bashkatova Yu.N., Mazurov D.V., Faizuloev E.B., Khaitov M.R. A Lentiviral system for shRNA delivery ensures in vitro suppression of RSV replication by activation of the mechanism of RNA interference. Immunologiya. 2011; 32(1): 6-11. (in Russian)
25. DeVincenzo J., Cehelsky J.E., Alvarez R., Elbashir S., Harborth J., Toudjarska I., Nechev L., Murugaiah V., Vliet A.V., Vaishnaw A.K., Meyers R. Evaluation of the safety, tolerability and pharmacokinetics of ALN-RSV01, a novel RNAi antiviral therapeutic directed against respiratory syncytial virus (RSV). Antiviral Res. 2008; 77 (3): 225-31. DOI:10.1016/j.antiviral.2007.11.009.
26. DeVincenzo J., Lambkin-Williams R., Wilkinson T., Cehelsky J., Nochur S., Walsh E., Meyers R., Gollob J., Vaishnaw A. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010; 107 (19): 8800-5. DOI:10.1073/pnas.0912186107.
27. Simon A., Glanville A., Zamora M., Hodges T., Arcasoy S., Musk M., Sommerwerck U., DeVincenzo J., Karsten V., Shah S., Cehel-sky J., Nochur S., Gollob J., Vaishnaw A., Gottlieb J. Results of a phase 2b multi-center, randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi therapeutic, ALN-RSV01, in respiratory syncytial virus (RSV)-infected lung transplant patients. European respiratory journal. 2012; 40: 1-17.
28. Gottlieb J., Zamora M.R., Hodges T., Musk A.W., Sommerwerk U., Dilling D., Arcasoy S., DeVincenzo J., Karsten V., Shah S., Bettencourt B.R., Cehelsky J., Nochur S., Gollob J., Vaishnaw A., Simon A.R., Glanville A.R. ALN-RSV01 for Prevention of Bronchiolitis Obliterans Syndrome after Respiratory Syncytial Virus Infection in Lung Transplant Recipients. The Journal of Heart and Lung Transplantation 2016; 35 (2): 213-21. DOI:10.1016/J.HEALUN.2015.08.012.
Authors' information
Ekaterina D. Timotievich - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ed0594@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Igor P. Shilovskiy - Dr. Sci, PhD, Deputy Director on Science and Innovation, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Юмашев Кирилл Валерьевич - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: yumashev.k.98@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1544-0597
Ковчина Валерия Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: kvi-91@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3134-5776
Никольский Александр Аркадьевич - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: aa.nikolskii@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4169-0760
Каганова Мария Михайловна - студент ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина Минсельхоза России; лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: mariya.kaganova.99@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2596-5779
Русак Татьяна Евгеньевна - студент ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: tatarusak@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-2671-4063
Андреев Сергей Михайлович - канд. хим. наук, зав. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: andsergej@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-8297-579X
Смирнов Валерий Валерьевич - д-р фарм. наук, зав. научно-производственным комплексом ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института фармации им. А.П. Не-любина, ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: vall@mail.mipt.ru http://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Kirill V. Yumashev - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: yumashev.k.98@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1544-0597
Valeriia I. Kovchina - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: kvi-91@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3134-5776
Aleksandr A. Nikolskii - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: aa.nikolskii@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4169-0760
Mariya M. Kaganova - Student, Moscow SAVMB; Lab. Assistant of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: mariya.kaganova.99@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2596-5779
Tatyana E. Rusak - Student, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University); Lab. Assistant of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: tatarusak@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-2671-4063
Sergey M. Andreev - PhD, Head of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: andsergej@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-8297-579X
Valery V. Smirnov - Dr.Sci., PhD, Head of Research and Production complex, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry Chair n.a. A.P. Arzamastsev, Institute of Pharmacy n.a. A.P. Neliubin, I.M. Sechenov 1st Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russian Federation
E-mail: vall@mail.mipt.ru http://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Сергеев Илья Викторович - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной генетики и гистосовмести-мости человека ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ilya-sergeew@yandex.ru
Маерле Артем Владимирович - науч. сотр. лаб. молекулярной генетики и гистосовместимости человека ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: maerle@yandex.ru
Кофиади Илья Андреевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: kofiadi@mail.ru http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Шатилова Анастасия Витальевна - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: av.timofeeva@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-3780-2878X
Шатилов Артем Андреевич - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: aa.shatilov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4675-8074X
Кудлай Дмитрий Анатольевич - член-корр. РАН, д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. фармакологии Института фармации им. А.П. Нелю-бина, ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Российская Федерация E-mail: kudlay@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Хаитов Муса Рахимович - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; зав. каф. иммунологии МБФ, ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
Ilya V. Sergeev - PhD, Leader Researcher of the Molecular Genetics and Human Histocompatibility Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ilya-sergeew@yandex.ru
Artem V. Maerle - Researcher of the Molecular Genetics and Human Histocompatibility Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: maerle@yandex.ru
Ilya A. Kofadi - D.Sci., PhD, Head of the Molecular Immu-nogenetics Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: kofadi@mail.ru http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Anastasia V. Shatilova - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: av.timofeeva@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-3780-2878X
Artem A. Shatilov - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: aa.shatilov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4675-8074X
Dmitry A. Kudlay - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Leader Researcher of the Personalized Medicine and Molecular Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Pharmacology Chair, Institute of Pharmacy n.a. A.P. Neliubin, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: kudlay@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Musa R. Khaitov - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Prof., Director, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Head of the Immunology Chair, MBF, N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
