МИР 19® - ПЕРВЫЙ В МИРЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ COVID-19: РАЗРАБОТКА И ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Хаитов Муса Рахимович; Никонова Александра Александровна; Шиловский Игорь Петрович; Кожихова Ксения Вадимовна; Кофиади Илья Андреевич; Гудима Георгий Олегович; Вишнякова Людмила Ивановна; Никольский Александр Аркадьевич; Ковчина Валерия Ивановна; Тимотиевич Екатерина Драгановна; Юмашев Кирилл Валерьевич; Смирнов Валерий Валерьевич; Маерле Артем Владимирович; Козлов Иван Борисович; Шатилов Артем Андреевич; Шатилова Анастасия Витальевна; Андреев Сергей Михайлович; Колоскова Олеся Олеговна; Кузнецова Надежда Анатольевна; Васина Дарья Владимировна; Никифорова Мария Андреевна; Рыбалкин Сергей Петрович; Сергеев Илья Викторович; Трофимов Дмитрий Юрьевич; Мартынов Александр Игоревич; Берзин Игорь Александрович; Гущин Владимир Алексеевич; Ковальчук Алексей Валерьевич; Борисевич Сергей Владимирович; Скворцова Вероника Игоревна

Хаитов М.Р.1' 2, Никонова А.А.1' 3, Шиловский И.П.1, Кожихова К.В.1, Кофиади И.А.1' 2, Гудима Г.О.1' 4, Вишнякова Л.И.1, Никольский А. А.1, Ковчина В.И.1, Тимотиевич Е.Д.1, Юмашев К.В.1, Смирнов В.В.1' 5, Маерле А.В.1, Козлов И.Б.1, Шатилов А. А.1, Шатилова А.В.1, Андреев С.М.1, Колоскова О.О.1, Кузнецова Н.А.6, Васина Д.В.6, Никифорова М.А.6, Рыбалкин С.П.1, Сергеев И.В.1, Трофимов Д.Ю.1' 7, Мартынов А.И.1, Берзин И.А.8, Гущин В.А.6, Ковальчук А.В.9, Борисевич С.В.9, Скворцова В.И.8

МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

3 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 105064, г. Москва, Российская Федерация

4 Академия постдипломного образования Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России», 125371, г. Москва, Российская Федерация

5 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация

6 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация

7 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

8 Федеральное медико-биологическое агентство, 123182, г. Москва, Российская Федерация

9 Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, 141306, г. Сергиев Посад-6, Российская Федерация

Резюме

Введение. С начала пандемии COVID-19 - заболевания, вызываемого новым корона-вирусом SARS-CoV-2, основное внимание специалистов в области биомедицины было сфокусировано на создании профилактических вакцин. При этом существует огромная и неудовлетворенная потребность в специфичных лекарственных препаратах для лечения COVID-19. В статье описана разработка и доклинические исследования оригинального противовирусного препарата, действующего на основе механизма РНК-интерференции.

Цель исследования - оценка противовирусного эффекта миРНК против SARS-CoV-2 in vitro и in vivo, а также разработка лекарственного препарата на их основе.

Материал и методы. Для проектирования молекул миРНК были использованы методы биоинформатики и специализированное программное обеспечение. Спроектировано более 15 000 вариантов миРНК, из них для синтеза было отобрано 13 вариантов.

Для скрининга их активности в экспериментах in vitro использована система, основанная на векторах, экспрессирующих гены SARS-CoV-2, которые были слиты с репор-терным геном люциферазы светлячка. Дополнительно использовали модель инфекции SARS-CoV-2 in vitro. Для повышения стабильности наиболее активный вариант миРНК — siR-7 был модифицирован с помощью закрытых нуклеиновых кислот (LNA); модифицированный вариант обозначен как siR-7-EM. Для внутриклеточной доставки миРНК использован дендримерный пептид KK-46. Молекулы миРНК смешивали с этим пептидом в соотношении 1/20 по массе, после чего полученный комплекс (siR-7-EM/KK-46) добавляли в культуру инфицированных клеток или использовали для ингаляций в модели инфекции сирийских хомячков.

Результаты. В результате скрининга библиотеки спроектированных молекул миРНК был идентифицирован наиболее активный вариант - siR-7, мишенью для которого явля-

Для корреспонденции

Шиловский Игорь Петрович -доктор биологических наук, заместитель директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5343-4230

Хаитов М.Р., Никонова А.А., Шиловский И.П., Кожихова К.В., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Вишнякова Л.И., Никольский А. А., Ковчина В.И., Тимотиевич Е.Д., Юмашев К.В., Смирнов В.В., Маерле А.В., Козлов И.Б., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Колоскова О.О., Кузнецова Н.А., Васина Д.В., Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 271 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования

ется участок генома вируса, кодирующий жизненно важный фермент - РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp). Мы показали, что LNA-модификация этой миРНК значительно увеличивает устойчивость молекул к деградации, а также усиливает ее противовирусную активность in vitro. В экспериментах in vivo продемонстрировано, что ингаляционное введение комплекса siR-7-EM/KK-46 инфицированным сирийским хомячкам приводит к уменьшению вирусной нагрузки в легких, а также к снижению вирус-индуцированного воспаления.

Заключение. Предложена терапевтическая стратегия для лечения COVID-19, основанная на ингаляционном введении комплекса молекул миРНК, подавляющих образование фермента RdRp, необходимого для репликации вируса, и пептида-носителя. Антивирусная активность комплекса продемонстрирована в экспериментальных моделях in vitro и in vivo. На основе комплекса siR-7-EM/KK-46 разработан МИР 19® - первый в мире лекарственный препарат на основе миРНК, специфически подавляющий репликацию SARS-CoV-2.

Ключевые слова: COVID-19; LNA; дендримерные пептиды; SARS-CoV-2; миРНК

Статья получена 19.04.2023. Принята в печать 22.05.2023.

Для цитирования: Хаитов М.Р., Никонова А. А., Шиловский И.П., Кожихова К.В., Кофиади И. А., Гудима Г.О., Вишнякова Л.И., Никольский А. А., Ковчина В.И., Тимотиевич Е.Д., Юмашев К.В., Смирнов В.В., Маерле А.В., Козлов И.Б., Шатилов А. А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Колоскова О.О., Кузнецова Н. А., Васина Д.В., Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И.А., Гущин В.А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования. Иммунология. 2023; 44 (3): 270290. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-270-290

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Федерального медико-биологического агентства.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Хаитов М.Р., Никонова А.А., Шиловский И.П., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Кожихова К.В., Смирнов В.В., Колоскова О.О., Андреев С.М., Мартынов А.И., Берзин И.А., Скворцова В.И.; сбор и обработка материала - Вишнякова Л.И., Никольский А.А., Ковчина В.И., Тимотиевич Е.Д., Юмашев К.В., Маерле А.В., Козлов И.Б., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Кузнецова Н.А., Васина Д.В., Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Гущин В.А., Ковальчук А.В., Борисевич С. В.; статистическая обработка - Никонова А. А., Шиловский И.П.; написание текста - Хаитов М.Р., Никонова А. А., Шиловский И.П.; редактирование - Гудима Г.О., Шиловский И.П.

Khaitov M.R.1' 2, Nikonova A.A.1' 3, Shilovskiy I.P.1, Kozhikhova K.V.1, Kofiadi I.A.1' 2, Gudima G.O.1 4, Vishnyakova L.I.1, Nikolskii A.A.1, Kovchina V.I.1, Timotievich E.D.1, Yumashev K.V.1, Smirnov V.V.1' 5, Maerle A.V.1, Kozlov I.B.1, Shatilov A.A.1, Shatilova A.V.1, Andreev S.M.1, Koloskova O.O.1, Kuznetsova N.A.6, Vasina D.V.6, Nikiforova M.A.6, Rybalkin S.P.1, Sergeev I.V.1, Trofimov D.Yu.1 7, Martynov A.I.1, Berzin I.A.8, Gushchin V.A.6, Kovalchuk A.V.9, Borisevich S.V.9, Skvortsova V.I.8

MIR 19® - world first specific antiviral drug for COVID-19 treatment: development and preclinical studies

1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation

2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation

3 Research Institute of Vaccines and Sera named after I.I. Mechnikov, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 105064, Moscow, Russian Federation

4 Academy of Postdiplomal Education of Federal Research and Clinical Center of Specialized Types of Health Care and Medical Technology of the Federal Medical-Biological Agency, 125371, Moscow, Russian Federation

5 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation

6 Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation

7 National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after academician V.I. Kulakov of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation

8 Federal Medical-Biological Agency, 123182, Moscow, Russian Federation

9 48 Central Scientific Research Institute, Ministry of Defense of the Russian Federation, 141306, Sergiev Posad-6, Russian Federation

Abstract

Introduction. At the beginning of the SARS-CoV-2 pandemic, specialists in biomedicine were predominantly focused on development of preventive vaccines. However, there is a huge unmet need for specific ways of treatment. In this study we describe the development and testing new antiviral drug which acts through RNA interference mechanism.

The aim of the study was to evaluate the antiviral effect of siRNA against SARS-CoV-2 both in vitro and in vivo, and development of specific siNRA based therapeutic drug.

Material and methods. Bioinformatics methods and specialized software were used for the design of siRNA molecules. More than 15,000 siRNAs variants were designed, 13 variants of siRNAs were selected for synthesis. A system based on vectors expressing luciferase reporter genes fused with SARS-CoV-2 genes was used for screening their activity in vitro. In addition, an in vitro SARS-CoV-2 infection model was used. To improve stability, the most active siRNA variant, siR-7, was modified using locked nucleic acids (LNA), and the modified variant was designated as siR-7-EM. Dendrimeric peptide KK-46 was used for intracellular delivery of siRNA. The siRNA molecules were mixed with this peptide at a ratio of 1/20 by mass, and the resulting complex (siR-7-EM/KK-46) was added to the culture of infected cells or used for inhalation in a Syrian hamster infection model.

Results. As a result of screening a library of designed siRNA molecules, the most active variant - siR-7 - was identified, which targets a region of the virus genome encoding the essential RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) enzyme. We demonstrated that LNA modification of this siRNA significantly improved its stability to degradation and enhanced its antiviral activity in vitro. In vivo experiments showed that the inhalations with siR-7-EM/KK-46 complex of infected Syrian hamsters resulted in a reduction in viral load in the lungs and a decrease in virus-induced inflammation.

Conclusion. A therapeutic strategy for the treatment of COVID-19 based on the inhalations with a complex of siRNA molecules suppressing the virus replication enzyme and a carrier pep-tide is proposed. The antiviral activity of the complex has been demonstrated on experimental models in vitro and in vivo. MIR 19, the world's first siRNA-based drug specifically suppressing SARS-CoV-2 replication, was developed on the basis of the siR-7-EM/KK-46 complex.

Keywords: COVID-19; LNA; peptide dendrimers; SARS-CoV-2; siRNA

Received 19.04.2023. Accepted 22.05.2023.

For citation: Khaitov M.R., Nikonova A.A., Shilovskiy I.P., Kozhikhova K.V., Kofiadi I.A., Gudima G.O., Vishnyako-va L.I., Nikolskii A.A., Kovchina V.I., Timotievich E.D., Yumashev K.V., Smirnov V.V., Maerle A.V., Kozlov I.B., Shatilov A.A., Shatilova A.V, Andreev S.M., Koloskova O.O., Kuznetsova N.A., Vasina D.V., Nikiforova M.A., Rybalkin S.P., Sergeev I.V., Trofimov D.Y., Martynov A.I., Berzin I.A., Gushchin V.A., Kovalchuk A.V., Borise-vich S.V., Skvortsova V.I. MIR 19® - world first specific antiviral drug for COVID-19 treatment. Development and preclinical studies. Immunologiya. 2023; 44 (3): 270-90. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-270-290 (in Russian)

Funding. This study was funded by Federal Medical-Biological Agency. Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.

Authors' contribution. Study conception and design - Khaitov M.R., Nikonova A.A., Shilovskiy I.P., Kofiadi I.A., Gudima G.O., Kozhikhova K.V., Smirnov V.V., Koloskova O.O., Andreev S.M., Martynov A.I., Berzin I.A., Skvortsova V.I.; material collection and processing - Vishnyakova L.I., Nikolskii A.A., Kovchina V.I., Timotievich E.D., Yumashev K.V., Maerle A.V., Kozlov I.B., Shatilov A.A., Shatilova A.V., Kuznetsova N.A., Vasina D.V., Nikiforova M.A., Rybalkin S.P., Sergeev I.V., Trofimov D.Yu., Gushchin V.A., Kovalchuk A.V., Borisevich S.V.; statistical processing -Nikonova A.A., Shilovskiy I.P.; manuscript preparation - Khaitov M.R., Nikonova A.A., Shilovskiy I.P.; editing -Gudima G.O., Shilovskiy I.P.

For correspondence

Igor P. Shilovskiy -Dr. Sci, PhD, Deputy Director on Science and Innovation, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5343-4230

Введение

В декабре 2019 г. в китайском городе Ухань была зарегистрирована вспышка тяжелых острых респираторных инфекций, затем болезнь под названием COVID-19 (Corona Virus Disease-19) охватила земной шар и стала самой смертоносной пандемией респираторного заболевания с 1918 г., когда пандемия испанского гриппа унесла жизни свыше 50 млн человек [1-3]. Виновником пандемии COVID-19 является новый ко-ронавирус (CoV), которому Международный комитет

по таксономии вирусов (1СГУ) присвоил обозначение 8АЯ8-Со^2. Ранее известные коронавирусы, вызывающие тяжелые респираторные заболевания, SARS-CoV (современное обозначение: 8АЯ8-Со^1) и MERS-CoV относятся к близкородственным бета-коронавирусам [4]. Все они передались человеку от животных. SARS-Со^1 и MERS-CoV вызывающие атипичную пневмонию, произошли от вирусов летучих мышей. Крупный резервуар этих вирусов существует в азиатских странах, в частности, в Китае [5, 6].

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 273 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования

Согласно данным Университета Джона Хопкинса (Ресурсный центр ВОЗ по SARS-CoV-2-инфекции/ COVID-19, (https://coronavirus.jhu.edu/map.html), к концу апреля 2023 г. в мире зарегистрировано более 676 млн подтвержденных случаев заболевания и более 6 млн смертей, связанных с COVID-19.

В начале пандемии большое внимание исследователей и фармацевтических компаний было сфокусировано на разработке профилактических вакцин. К настоящему моменту уже создано и внедрено в широкую медицинскую практику несколько вакцин, основанных на различных технологических платформах. Ввиду изменчивости вируса продолжаются работы по совершенствованию существующих и созданию новых вакцин, проводятся их доклинические и клинические исследования [7-9].

Однако, кроме профилактической вакцинации, существует острая необходимость в разработке эффективных средств лечения COVID-19. На разных этапах пандемии для лечения COVID-19 применялись различные противовирусные препараты, среди которых фави-пиравир, гидроксихлорохин, ремдесивир, лопинавир, плазма реконвалесцентов, интерфероны и др., однако подавляющее большинство из них имеют ограниченную (а иногда даже противоречивую) клиническую эффективность [10-13].

Например, гидроксихлорохин давно исключен из рекомендаций по лечению COVID-19 во многих странах. Лечение плазмой реконвалесцентов малоэффективно, во многих странах этот метод лечения исключают из клинических рекомендаций [13, 14]. Результаты клинических исследований применения интерферонов для лечения COVID-19 оказались противоречивыми, в настоящее время их использование не рекомендовано в США и в странах Европейского союза [15, 16]. Кроме того, были разработаны моноклональные антитела, специфичные к SARS-CoV-2, которые показали многообещающие результаты в экспериментальных моделях на животных [17], а также снижали вирусную нагрузку у пациентов [18]. Важно отметить, что изменчивость вируса приводит к снижению эффективности таких препаратов, а также вакцин. Таким образом, необходимы новые стратегии лечения, специфичные для заболевания, вызванного SARS-CoV-2.

Геном SARS-CoV-2 представляет собой одноце-почечную молекулу РНК положительной полярности (+ssRNA) размером почти 30 т.п.н., кодирующую не менее 5 открытых рамок считывания (ORF). Первая ORF (ORF1a/b) занимает ~70 % всего генома и кодирует 16 неструктурных белков (nsp1-16). Остальные 30 % генома кодируют 4 основных структурных белка, необходимых для сборки вириона: белок шипа (S), мембранный белок (M), белок оболочки (E), белок нуклео-капсида (N) [19-21].

Экспрессию генов (в том числе генов вируса) можно направленно подавлять с помощью средств, действующих на основе механизма интерференции РНК [22-26]. Основой таких средств являются молекулы малых ин-

терферирующих РНК (миРНК), которые специфично взаимодействуют с целевыми последовательностями мРНК и катализируют ее деградацию [27, 28]. Важным преимуществом применения миРНК по сравнению с большинством других терапевтических подходов является высокая специфичность, однако эта технология имеет ограничения. В частности, проникновение молекул миРНК в клетки-мишени затруднено. Поэтому для доставки миРНК к месту действия - в цитоплазму инфицированной клетки, применяют специальные носители, например липосомы, полимеры и пептиды.

В настоящем исследовании мы создали библиотеку из 13 вариантов миРНК, направленных на различные участки генома SARS-CoV-2, и провели скрининг их противовирусной активности in vitro. Затем наиболее активный вариант миРНК модифицировали для повышения ее стабильности и использовали для создания комплекса с новым нетоксичным дендримерным (разветвленным) пептидом-носителем KK-46. В отдельных экспериментах мы подтвердили противовирусную активность комплекса на модели инфекции сирийских хомячков [29]. Ингаляционное введение комплекса приводило к подавлению репликации вируса в ткани легких и снижению воспаления, вызванного инфекцией SARS-CoV-2.

Материал и методы

Плазмидные конструкции и дизайн миРНК. Первичный скрининг сайленсинговой активности миРНК проводили in vitro с использованием векторов, экс-прессирующих гены вируса, слитые с репортерным геном люциферазы светлячка. Были сконструированы две ДНК-кассеты, несущие полноразмерные гены SARS-CoV-2 (NCBI RefSeq NC_045512.2): 1) ген RdRp (2796 п.н.), кодирующий РНК-зависимую РНК-полиме-разу (RdRp); 2) ген N, кодирующий нуклеокапсидный белок N (1260 п.н.) (рис. 1). Эти ДНК-кассеты были встроены в экспрессионный вектор pVAX-1 (Thermo Fisher Scientific, США) под контроль СМ^промотора таким образом, чтобы гены вируса оказались слиты с ре-портерным геном люциферазы светлячка (Luc), но при этом были разделены внутренним сайтом посадки рибосом (1RES) (см. рис. 1). Таким образом, были созданы 2 рекомбинантные плазмиды pRdRp-full и pVAX-N-IRES-LUC, которые способны экспрессировать в клетках млекопитающих гены вируса (RdRp и N) совместно с репор-терным геном Luc в виде единой бицистронной мРНК. В таком случае о подавлении экспрессии гена вируса будет свидетельствовать снижение люминесценции клеток.

Всего in silico было спроектировано более 15 000 вариантов миРНК, из них для синтеза было отобрано 13 вариантов миРНК, нацеленных на гены, кодирующие RdRp- и N-белки SARS-CoV-2 (см. рис. 1В). В качестве контролей использовали миРНК против люциферазы светлячка (siLuc) [30] и GFP (siGFP).

Для повышения стабильности молекулы миРНК модифицировали LNA-нуклеотидами следующим образом (на примере siR-7): в З'-конец смысловой цепи (S) введена одна модификация (+G), в 5'-конец - две модифи-

Э

J

э

5' CMV START RdRP STOP IRES START Luc STOP

5' CMV START N STOP IRES START Luc STOP

PCR-праймер

С

RT-праймер

............

41HHH

Nspl Nsp3 Nsp4 Nsp6 Nsp11 Nsp12 Nsp13 Nsp14 Nsp15Nsp16

Nsp2 Nsp5 NNSpp78NsP10

Nsp9

siR-6-siR-15

N

siN-2-siN-5

Рис. 1. Плазмидные конструкции и дизайн миРНК (по [30])

Схематичное представление экспрессии бицистронной плазмиды, кодирующей гены люциферазы светлячка (Luc), и полноразмерного RdRp (pRdRp-full) (А) или N (pVAX-N-IRES-LUC) (Б) генов SARS-CoV-2; В - расположения миРНК, нацеленных на гены RdRp (siR-6-siR-15) и N (siN-2-siN-5) SARS-CoV-2. Отмечен регион генома вируса, кодирующий NSP1, который был использован для количественной детекции вирусной РНК (вРНК) методом ПЦР-РВ.

кации (+T+T), в 5'-конец антисмысловой цепи (aS) - две модификации (+T+T): S - +Ggaaggaaguucuguugaa+T+Tt; aS - uucaacagaacuuccuucc+T+Tt.

Котрансфекция клеток HEp-2 плазмидными конструкциями и миРНК. Клетки НЕр-2 (ATCC® Number: CCL-23™) культивировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США) и 1 % пенициллина/ стрептомицина (ПанЭко, Россия). Клетки высевали в 24-луночные планшеты в концентрации 105 клеток/ лунку в 0,5 мл среды и инкубировали при 37 °С с 5 % СО2 в течение 12-24 ч. Клетки последовательно котрансфе-цировали каждой плазмидной конструкцией pRdRp-full или pVAX-N-IRES-LUC (0,25 мкг/лунку) с Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, США) (0,5 мкл/лунку), а затем через 30 мин каждым из 13 вариантов миРНК (0,75 мкг/лунку) с Lipofectamine 3000 (1,5 мкл/лунку).

В обоих случаях комплексы с Lipofectamine 3000 готовили на бессывороточной среде Opti-MEM (Gibco, США) по протоколу производителя. Через 4 ч среду с комплексами заменяли на свежую DMEM. Затем через 24 ч клетки лизировали специальным реагентом и анализировали активность люциферазы светлячка с помощью набора Bright-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, США) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки, трансфецированные siLuc и siGFP, использовали в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно.

Синтез, очистка и характеристика дендример-ного пептида КК-46. Дизайн катионного дендримерного пептида КК-46 для внутриклеточной доставки миРНК был основан на расчете молекулярных свойств in silico (программное обеспечение: Chemsketch, Dock Prep, Py-MOL) для достижения оптимального диапазона положительного заряда и амфифильности, что необходимо для проникновения пептида в клетку и транспортировки им молекул миРНК. Положительный заряд обеспечивается остатками аргинина и гистидина на N-концах ветвей пептида. При помощи анализа межмолекулярных взаимодействий оценивали его способность ингибировать связывание RBD с ACE2 [31, 32].

Анализ цитотоксичности. Клетки Vero (получены из коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Д. И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России) высевали в 96-лу-ночные планшеты (NUNC, Дания) в концентрации 2 • 104 клеток/мл в среде ДМЕМ с 5 % ЭТС, инкубировали 24 ч и добавляли 2-кратные разведения пептида KK-46 (29-2500 мкг/мл) в культуральной среде без ЭТС и инкубировали 24 ч. Цитотоксичность КК-46 оценивали с помощью набора «CellTiter96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay» (Promega, США) в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение регистрировали при длине волны 570 нм (при эталонной длине волны 700 нм) с помощью прибора Varioskan®Flash 2.4 (Thermo Fisher Scientific, США).

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 275 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения СОУГО-19: разработка и доклинические исследования

Трансфекция клеток HEp-2 комплексами pGL3/

KK-46. Клетки НЕр-2 культивировали, как описано выше. Клетки трансфецировали плазмидой pGL3, несущей репортерный ген Luc (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) (0,5 мкг/лунку) в комплексе с пептидом КК-46. Для трансфекции использовали несколько массовых соотношений КК-46 и pGL3 (5 : 1, 12,5 : 1, 20 : 1, 25 : 1, 50 : 1, 100 : 1). Коммерческий Lipofectamine 3000 использовали в качестве положительного контроля. Протокол трансфекции и анализ люминесценции выполняли, как описано выше.

Вирусы. Штамм PMVL-1 SARS-CoV-2 (GISAID Number EPI_ISL_42127) использовали для экспериментов in vitro. Его культивировали и титровали в клетках Vero E6 (ATCC® Number: CRL-1586™, США) для определения ТЦД50/мл (тканевая цитопатогенная доза). Для экспериментов in vivo штамм В SARS-CoV-2 выращивали и титровали на клетках Vero C1008 (ATCC® CRL-1586™, США). Путем подсчета числа бляшек на монослое клеток оценивали вирусную нагрузку и определяли количество бляшкообразующих единиц (БОЕ), как описано в работе [32]. Вирусы использовали при 1 • 105 ТЦД/мл для штамма PMVL-1 и 1 • 106 БОЕ/мл для штамма B. Эксперименты с SARS-CoV-2 проводились в лабораториях, сертифицированных по 3-му уровню биобезопасности.

Трансфекция клеток комплексами миРНК/ Lipofectamine 3000 и миРНК/КК-46. Клетки Vero E6 высевали в 24-луночные планшеты в количестве 105 клеток/лунку в 0,5 мл среды и инкубировали при 37 °С, 5 % СО2 в течение 12-24 ч. Среду заменяли на Opti-MEM, не содержащую ЭТС. К клеткам добавляли по 100 мкл смеси, содержащей 0,5 мкг миРНК и 1,5 мкл Lipofectamine 3000 в Opti-MEM. Через 4 ч смесь удаляли, клетки инфицировали SARS-CoV-2 при множественности инфекции (MOI) = 0,0001 (в 0,5 мл среды) и инкубировали 1 ч при 37 °С, 5 % СО2. Дозу вируса подбирали в отдельных опытах. Инфекция с низким MOI (0,0001) позволила достичь вирус-специфической цитотоксичности и в то же время определять вирусную нагрузку методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Клетки промывали для удаления неприкрепившегося вируса и культивировали в свежей среде. Супернатанты клеточных культур и лизаты клеток собирали и хранили при -80 °С до анализа.

Аналогичную процедуру использовали для транс-фекции комплексами миРНК/КК-46. Единственным исключением было количество компонентов. Использовали три возрастающие концентрации комплекса: 21, 42 и 84 мкг/лунку, который содержал смесь КК-46 + миРНК в количестве 20 + 1, 40 + 2 и 80 + 4 мкг (массовое соотношение 20 : 1) соответственно. В качестве отрицательного контроля использовали неспецифическую миРНК, нацеленную на ген люциферазы светлячка (siLuc), и клетки, инфицированные SARS-CoV-2 без добавления миРНК.

Выделение РНК и анализ вирусной нагрузки с помощью количественной ПЦР. Общую РНК выделяли

из супернатантов культур и клеточных лизатов с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Амплификацию и количественную оценку РНК SARS-CoV-2 проводили с использованием одноэтапной методики ПЦР. Для этого использовали реакционную смесь, содержащую (на одну реакцию) по 5 пМ каждого праймера, 3 пМ зонда, 0,025 мМ каждого dNTP («Евроген», Россия), 5 мкл 10Х буфера для одноступенчатой ПЦР (100 мМ Трис-НС1, рН 8,3 при 25 °С, 150 мМ KCl, 10 мМ MgC12, 8 мМ DTT), 0,25 мкл обратной транс-криптазы M-MLV (100 ед.), 0,25 мкл Taq-полимеразы (5 единиц) и 10 мкл РНК (0,5 мкг). Общий объем одной реакционной смеси составлял 25 мкл. Праймеры и зонды были разработаны для нацеливания на ген, кодирующий NSP1 (лидерный пептид) SARS-CoV-2: прямой праймер - 5'-GTA CGT GGC TTT GGA GAC TC-3', обратный праймер - 5'-ACT AAG CCA CAA GTG CCA TC-3', зонд 5'-Cy5-AGG AGG TCT TAT CAG AGG CAC GTC A-BHQ2-3'.

Амплификацию проводили на приборе Real-time CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Условия одноступенчатой ПЦР: 50 °C в течение 15 мин, 95 °C в течение 5 мин, затем 45 циклов 95 °C в течение 10 с и 55 °C в течение 1 мин. Количество копий вирусной РНК рассчитывали, используя стандартную кривую, полученную при амплификации матрицы плазмидной ДНК, содержащей амплифицированный фрагмент.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Определение устойчивости молекул миРНК к сывороточным ферментам деградации. Немодифици-рованные и LNA-модифицированные миРНК (siR-7 и siR-7-EM) (3 мкг) инкубировали при 37 °C в 50 % сыворотке крови мышей, разведенной фосфатно-солевым буфером, в течение 264 ч. Аликвоты по 10 мкл отбирали через определенные интервалы времени и подвергали электрофорезу в 1,5 % агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и определяли количество полос, соответствующих полноразмерным миРНК, с помощью гель-денситометрии с использованием программного обеспечения Gel Doc XR+ (Bio-Rad, США) и сравнивали с образцом, собранным сразу после смешивания миРНК с сывороткой.

Исследование противовирусной активности комплекса миРНК/пептид in vivo. Эксперименты с животными одобрены локальным этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (протокол № 09-2020 от 17.09.2020). В эксперименте использовали сирийских хомячков (самки, возраст 4-5 нед, масса 40-60 г), приобретенных в НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН.

В первой серии экспериментов in vivo определяли оптимальную концентрацию комплекса siR-7-EM/KK-46. Было сформировано 6 групп животных (n = 10). Пять из шести групп были интраназально инфицированы 105 БОЕ SARS-CoV-2 штамм B в день 0. В тот же день (через час после заражения) и в день 1 инфицированные животные подвергались воздействию аэрозоля siR^-EM/^^ в трех возрастающих дозах: 0,7,

Подавление активности люциферазы с помощью миРНК в клетках НЕр-2, последовательно трансфецированных плазмидой, кодирующей гены 8ЛК8-СоУ-2, которые слиты с геном люциферазы светлячка и специфическими или неспецифическими миРНК

№ Название Подавление активности люциферазы (%, n = 4, среднее значение ± отклонение) по сравнению с:

siRNA плазмидой неспецифической siGFP

1 siLuc pRdRp-full 82,9 ± 6,2 79,3 ± 10,2

1a siLuc pVAX-N-IRES-LUC 75,2 ± 10,9 72,4 ± 9,1

2 siN-2 pVAX-N-IRES-LUC 42,3 ± 27,4 36,4 ± 20,7

3 siN-3 pVAX-N-IRES-LUC 64,6 ± 17,3 60,8 ± 14,7

4 siN-4 pVAX-N-IRES-LUC 81,2 ± 9,2 78,8 ± 10,05

5 siN-5 pVAX-N-IRES-LUC 64,7 ± 13,4 60,4 ± 6,1

6 siR-7 pRdRp-full 91,3 ± 3,2 89,2 ± 4,9

7 siR-8 pRdRp-full 47,2 ± 28,3 56,6 ± 22,01

8 siR-9 pRdRp-full 67,6 ± 7,9 61,7 ± 14,6

9 siR-10 pRdRp-full 70,6 ± 19,3 64,6 ± 22,9

10 siR-11 pRdRp-full 84,5 ± 8,6 81,3 ± 10,6

11 siR-12 pRdRp-full 56,8 ± 23,5 48,01 ± 28,9

12 siR-13 pRdRp-full 77,9 ± 8,8 73,4 ± 12,2

13 siR-14 pRdRp-full 47,3 ± 22,4 36,3 ± 31,06

14 siR-15 pRdRp-full 71,1 ± 11,3 65,03 ± 17,4

1,96 или 5,6 мг/кг. Животных помещали в камеру для ингаляционного воздействия. Аэрозоли формировали с помощью меш-небулайзера Xiao mi Andon VP-M3A Micro Mesh Nebulizer (Xiaomi, Китай). Контрольную группу животных заражали вирусом и не вводили никаких препаратов (группа «SARS-CoV-2»). Группа «К-» не подвергалась заражению и экспериментальному лечению. По 5 животных из каждой группы выводили из эксперимента путем декапитации на 2-е сутки после заражения и извлекали легкие для анализа.

Проведена макро- и микроскопическая оценка поражений ткани легкого. Левое легкое фиксировали в 10 % забуференном формальдегиде, заливали в парафин и окрашивали срезы гематоксилином и эозином. Гистопатологические изменения оценивали в соответствии с модифицированной полуколичественной системой оценки (отсутствие - 0; легкие - 1; умеренные - 2; тяжелые - 3). Правое легкое гомогенизировали и определяли титр вируса в гомогенатах на монослое клеток Vero C1008 [33]. По 5 животных, оставленных в каждой группе, подвергали дальнейшему воздействию аэрозоля siR-7-EM/KK-46 на 3-и, 4-е и 5-е сутки, после чего на 6-е сутки их также выводили из эксперимента и извлекали ткани легких, как описано выше.

Вторую серию экспериментов in vivo проводили аналогично, за некоторыми исключениями. Аэрозольное введение комплекса siR-7-EM/KK-46 проводили 2 раза в сутки с интервалом в 2 ч, при этом животные получали суточную дозу 0,35; 0,7 и 2,0 мг/кг. Контрольная группа животных получала перорально фавипиравир (в течение 1 ч после заражения вводили дозу 1,2 мг дважды в день, а затем ежедневно в течение 6 дней после заражения вводили по 0,4 мг дважды в день). Анализ ткани легких осуществляли как описано выше.

Статистический анализ. Нормальность выборок определяли с помощью теста Шапиро-Уилка. Дан-

ные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего для параметрического анализа и в виде медианы ± стандартное отклонение для непараметрического анализа. Статистический анализ проводили с использованием программы Prism 8 (программное обеспечение GraphPad). Для множественных сравнений при определении различий между группами или в случае ненормального распределения был проведен анализ по критерию Краскела-Уоллиса (указано в соответствующих подписях к рисункам). Данные считались статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Скрининг активности миРНК с помощью биолюминесцентного анализа

Для определения способности сконструированных миРНК подавлять экспрессию генов SARS-CoV-2 проведен скрининг in vitro. Для этого мы сконструировали плазмиды pRdRp-full и pVAX-N-IRES-LUC, одновременно экспрессирующие гены SARS-CoV-2, кодирующие белки RdRp и N, соответственно, а также репортер-ный ген люциферазы светлячка.

Клетки HEp-2 котрансфецировали этими плазми-дами и различными вариантами миРНК для оценки их ингибирующей активности. В качестве положительного и отрицательного контролей использовали соответственно миРНК против люциферазы (siLuc) и GFP (siGFP). Как указано в табл. и на рис. 2, миРНК siN-4, siR-7 и siR-11 более чем на 80 % снижали уровень люминесценции лизатов клеток. В дальнейших экспериментах эти варианты были изучены дополнительно.

Следует отметить, что мы не обнаружили существенных различий экспрессии люциферазы между клетками, трансфецированными только плазмидой, или после совместной трансфекции плазмидой и неспецифическим siGFP (см. таблицу).

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 277 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения СОУГО-19: разработка и доклинические исследования

Рис. 2. Антивирусные свойства разработанных миРНК А-Б - ингибирование экспрессии генов вируса синтетическими миРНК. Клетки HEp-2 трансфецировали каждой из плазмид, кодирующих гены SARS-CoV-2, слитые с геном люци-феразы светлячка (pRdRp-full) (А) или pVAX-N-IRES-LUC (Б), с последующей трансфекцией SARS-CoV-2-специфичес-кой или контрольной миРНК. В качестве положительного и отрицательного контролей использовали соответственно siLuc и siGFP. Lipofectamine 3000 использовали в качестве носителя как для плазмид, так и для миРНК. Через 24 ч клетки собирали и определяли активность люциферазы. Данные выражены в относительных световых единицах (RLU) на 104 клеток.

*/f - статистически значимо отличается по сравнению с клетками, трансфецированными только плазмидой/неспеци-фической siGFP соответственно. *f-p < 0,05; **ff-p < 0,01; *** - p < 0,001.

В - ингибирование репликации SARS-CoV-2 с помощью синтетической миРНК. Клетки Vero E6 трансфецировали комплексами миРНК/Lipofectamine 3000. Среду с комплексами удаляли через 4 ч после трансфекции, клетки инфицировали SARS-CoV-2 при MOI = 0,0001. Вирусную нагрузку определяли с помощью количественной ПЦР. Результаты выражены в виде числа копий вирусной РНК на мл.

* - статистически значимо отличается по сравнению с клетками, инфицированными SARS-CoV-2 и обработанными неспецифическим siLuc. f - статистически значимо отличается по сравнению с зараженными SARS-CoV-2 клетками. *f - p < 0,05.

Различия между несколькими группами оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Столбцы показывают средние значения четырех (А-В) независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

я

840"

M

ir ■о 64 0'

§

0 440'

я

240'

RL

pRdRp-full

I

tt tt й

0,0519 -г 0,0519

t

■wílñ

э

# ч>>° ^ Jb ,\ч <У >> ^ ¿¿Г Г ^ ^ ^ ^

1,5406 -,

1405

i U 5405 -

RL

0 -1

84010 -|

- S 64010 -

и

Рч ffl 44010 "

us

= á 24010 "

0 --

pVAX-N-IRES-LUC

t

M

0,0586 ** 0,0666

"Г t Т-

pVAX- siGFP siLuc siN-2 siN-3 siN-4 siN-5 N-IRES-LUC

0,0571 * tt

X. a

I

siN-4 siR-7 siR-11 siLuc SARS-CoV-2

4

4 _

4

*

Противовирусный эффект миРНК in vitro

Противовирусный эффект трех выбранных миРНК (siN-4, siR-7 и siR-11) исследовали in vitro. Для этого трансфецировали клетки Vero E6 комплексами миРНК/ Lipofectamine 3000 и через 4 ч после трансфекции клетки инфицировали SARS-CoV-2 при MOI = 0,0001. Через 48 ч после инфицирования клетки лизировали и определяли вирусную нагрузку методом количественной ПЦР. Обнаружили значительные различия содержания вирусной РНК в клетках, обработанными специфическим вариантом миРНК (siR-7), по сравнению как с неспецифическими миРНК (siLuc), так и с инфицированными клетками, не обработанными миРНК (p < 0,05) (рис. 2В). Кроме того, наблюдалось значительное снижение содержания вирусной РНК в клетках, обработанных siN-4 (p < 0,05), по сравнению с клетками, инфицированными SARS-CoV-2. Также наблюдалась тенденция (р = 0,0571) к значительному снижению содержания вирусной РНК в клетках, обработанных siN-4 (p < 0,05), по сравнению с клетками, обработанными неспецифическими миРНК (siLuc). В то же время вариант siR-11 не ингибировал репликацию вируса. В соответствии с этими результатами вариант siR-7, нацеленный на ген, кодирующий RdRp, был выбран как лучший кандидат для дальнейшего исследования.

Модифицированная siR-7-EM проявляет повышенную устойчивость к нуклеазам

Было показано, что введение LNA-нуклеотидов в классические антисмысловые олигонуклеотиды повышает стабильность последних [34]. Поэтому мы разработали вариант siR-7, который содержал 5 LNA-нуклеотидов. Модифицированный вариант миРНК обозначили как siR-7-EM.

Чтобы проверить, могут ли эти модификации увеличить устойчивость siR-7 к ферментам деградации, мы провели исследования ее стабильности. Стабильность немодифицированной siR-7 и модифицированной siR-7-EM оценивали in vitro путем инкубации в 50 % сыворотке мыши в течение 264 ч при 37 °C.

Как показано на рис. 3, немодифицированная siR-7 деградировала на 50 % после 48 ч инкубации - только 10 % от изначального количества оставалось после 264 ч инкубации. Напротив, LNA-модифицированная siR-7-EM сохранялась даже после 264 ч инкубации (около 50-70 % исходного количества оставалось неизмененным). Более того, мы обнаружили, что период полуразрушения (t1/2) siR-7 и siR-7-EM составляет 72,4 и 256,8 ч соответственно (см. рис. 3А). Эти эксперименты показали, что включение LNA-нуклеотидов в siR-7 способ-

0 24 48 72 96 120 140 168 192 216 240 264 ч

-КЗ— siR-7 ■ siR-7-EM

siR-7 siR-7-EM

Часы 264 168 96 48 24 0 264 168 96 48 24 0

• • 9 • ••

Рис. 3. Модифицированные миРНК обладают повышенной устойчивостью к деградации нуклеазами А - сравнение стабильности немодифицированной siR-7 (кружки) и модифицированной siR-7-EM (квадраты) при инкубации в 50 % сыворотке мышей в течение 264 ч при 37 °C (n = 4); Б - анализ образцов миРНК после инкубации с сывороткой крови мыши с помощью электрофореза в 1,5 % ага-розном геле.

Статистический анализ проведен с использованием метода ANOVA. На рисунке представлены медианы четырех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. **** -p < 0,0001.

ствует существенному увеличению времени полужизни миРНК и, таким образом, может оказывать положительное влияние на общую биостабильность.

Комплекс siR-7-EM/KK-46 проявляет противовирусную активность в отношении SARS-CoV-2 in vitro

Модификация молекул миРНК может уменьшать ее сродство к ферментам, реализующим процесс РНК-интерференции, уменьшая ее биологическую активность по сравнению с немодифицированным вариантом [35, 36]. Чтобы оценить влияние введенных модификаций в последовательность миРНК siR-7 мы провели серию экспериментов in vitro на модели инфекции клеток Vero E6.

Для этого клетки трансфецировали немодифицированной siR-7 и модифицированной миРНК siR-7-EM в комплексе с пептидом-носителем KK-46, после чего

инфицировали клетки SARS-CoV-2. Использовали три возрастающие концентрации комплекса: 21, 42 и 84 мкг/лунку.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Как показано на рис. 4, значительное уменьшение количества вирусной РНК (вРНК) в клеточных лиза-тах (см. рис. 4А; p < 0,01) и супернатантах (см. рис. 4Б; p < 0,01, p < 0,05) было достигнуто через 48 ч при использовании либо 42, либо 84 мкг комплексов siR-7/KK-46 и siR-7-EM/KK-46. Комплекс siR-7-EM/ KK-46 в концентрации 84 мкг/мл уменьшал репликацию вируса в 10 000 раз в сравнении с аналогичной концентрацией комплекса, содержащего неспецифические миРНК (siLuc/KK-46).

Комплексы, содержащие неспецифическую siLuc, вместе с клетками, инфицированными SARS-CoV-2 без обработки комплексом, использовали в качестве отрицательного контроля (см. рис. 4). Значительное снижение содержания вРНК как в лизатах клеток, так и в супернатантах по сравнению с неспецифической siLuc и инфекционным контролем наблюдалось при дозе 42 мкг (p < 0,01). В то же время комплекс, содержащий неспецифические молекулы миРНК, не приводил к снижению вирусной нагрузки в клетках, что свидетельствует о специфическом подавлении репликации вируса комплексами siR-7/KK-46 и siR-7-EM/KK-46.

Комплекс пептида с модифицированным вариантом миРНК (siR-7-EM) оказался более эффективным, чем комплекс с немодифицированной миРНК (siR-7), что выражалось в более сильном подавлении репликации вируса в концентрациях 42 и 84 мкг/мл (рис. 4А), к тому же в концентрации 21 мкг/мл комплекс пептида с siR-7-EM приводил к статистически значимому снижению вирусной нагрузки в клетках в сравнении с отрицательным контролем (siLuc), p < 0,05. Вероятно, более выраженный антивирусный эффект siR-7-EM обусловлен ее повышенной стабильностью (см. рис. 3).

Комплекс siR-7-EM/KK-46 демонстрирует противовирусный эффект в отношении SARS-CoV-2 in vivo

Для исследования терапевтического потенциала комплекса siR-7-EM/KK-46 проведены эксперименты in vivo. Самок сирийских хомячков заражали SARS-CoV-2 в дозе 105 БОЕ, а затем ингаляционно вводили комплекс siR-7-EM/KK-46 в дозах 0,7, 1,96 и 5,6 мг/кг 1 раз в сутки в течение 6 дней.

Половину животных выводили из эксперимента через 2, а вторую половину - через 6 дней после заражения. Обнаружено, что репликация вируса в легких значительно снижалась дозозависимым образом. На 2-й день происходило снижение вирусной нагрузки в легких в 12-40 раз (5,0 ± 0,5; 4,7 ± 0,2; 4,5 ± 0,3 lg БОЕ/мл для доз 0,7; 1,96 и 5,6 мг/кг siR^-EM/^^ соответственно) по сравнению с инфицированными животными и животными без экспериментальной терапии (6,1 ± 0,2 lg БОЕ/мл; p < 0,01; рис. 5А).

Аналогичные результаты были получены на 6-й день после инфекции. Ингаляции комплексом siR-7-EM/KK-46

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И.А., Гущин В.А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 279 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения СОУГО-19: разработка и доклинические исследования

Э

I

5L ffl

>Я

S =

12 -,

11 -

10 -

9 -

8 -

7 -

6 -

5 -

4 -

3 -

2 -

1 -

X

Клеточные лизаты

##

■ siR-7/KK-46

□ siR-7-EM/KK-46

■ siLuc/KK-46

■ SARS-CoV-2

** p < 0,01 по сравнению с SARS-CoV-2 # p < 0,05 по сравнению с siLuc/KK-46 ## p < 0,01 по сравнению с siLuc/KK-46

э

-

S

K/

I

Рч

в

>я

и п о

10

9 8 7 6 5 4 3 2 1

80 мкг КК-46 4 мкг миРНК

40 мкг КК-46 2 мкг миРНК

20 мкг КК-46 1 мкг миРНК

на лунку (0,5 мл)

Супернатанты клеточной культуры

X

X,

## *

X

##

X

X.

X

X.

■ siR-7/^-46

□ siR-7-ЕМ/KK-46

■ siLuc/RX-46

■ SARS-CoV-2

* p < 0,05 по сравнению с SARS-CoV-2 ## p < 0,01 по сравнению с siLuc/KK-46

80 мкг КК-46 4 мкг миРНК

40 мкг КК-46 2 мкг миРНК

20 мкг КК-46 1 мкг миРНК

на лунку (0,5 мл)

Рис. 4. Ингибирование репликации SARS-CoV-2 немодифицированными или LNA-модифицированными комплексами siR-7/ ден-дримерный пептид KK-46 in vitro

Клетки Vero E6 трансфецировали комплексами немодифицированной siR-7 или LNA-модифицированной siR-7-EM с дендример-ным пептидом KK-46 в трех концентрациях (ось абсцисс). Среду с комплексами удаляли через 4 ч после трансфекции и клетки инфицировали SARS-CoV-2 при MOI = 0,0001. Через 48 ч супернатанты и клетки собирали. Вирусную нагрузку определяли методом количественного ПЦР-анализа в клеточных лизатах (А) и супернатантах (Б). Результаты выражены в виде lg количества копий вирусной РНК в мл.

Различия между несколькими группами оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Столбцы показывают медианы пяти независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

# - различия с клетками, инфицированными SARS-CoV-2, и обработанными неспецифической siLuc; * - различия только с инфицированными SARS-CoV-2 клетками. *# - p < 0,05; ** ## - p < 0,01.

0

*

0

значительно и дозозависимо снижали вирусную нагрузку в легких - в 20-250 раз (2,2 ± 0,2; 2,0 ± 0,2; 1,1 ± 0,1 ^ БОЕ/мл для доз 0,7; 1,96 и 5,6 мг/кг 81Я-7-ЕМ/ КК-46 соответственно) по сравнению с инфицированными животными и животными без экспериментальной терапии (3,5 ± 0,2 ^ БОЕ/мл; р < 0,01; см. рис. 5А).

Макроскопический анализ легких (рис. 5Б, Г) выявил значимое (р < 0,05 и р < 0,01, на 2-й и 6-й день соответственно) уменьшение воспаления (см. рис. 5Б). Гистологический анализ ткани легких подтвердил значительное уменьшение воспаления, что выражалось в снижении количества инфильтрирующих клеток и площади перибронхиальных инфильтратов (см. рис. 5Г).

В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что ингаляции Б1Я-7-ЕМ/КК-46 значительно и дозозависимо ослабляют патологические процессы

в легких, препятствуя репликации вируса и развитию воспаления. Предполагаемая эффективная доза 50 (ЭД50) для комплекса Б1К-7-ЕМ/КК-46 составила ~3,453 мг/кг в день (Я2 = 0,88; рис. 5В).

Для оптимизации дозы и курса введения комплекса Б1К-7-ЕМ/КК-46 было проведено дополнительное исследование, в котором препарат вводили 2 раза в сутки и более низких дозах. В этой серии экспериментов самки сирийских хомячков были инфицированы 8АЯ8-СоУ-2 и подвергнуты ингаляциям комплексом Б1Я-7-ЕМ/КК-46 в единовременных дозах 0,175; 0,35 и 1,0 мг/кг. Так как осуществляли по 2 ингаляции в сутки, суточные дозы составили 0,35; 0,7 и 2,0 мг/кг соответственно.

Было обнаружено, что вирусная нагрузка в ткани легких значительно снижается после ингаляций 81Я-7-ЕМ/КК-46 по сравнению с инфицированными жи-

вотными без терапии (р < 0,01 для всех уровней доз) на 2-й и 6-й дни (рис. 6А). В частности, на 2-й день титры вируса снижались в 40-60 раз (5,1 ± 0,1; 4,9 ± 0,2; 4,9 ± 0,1 ^ БОЕ/мл для 0,35; 0,7 и 2,0 мг/кг зЖ-7-ЕМ/КК-46 соответственно) по сравнению с инфицированными животными без терапии (6,7 ± 0,03 ^ БОЕ/мл; р < 0,01).

Снижение титра вируса в легких на 6-й день было еще более выражено и достигало 40-100 раз: 1,7 ± 0,1; 1,6 ± 0,2; 1,3 ± 0,1 ^ БОЕ/мл для доз 0,35; 0,7 и 2,0 мг/кг $Ж.-7-ЕМ/КК-46 соответственно по сравнению с инфицированными животными без терапии (3,3 ± 0,1 ^ БОЕ/мл; р < 0,01).

Пероральное введение фавипиравира снижало титр вируса примерно в 15 раз на 2-й день (5,4 ± 0,1 ^ БОЕ/мл) и в 20 раз на 6-й день по сравнению с инфицированными животными без терапии (р < 0,01) (рис. 6А). Однако, в отличие от фавипиравира, ингаляционное ведение комплекса $Ж.-7-ЕМ/КК-46 не только более существенно снижало вирусную нагрузку в легких (см. рис. 6А), но и улучшало их состояние (рис. 6Б, В).

Обсуждение

Новый коронавирус 8АР.8-СоУ-2 является причиной заболевания СОУЮ-19, пандемия которого была объявлена ВОЗ в 2020 г. Это первая в истории пандемия, вызванная коронавирусной инфекцией [3, 37]. Быстрое распространение заболевания и высокая смертность стали серьезным вызовом для здравоохранения и биомедицинской науки. Первоначально большинство исследований в этой области были направлены на разработку вакцин для противодействия распространению 8АЯ8-СоУ-2-инфекции/СОУЮ-19. Для лечения пациентов применялись уже существующие противовирусные препараты [9, 38]. Вакцинация и применение плазмы реконвалесцен-тов стали первыми способами борьбы с распространением 8АР.8-СоУ-2-инфекции/СОУЮ-19. Масштабы эпидемии, нередкое тяжелое течение заболевания и недостаточная эффективность репозиционированных лекарственных средств диктуют необходимость создания специфических препаратов против патогена 8АЯ8-СоУ-2.

В настоящем исследовании представлены данные, показывающие, что местное (ингаляционное) применение молекул миРНК, направленных против жизненно важных участков генома 8АЯ8-СоУ-2, значительно подавляет как репликацию вируса в ткани легких, так и вирус-индуцированное воспаление в модели 8АЯ8-СоУ-2-инфекции на животных.

Технология подавления активности генов молекулами миРНК имеет многообещающие перспективы для разработки лекарственных средств. Недавно два препарата, действующих на основе интерференции РНК, были одобрены для медицинского применения в Евросоюзе и в США: 01УЬААЯ1® (О1уоБП"ап) для лечения острой печеночной порфирии и ООТАТТИО™ (РаЙБиап) для лечения полинейропатии наследственного транстире-тин-опосредованного амилоидоза [39]. Ведутся работы по созданию подобных препаратов для лечения инфекций, вызванных ВГВ, ВГС, ВИЧ, вирусом Эбола, РСВ

и пр. [40]. Кроме того, ранее было показано, что миРНК могут ингибировать репликацию SARS-CoV как in vitro [41-44], так и in vivo [45, 46]. Также сообщалось об исследовании in silico потенциальных мишеней миРНК в геноме SARS-CoV-2 [31, 47].

Цель данного исследования - не только показать возможность применения технологии интерференции РНК для эффективного подавления репликации SARS-CoV-2, но и разработать лекарственную форму препарата, преодолев возможные узкие места, которые могут препятствовать последующей реализации данного подхода в медицинской практике. К таким узким местам можно отнести прежде всего относительно низкую стабильность миРНК, способ ее внутриклеточной доставки, выбор оптимальной дозы и пути введения.

Разработка миРНК с противовирусной активностью -сложная задача [48]. Во-первых, должны быть идентифицированы оптимальные последовательности миРНК, которые являются высокоспецифичными, обладающие минимальными off-target-эффектами и высокоэффективно блокирующие гены вируса. Во-вторых, должны быть разработаны эффективные и безопасные формы доставки, обеспечивающие проникновение миРНК в инфицированные клетки. Наконец, важно предотвратить деградацию миРНК нуклеазами и избежать нежелательного воспаления, которое может быть связано с применением РНК-содержащих препаратов.

Чтобы идентифицировать специфичные для SARS-CoV-2 миРНК, которые потенциально высокоэффективны в подавлении репликации патогена, in silico были разработаны последовательности миРНК, нацеленные на гены вируса, кодирующие консервативные белки N и RdRp [49]. Эти миРНК протестированы in vitro, в результате чего был выбран оптимальный вариант.

Для сокращения объема работы с инфекционным вирусом был проведен первичный скрининг потенциальных противовирусных миРНК с использованием плаз-мид, содержащих гены SARS-CoV-2, слитые с геном люциферазы светлячка, что позволяет быстро определить сайленсинговую активность миРНК путем оценки активности люциферазы в обработанных клетках.

Специфические миРНК, нацеленные на ген люцифе-разы светлячка и GFP, использовали в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно. Результаты скрининга показали, что 3 из 13 протестированных миРНК (siN-4, siR-7 и siR-11), нацеленных на гены, кодирующие белки N и RdRp, оказались наиболее эффективными. Затем мы оценили противовирусную активность выбранных молекул миРНК in vitro с использованием клеток Vero E6, инфицированных SARS-CoV-2. Эти эксперименты определили siR-7 как оптимальную молекулу, поскольку она значительно снижает количество вирусной РНК в инфицированных клетках (см. рис. 2В). Далее мы модифицировали siR-7 LNA-нуклеотидами, что позволило увеличить стабильность молекул миРНК без потери противовирусных свойств.

В первоначальных экспериментах для доставки миРНК в культивируемые клетки мы использовали

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 281 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения СОУГО-19: разработка и доклинические исследования

4

5

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

èa о

w

00

8 1

7 6 5

4 -3 -2 -1

** по сравнению с 8ЛЯ8-СоУ-2 на 2-й день (р < 0,01) II по сравнению с 8ЛЯ8-СоУ-2 на 6-й день (р < 0,01)

tt

2-й день 6-й день

После инфицирования

П 0,7 мг/кг □ 1,96 мг/кг П 5,6 мг/кг ■ SARS-CoV-2

э

4 -I

3 -

2 -

1 -

* по сравнению с 8ЛЯ8-СоУ-2 на 2-й день (р < 0,05) II по сравнению с 8ЛЯ8-СоУ-2 на 6-й день (р < 0,01)

I

tt

2-й день 6-й день

После инфицирования

□ □ □ □

э

3 -I

0,7 мг/кг 1,96 мг/кг 5,6 мг/кг SARS-CoV-2

х О ш

а я

я H

,составляет

-0,2

0,0

0,2 Доза,

0,4 мг/кг (lg)

0,6

0,8

0,7 мг/кг

1,95 мг/кг

5,6 мг/кг

0

2

0

Рис. 5. Дозозависимое ингибирование репликации БАЯБ-СоУ^ модифицированным комплексом 8Ж-7-ЕМ/КК-46 у сирийских хомячков после ингаляционного воздействия

Сирийские хомячки были инфицированы БЛЯ8-Со¥-2 в дозе 105 БОЕ и ингаляционно обработаны тремя дозами комплекса згЯ-7-БМКК-46 (0,7; 1,96 и 5,6мг/кг). Ингаляции осуществляли ежедневно в течение 6 дней. Через 2 и 6 дней после инфицирования животных выводили из эксперимента, вскрывали и определяли титр вируса (А), а также проводили макроскопическую (Б) и гистопатологическую оценку состояния легких (Г). Результаты выражены в виде ^ содержания бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл (А) или в баллах (Б), полученных при макроскопическом анализе патологических изменений в легких. (В) Кривая «доза-ответ» уровней БЛЯБ-СоУ-2 в легких на 6-й день после инфекции, где ЕД50 составляет ~3,453 мг/кг. Различия между несколькими группами оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса (п = 5).

- статистически значимо отличается от группы «БЛЯБ-СоУ-2», на 2-й/6-й день после заражения соответственно. ** 17 -Р < 0,01; * -р < 0,05.

О** по сравнению с SARS-CoV-2 на 2-й день (p < 0,01) „ ff по сравнению с SARS-CoV-2 на 6-й день (p < 0,01)

8 -|

7 6

S 5 Л

О 4 ш

Л1 3 2 1 0

Э

2-й день 6-й день

После инфицирования

ff по сравнению с SARS-CoV-2 на 6-й день (p < 0,01)

0

■ 0,35 мг/кг

□ 0,7 мг/кг

□ 2 мг/кг

В Фавипиравир

■ SARS-CoV-2

2-й день 6-й день

После инфицирования

3

2

0,35 мг/кг 0,7 мг/кг 2 мг/кг

Рис. 6. Эффект повторяющихся введений низких доз комплекса 8®.-7-ЕМ/КК-46 на модели инфекции сирийских хомячков Сирийские хомячки были инфицированы 8ЛЯБ-Со¥-2 в дозе 105 БОЕ и подвергались воздействию различных доз (0,175; 0,35 и 1,0 мг/кг) аэрозоля згЯ-7-ЕМ/КК-4б дважды в день с интервалами 2 ч. Таким образом, суточные дозы составили 0,35; 0,5 и 2 мг/кг. Через 2 и б дней после инфицирования животных выводили из эксперимента, а затем анализировали титры вируса (А) и проводили макроскопическую (Б) и гистопатологическую (В) оценку состояния легких. Пероральное введение фавипиравира (через 1 ч после инфицирования в дозе 1,2 мг/животное вводили 2 раза в день, а затем ежедневно в течение б дней после инфекции 0,4 мг/животное 2раза в день) служило положительным контролем. Результаты выражены в виде ^ содержания бляшко-образующих единиц (БОЕ) на мл (А) или баллах (Б), полученных при макроскопическом анализе патологических изменений легких. Различия между несколькими группами оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса (п = 5).

- статистически значимо отличается от группы «8ЛЯБСо¥-2», на 2-й/б-й день после заражения соответственно. ** 17 -Р < 0,01; * -р < 0,05.

коммерческий реагент Lipofectamine 3000, который не рекомендуется использовать in vivo. Поэтому, несмотря на ранние сообщения о возможности локальной доставки «голых» миРНК (без носителя) в легкие [50-52], мы разработали новый носитель - дендримерный пептид KK-46 - для безопасной и эффективной доставки миРНК в клетки.

Дендримеры представляют собой разветвленные трехмерные структуры, содержащие центральное ядро, окруженное периферическими положительно заряженными группами, которые способствуют связыванию молекул нуклеиновых кислот и их конденсации [53].

Дендримерные пептиды в основном содержат неприродные е-амидные связи на остатках лизина, которые повышают их устойчивость к протеолитическому расщеплению [54, 55]. Более того, дендримерные пептиды менее токсичны, чем линейные пептиды, содержащие те же комбинации аминокислот [56]. Исследования нескольких типов дендримеров в качестве средств для доставки миРНК дали многообещающие результаты [57].

На основе наших предыдущих результатов [55] и расчетов т ^Шсо молекулярных свойств для достижения положительного заряда и амфифильности, необходимых для проникновения в клетки и связывания

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 283 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения СОУГО-19: разработка и доклинические исследования

миРНК, мы разработали катионный дендримерный пептид KK-46. Положительный заряд был обеспечен остатками аргинина и гистидина на N-концах пептидных ветвей. Дендримерное лизиновое ядро и гидрофобные аминокислотные остатки способствовали повышению амфифильности пептида. Чтобы определить оптимальную концентрацию для использования KK-46 in vivo, мы трансфецировали клетки HEp-2 плазмидой, несущей репортерный ген люциферазы, и обнаружили, что оптимальная концентрация KK-46 для трансфекции составляет 20-25 мкг/мл, а соотношение по массе -20 : 1. Поскольку ДНК и РНК имеют схожую структуру с точки зрения каркаса нуклеиновой кислоты и обладают отрицательным зарядом [57], мы использовали соотношение КК-46/миРНК = 20 : 1 для дальнейших экспериментов.

Помимо определения KK-46 как возможного фармакологически приемлемого носителя для использования in vivo, мы попытались оптимизировать саму молекулу siR-7. Было показано, что потенциальные off-target-эффекты и нежелательные иммуностимулирующие эффекты миРНК, а также их биодеградация могут быть уменьшены путем включения LNA-нуклеотидов в их последовательность.

Нуклеотиды LNA содержат метиленовую связь, соединяющую 2'-кислород и 4'-углерод рибозного кольца, что приводит к снижению конформационной гибкости рибозы [58]. В отдельных случаях молекулы миРНК способны вызывать воспалительную реакцию, воздействуя на систему врожденного иммунитета путем активации Toll-подобных рецепторов [59]. Было показано, что включение LNA в состав миРНК ингибирует такую нежелательную иммунную стимуляцию. В частности, модификация LNA на 3'-конце цепи миРНК сильно подавляла индукцию ИФН-а, не влияя на основную активность миРНК [60]. Более того, включение LNA может повышать устойчивость миРНК к эндо- и экзо-нуклеазам и снижать off-target-эффекты [61]. Поэтому мы включили LNA-нуклеотиды на 5'- и З'-концах смысловой и антисмысловой цепей siR-7, чтобы улучшить ее стабильность и функциональность. Обнаружено, что это значительно увеличивает время полужизни модифицированной миРНК по сравнению с немодифицирован-ной (см. рис. 3).

Затем мы исследовали, может ли LNA-модифика-ция оказывать негативное влияние на эффективность подавления активности генов-мишеней. Для этой цели мы трансфецировали клетки Vero E6 комплексом пептида КК-46 с немодифицированной siR-7 или LNA-мо-дифицированной siR-7-EM (см. рис. 4) и обнаружили, что LNA-модификация не влияла на сайленсинг специфического вирусного гена, что согласуется с предыдущим исследованием [61]. Было продемонстрировано, что существует вероятность неспецифического эффекта миРНК через Toll-подобный рецептор 3 (TLR3) [62]. Однако эксперименты, проведенные на инфицированных SARS-CoV-2 клетках Vero, экспрессирующих TLR3,

с контрольной миРНК siLuc, показали отсутствие такого ТЪЯЗ-зависимого неспецифического эффекта для siR-7 и siR-7-EM (см. рис. 4).

Таким образом, мы смогли создать комплекс LNA-модифицированной siR-7-EM, нацеленной на ген RdRp SARS-CoV-2, с дендримерным пептидом KK-46. Этот комплекс показал выраженную и специфическую противовирусную активность in vitro, подавляя репликацию вируса в 10 000 раз.

Было показано, что при местном применении миРНК очень эффективны для ингибирования репликации вируса простого герпеса (ВПГ) и РСВ в моделях на животных [63, 64]. Поэтому мы предусмотрели местное введение разработанного комплекса в легкие путем ингаляций. Легкие являются основной мишенью SARS-CoV-2 в связи с высокой экспрессией рецептора ACE2 [65]. Кроме того, имеются устройства - небулайзеры или ингаляторы, которые используются в медицинской практике для создания аэрозолей при ингаляционной доставке лекарств [66].

Для исследований in vivo мы использовали модель SARS-CoV-2-инфекции на сирийских хомячках, которая, как было показано, является подходящей для воспроизведения COVID-19 на мелких животных [67] и тестирования новых препаратов и вакцин [17, 68].

Поскольку, как показало исследование фармакоки-нетики, период полувыведения комплекса siR-7-EM/ KK-46 после ингаляции был относительно коротким (23 мин), мы проводили ежедневную экспериментальную терапию инфицированных животных дозами препарата 0,7; 1,96 или 5,6 мг/кг в день и оценивали эффект через 2 и 6 дней. Мы обнаружили дозозависимое снижение вирусной нагрузки в ткани легких и, что также важно, уменьшение воспаления легких по сравнению с инфицированными животными, которые не получали терапии. Кроме того, мы провели дополнительные исследования по оценке более низких доз и более частого введения (2 ингаляции в сутки вместо одной), которые подтвердили, что ежедневная терапия двукратными ингаляциями комплекса siR-7-EM/KK-46 снижает вирусную нагрузку (более чем в 200 раз) и воспаление в легких. В совокупности эксперименты in vivo показали, что доза 3,453 мг/кг в день оптимальна для уменьшения вирусной нагрузки в легких.

Эффект экспериментального лечения с использованием комплекса siR-7-EM/KK-46 можно оценить, сравнив результаты нашего исследования с данными, полученными при использовании моноклональных антител REGN10987 и REGN10933, которые также испытыва-лись в аналогичной модели на сирийских хомячках [17]. В этом исследовании профилактическое лечение незначительно снижало вирусную нагрузку (и способствовало уменьшению воспаления в легких). Как показало наше исследование, терапевтический эффект комплекса siR-7-EM/KK-46 значительно более выражен.

На основе комплекса siR-7-EM/KK-46 разработан лекарственный препарат МИР 19, предназначенный для лечения пациентов с SARS-CoV-2-инфекцией/

СОУГО-19. МИР 19 стал первым в мире лекарственным препаратом на основе миРНК, специфически подавляющим репликацию 8АЯ8-СоУ-2.

Заключение

Описан процесс разработки инновационного препарата МИР 19 (Б1Я-7-ЕМЖК-46). Продемонстрированы специфические антивирусные свойства препарата

в отношении SARS-CoV-2 (способность подавлять репликацию вируса в экспериментальных моделях in vitro и in vivo). Показана способность препарата при ингаляционном введении улучшать состояние тканей легких у экспериментальных животных, уменьшая вирус-ин-дуцированное воспаление. Разработана лекарственная форма препарата и предложен оптимальный способ его введения - ингаляция.

■ Литература

1. Azkur A.K., Akdis M., Azkur D., Sokolowska M. et al. Immune response to SARS-CoV-2 and mechanisms of immunopathological changes in COVID-19. Allergy. 2020; 75: 1564-81. DOI: https://doi.org/10.1111/ ALL.14364

2. Zhang J., Dong X., Cao Y., Yuan Y. et al. Clinical characteristics of 140 patients infected with SARS-CoV-2 in Wuhan, China. Allergy. 2020; 75: 1730-41. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14238

3. Пащенков М.В., Хаитов М.Р. Иммунный ответ против эпидемических коронавирусов. Иммунология. 2020; 41 (1): 5-18. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-1-5-18

4. Tang D., Comish P, Kang R. The hallmarks of COVID-19 disease. PLoS Pathog. 2020; 16: e1008536. DOI: https://doi.org/10.1371/journal. ppat.1008536

5. Morens D.M., Folkers G.K., Fauci A.S. Emerging infections: a perpetual challenge. Lancet Infect. Dis. 2008; 8: 710-9. DOI: https://doi. org/10.1016/S1473-3099(08)70256-1

6. Morens D.M., Breman J.G., Calisher C.H., Doherty P.C. et al. The origin of COVID-19 and why it matters. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2020; 103: 955-9. DOI: https://doi.org/10.4269/ajtmh.20-0849

7. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatullin A.I. et al. Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based he-terologous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies from Russia. The Lancet. 2020; 396: 887-97. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31866-3

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

8. Krammer F. SARS-CoV-2 vaccines in development. Nature. 2020; 586: 7830; 586: 516-27. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2798-3

9. Гудима Г.О., Хаитов Р.М., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Молеку-лярно-иммунологические аспекты диагностики, профилактики и лечения коронавирусной инфекции. Иммунология. 2021. Т. 42, № 3. С. 198-210. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210

10. Pan H., Peto R., Henao-Restrepo A-M., Preziosi M-P. et al. Re-purposed antiviral drugs for Covid-19 - interim WHO solidarity trial results. N. Engl. J. Med. 2021; 384: 497-511. DOI: https://doi.org/10.1056/ NEJMoa2023184

11. Beigel J.H., Tomashek K.M., Dodd L.E., Mehta A.K. et al. Rem-desivir for the treatment of Covid-19 - Final Report. N. Engl. J. Med. 2020; 383: 1813-26. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMOA2007764

12. Liu S.T.H., Lin H.M., Baine I., Wajnberg A. et al. Convalescent plasma treatment of severe COVID-19: a propensity score-matched control study. Nat. Med. 2020; 26: 1708-13. DOI: https://doi.org/10.1038/S41591-020-1088-9

13. Gudima G., Kofiadi I., Shilovskiy I., Kudlay D., Khaitov M. Antiviral Therapy of COVID-19. Int. J. Mol. Sciences. 2023; 24(10): 8867. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24108867

14. Tanne J.H. COVID-19: FDA approves use of convalescent plasma to treat critically ill patients. BMJ. 2020; 368: m1256. DOI: https://doi. org/10.1136/bmj.m1256

15. Chalmers J.D., Crichton M.L., Goeminne P.C., Cao B., Humbert M., Shteinberg M., Antoniou K.M., Ulrik C.S., Parks H., Wang C. et al. Management of hospitalised adults with coronavirus disease 2019 (COVID-19):AEuropean Respiratory Society Living Guideline. Eur. Respir. J. 2021; 57 (4): 2100048. DOI: https://doi.org/10.1183/13993003.00048-2021

16. Therapeutics and COVID-19: living guideline, 13 January 2023. URL: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-2019-nCoV-therapeutics-2023.1

17. Baum A., Ajithdoss D., Copin R., Zhou A. et al. REGN-COV2 antibodies prevent and treat SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques and hamsters. Science. 2020; 370: 1110-5. DOI: https://doi.org/10.1126/ SCIENCE.ABE2402

18. Weinreich D.M., Sivapalasingam S., Norton T., Ali S. et al. REGN-COV2, a neutralizing antibody cocktail, in outpatients with Covid-19. N. Engl. J. Med. 2021; 384: 238-51. DOI: https://doi. org/10.1056/NEJM0A2035002

19. Harrison A.G., Lin T., Wang P. Mechanisms of SARS-CoV-2 transmission and pathogenesis. Trends Immunol. 2020; 41: 1100-15. https://doi.org/10.1016Zj.it.2020.10.004

20. Thi Nhu Thao T., Labroussaa F., Ebert N., V'kovski P.J. et al. Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform. Nature. 2020; 582: 7813; 582: 561-5. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41586-020-2294-9

21. V'kovski P., Kratzel A., Steiner S., Stalder H., Thiel V. Coronavi-rus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 2020; 19: 3; 19: 155-70. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41579-020-00468-6

22. McManus M.T., Sharp P.A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet. 2002; 3: 737-47. DOI: https://doi. org/10.1038/NRG908

23. Qin X.F., An D.S., Chen I.S.Y., Baltimore D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003; 100: 183-8. DOI: https://doi.org/10.1073/PNAS.232688199

24. Carmichael G.G. Medicine: silencing viruses with RNA. Nature. 2002; 418: 379-80. DOI: https://doi.org/10.1038/418379A

25. Jacque J.M., Triques K., Stevenson M. Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature. 2002; 418: 435-8. DOI: https://doi. org/10.1038/NATURE00896

26. Ahlquist P. RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silencing. Science. 2002; 296: 1270-3. DOI: https://doi.org/10.1126/SCI-ENCE.1069132

27. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature/ 1998; 391: 806-11. DOI: https://doi.org/10.1038/35888

28. Agrawal N., Dasaradhi P.V.N., Mohmmed A., Malhotra P. et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Micro-biol. Mol. Biol. Rev. 2003; 67: 657-85. DOI: https://doi.org/10.1128/ MMBR.67.4.657-685.2003

29. Imai M., Iwatsuki-Horimoto K.. , Hatta M, Loeber S. et al. Syrian hamsters as a small animal model for SARS-CoV-2 infection and counter-measure development. Proc. Natl. Acad. Sci. 2020; 117: 16587-95. DOI: https://doi.org/10.1073/PNAS.2009799117

30. Faizuloev E., Marova A., Nikonova A., Volkova I. et al. Water-soluble N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium)propyl]chitosan chloride as a nucleic acids vector for cell transfection. Carbohydr. Polym. 2012; 89: 1088-94. DOI: https://doi.org/10.1016/J.CARBPOL.2012.03.071

31. Khaitov M., Nikonova A., Shilovskiy I., Kozhikhova K., Kofiadi I., Vishnyakova L., Nikolsky A., Gattinger P., Kovchina V., Barvinskaya E., Yumashev K., Smirnov V., Maerle A., Kozlov I., Shatilov A., Timofeeva A., Andreev S., Koloskova O., Kuznetsova N., Vasina D., Nikiforova M., Ry-balkin S., Sergeev I., Trofimov D., Martynov A., Berzin I., Gushchin V., Kovalchuk A., Borisevich S., Valenta R., Khaitov R., Skvortsova V. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14850

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 285 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения СОУГО-19: разработка и доклинические исследования

32. Gattinger P., Borochova K., Dorofeeva Y., Henning R. et al. Antibodies in serum of convalescent patients following mild COVID-19 do not always prevent virus-receptor binding. Allergy. 2021; 76: 878-83. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14523

33. Сыромятникова С.И., Писцов М.Н., Борисевич С.В., Хамитов Р.А. и др. Состав агарового покрытия для титрования методом негативных колоний коронавируса - возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома. Россия. 2008: RU2325436C2.

34. Mook O.R., Baas F., de Wissel M.B., Fluiter K. Evaluation of locked nucleic acid-modified small interfering RNA in vitro and in vivo. Mol. Cancer Ther. 2007; 6: 833-43. DOI: https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-06-0195

35. Prakash T.P., Allerson C.R., Dande P., Vickers T.A. et al. Positional effect of chemical modifications on short interference RNA activity in mammalian cells. J. Med. Chem. 2005; 48: 4247-53. DOI: https://doi. org/10.1021/JM050044O

36. Piasecka J., Lenartowicz E., Soszynska-Jozwiak M., Szutkow-ska B. et al. RNA secondary structure motifs of the influenza a virus as targets for siRNA-mediated RNA interference. Mol. Ther. Nucleic. Acids. 2020; 19: 627-42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.omtn.2019.12.018

37. Liu Y.C., Kuo R.L., Shih S.R. COVID-19: The first documented coronavirus pandemic in history. Biomed J. 2020; 43: 328-33. DOI: https://doi.org/10.1016ZJ.BJ.2020.04.007

38. Jomah S., Asdaq S.M.B., Al-Yamani M.J. Clinical efficacy of antivirals against novel coronavirus (COVID-19): A review. J. Infect. Public Health. 2020; 13: 1187-95. DOI: https://doi.org/10.1016J. JIPH.2020.07.013

39. Hu B., Weng Y., Xia X., Liang X., Huang Y. Clinical advances of siRNA therapeutics. J. Gene. Med. 2019; 21: e3097. DOI: https://doi. org/10.1002/jgm.3097

40. Levanova A., Poranen M.M. RNA interference as a prospective tool for the control of human viral infections. Front Microbiol. 2018; 9: 2151. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02151

41. Li T., Zhang Y., Fu L., Yu C. et al. siRNA targeting the leader sequence of SARS-CoV inhibits virus replication. Gene Ther. 2005; 12: 751-61. DOI: https://doi.org/10.1038/SJ.GT.3302479

42. Lu A., Zhang H., Zhang X., Wang H. et al. Attenuation of SARS coronavirus by a short hairpin RNA expression plasmid targeting RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 2004; 324: 84-9. DOI: https://doi. org/10.1016/j.virol.2004.03.031

43. Zhang Y., Li T., Fu L., Yu C. et al. Silencing SARS-CoV Spike protein expression in cultured cells by RNA interference. FEBS Lett. 2004; 560: 141-6. DOI: https://doi.org/10.1016/S0014-5793(04)00087-0

44. He M.L., Zheng B., Peng Y., Peiris J.S.M. et al. Inhibition of SARS-associated coronavirus infection and replication by RNA interference. JAMA. 2003; 290: 2665-6. DOI: https://doi.org/10.1001/ JAMA.290.20.2665

45. Tang Q., Li B., Woodle M., Lu P.Y. Application of siRNA against SARS in the rhesus macaque model. Methods Mol. Biol. 2008; 442: 13958. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-59745-191-8-11

46. Li B.J., Tang Q., Cheng D., Qin C. et al. Using siRNA in prophylactic and therapeutic regimens against SARS coronavirus in Rhesus macaque. Nature Medicine. 2005; 11: 9; 11: 944-51. DOI: https://doi. org/10.1038/nm1280

47. Chen W., Feng P., Liu K., Wu M., Lin H. Computational identification of small interfering RNA targets in SARS-CoV-2. Virol. Sin. 2020; 35: 359-61. DOI: https://doi.org/10.1007/s12250-020-00221-6

48. Rothe D., Wade E.J., Kurreck J. Design of small interfering RNAs for antiviral applications. Methods Mol. Biol. 2011; 721: 267-92. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-61779-037-9-17

49. Хаитов М.Р., Шиловский И.П., Кофиади И.А., Сергеев И.В. и др. Средство для ингибирования репликации вируса SARS-CoV-2, опосредованного РНК-интерференцией. Россия. 2020: RU2733361C1.

50. Lam J.K-W., Liang W., Chan H-K. Pulmonary delivery of therapeutic siRNA. Adv. Drug Deliv. Rev. 2012; 64: 1-15. DOI: https://doi. org/10.1016/j.addr.2011.02.006

51. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N. et al. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum. Gene Ther. 2014; 25: 642-50. DOI: https://doi. org/10.1089/HUM.2013.142

52. Nikonova A., Shilovskiy I., Galitskaya M., Sokolova A. et al. Respiratory syncytial virus upregulates IL-33 expression in mouse model of virus-induced inflammation exacerbation in OVA-sensitized mice and in asthmatic subjects. Cytokine. 2021; 138: 155349. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cyto.2020.155349

53. Santos A., Veiga F., Figueiras A. Dendrimers as pharmaceutical excipients: synthesis, properties, toxicity and biomedical applications. Materials. 2019; 13: 65. DOI: https://doi.org/10.3390/ma13010065

54. Luo K., Li C., Wang G., Nie Y., et al. Peptide dendrimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization. J Control Release. 2011; 155: 77-87. DOI: https://doi. org/10.1016/J.JCONREL.2010.10.006

55. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V. et al. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org. Biomol. Chem. 2018; 16: 8181-90. DOI: https:// doi.org/10.1039/C8OB02039F

56. Eggimann G.A., Blattes E., Buschor S., Biswas R. et al. Designed cell penetrating peptide dendrimers efficiently internalize cargo into cells. Chem. Commun. 2014; 50: 7254-7. DOI: https://doi.org/10.1039/ C4CC02780A

57. Wu J., Huang W., He Z. Dendrimers as carriers for siRNA delivery and gene silencing: A review. The Scientific World Journal. 2013; 2013: 630654. DOI: https://doi.org/10.1155/2013/630654

58. Braasch D.A., Corey D.R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 2001; 8: 1-7. DOI: https://doi.org/10.1016/S1074-5521(00)00058-2

59. Meng Z., Lu M. RNA interference-induced innate immunity, offtarget effect, or immune adjuvant? Front Immunol. 2017; 8: 331. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00331

60. Jackson A.L., Linsley P.S. Recognizing and avoiding siRNA offtarget effects for target identification and therapeutic application. Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9: 57-67. DOI: https://doi.org/10.1038/NRD3010

61. Elmén J., Thonberg H., Ljungberg K., Frieden M. et al. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality. Nucleic Acids Res. 2005; 33: 439-47. DOI: https://doi. org/10.1093/NAR/GKI193

62. Kleinman M.E., Yamada K., Takeda A., Chandrasekaran V., et al. Sequence- and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3. Nature. 2008; 452: 591-7. DOI: https://doi.org/10.1038/ NATURE06765

63. Paavilainen H., Lehtinen J., Romanovskaya A., Nygardas M., et al. Topical treatment of herpes simplex virus infection with enzymati-cally created siRNA swarm. Antivir Ther. 2017; 22: 631-7. DOI: https:// doi.org/10.3851/IMP3153

64. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA. Nat. Med. 2005; 11: 50-5. DOI: https://doi.org/10.1038/NM1164

65. Zou X., Chen K., Zou J., Han P. et al. Single-cell RNA-seq data analysis on the receptor ACE2 expression reveals the potential risk of different human organs vulnerable to 2019-nCoV infection. Front Med. 2020; 14: 185-92. DOI: https://doi.org/10.1007/S11684-020-0754-0

66. Youngren-Ortiz S.R., Gandhi N.S., España-Serrano L., Chougu-le M.B. Aerosol delivery of siRNA to the lungs. Part 1: Rationale for gene delivery systems. KONA Powder and Particle Journal. 2016; 33: 63-85. DOI: https://doi.org/10.14356/kona.2016014

67. Muñoz-Fontela C., Dowling W.E., Funnell S.G.P., Gsell P.S. et al. Animal models for COVID-19. Nature. 2020; 586: 509-15. DOI: https:// doi.org/10.1038/S41586-020-2787-6

68. Tostanoski L.H., Wegmann F., Martinot A.J., Loos C. et al. Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nat. Med. 2020; 26: 1694-700. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-1070-6

■ References

1. Azkur A.K., Akdis M., Azkur D., Sokolowska M., et al. Immune re- in COVID-19. Allergy. 2020; 75: 1564-81. DOI: https://doi.org/10.1111/ sponse to SARS-CoV-2 and mechanisms of immunopathological changes ALL.14364

2. Zhang J., Dong X., Cao Y., Yuan Y., et al. Clinical characteristics of 140 patients infected with SARS-CoV-2 in Wuhan, China. Allergy. 2020; 75: 1730-41. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14238

3. Pashenkov M.V., Khaitov M.R. Immune response against epidemic coronaviruses. Immunologiya. 2020; 41 (1): 5-18. DOI: 10.33029/02064952-2020-41-1-5-18 (in Russian)

4. Tang D., Comish P., Kang R. The hallmarks of COVID-19 disease. PLoS Pathog. 2020; 16: e1008536. DOI: https://doi.org/10.1371/journal. ppat.1008536

5. Morens D.M., Folkers G.K., Fauci A.S. Emerging infections: a perpetual challenge. Lancet Infect Dis. 2008; 8: 710-9. DOI: https://doi. org/10.1016/S1473-3099(08)70256-1

6. Morens D.M., Breman J.G., Calisher C.H., Doherty P.C., et al. The origin of COVID-19 and why it matters. Am J Trop Med Hyg. 2020; 103: 955-9. DOI: https://doi.org/10.4269/ajtmh.20-0849

7. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatullin A.I., et al. Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterol-ogous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies from Russia. The Lancet. 2020; 396: 887-97. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31866-3

8. Krammer F. SARS-CoV-2 vaccines in development. Nature. 2020; 586: 7830; 586: 516-27. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2798-3

9. Gudima G.O., Khaitov R.M., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Molecular immunological aspects of diagnostics, prevention and treatment of coro-navirus infection. Immunologiya. 2021; 42 (3): 198-210. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210 (in Russian)

10. Pan H., Peto R., Henao-Restrepo A-M., Preziosi M-P., et al. Repur-posed antiviral drugs for Covid-19 - interim WHO solidarity trial results. N Engl J Med. 2021; 384: 497-511. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJ-Moa2023184

11. Beigel J.H., Tomashek K.M., Dodd L.E., Mehta A.K., et al. Rem-desivir for the treatment of COVID-19 - Final Report. N Engl J Med. 2020; 383: 1813-26. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMOA2007764

12. Liu S.T.H., Lin H.M., Baine I., Wajnberg A., et al. Convalescent plasma treatment of severe COVID-19: a propensity score-matched control study. Nat Med. 2020; 26: 1708-13. DOI: https://doi.org/10.1038/S41591-020-1088-9

13. Gudima G., Kofiadi I., Shilovskiy I., Kudlay D., Khaitov M. Antiviral Therapy of COVID-19. Int. J. Mol. Sciences. 2023; 24(10): 8867. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24108867

14. Tanne J.H. COVID-19: FDA approves use of convalescent plasma to treat critically ill patients. BMJ. 2020; 368: m1256. DOI: https://doi. org/10.1136/bmj.m1256

15. Chalmers J.D., Crichton M.L., Goeminne P.C., Cao B., Humbert M., Shteinberg M., Antoniou K.M., Ulrik C.S., Parks H., Wang C., et al. Management of hospitalised adults with coronavirus disease 2019 (COVID-19): A European Respiratory Society Living Guideline. Eur Respir J. 2021; 57 (4): 2100048. DOI: https://doi.org/10.1183/13993003.00048-2021

16. Therapeutics and COVID-19: Living Guideline, 13 January 2023. URL: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-2019-nCoV-therapeutics-2023.1

17. Baum A., Ajithdoss D., Copin R., Zhou A., et al. REGN-COV2 antibodies prevent and treat SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques and hamsters. Science. 2020; 370: 1110-5. DOI: https://doi.org/10.1126/SCI-ENCE.ABE2402

18. Weinreich D.M., Sivapalasingam S., Norton T., Ali S., et al. REGN-COV2, a neutralizing antibody cocktail, in outpatients with COVID-19. N Engl J Med. 2021; 384: 238-51. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJ-MOA2035002

19. Harrison A.G., Lin T., Wang P. Mechanisms of SARS-CoV-2 transmission and pathogenesis. Trends Immunol. 2020; 41: 1100-15. DOI: https://doi.org/10.1016/j.it.2020.10.004

20. Thi Nhu Thao T., Labroussaa F., Ebert N., V'kovski P. J., et al. Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform. Nature. 2020; 582: 7813; 582: 561-5. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2294-9

21. V'kovski P., Kratzel A., Steiner S., Stalder H., Thiel V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 2020; 19: 3; 19: 155-70. DOI: https://doi.org/10.1038/s41579-020-00468-6

22. McManus M.T., Sharp P.A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 2002; 3: 737-47. DOI: https://doi. org/10.1038/NRG908

23. Qin X.F., An D.S., Chen I.S.Y., Baltimore D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci. 2003; 100: 183-8. DOI: https://doi. org/10.1073/PNAS.232688199

24. Carmichael G.G. Medicine: silencing viruses with RNA. Nature. 2002; 418: 379-80. DOI: https://doi.org/10.1038/418379A

25. Jacque J.M., Triques K., Stevenson M. Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature. 2002; 418: 435-8. DOI: https://doi. org/10.1038/NATURE00896

26. Ahlquist P. RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silencing. Science. 2002; 296: 1270-3. DOI: https://doi.org/10.1126/SCI-ENCE.1069132

27. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis ele-gans. Nature/1998; 391: 806-11. DOI: https://doi.org/10.1038/35888

28. Agrawal N., Dasaradhi P.V.N., Mohmmed A., Malhotra P., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 2003; 67: 657-85. DOI: https://doi.org/10.1128/ MMBR.67.4.657-685.2003

29. Imai M., Iwatsuki-Horimoto K., Hatta M., Loeber S., et al. Syrian hamsters as a small animal model for SARS-CoV-2 infection and coun-termeasure development. Proc Natl Acad Sci. 2020; 117: 16587-95. DOI: https://doi.org/10.1073/PNAS.2009799117

30. Faizuloev E., Marova A., Nikonova A., Volkova I., et al. Water-soluble N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium)propyl]chitosan chloride as a nucleic acids vector for cell transfection. Carbohydr Polym. 2012; 89: 108894. DOI: https://doi.org/10.1016J.CARBPOL.2012.03.071

31. Khaitov M., Nikonova A., Shilovskiy I., Kozhikhova K., Kofiadi I., Vishnyakova L., Nikolsky A., Gattinger P., Kovchina V., Barvinskaya E., Yumashev K., Smirnov V., Maerle A., Kozlov I., Shatilov A., Timofeeva A., Andreev S., Koloskova O., Kuznetsova N., Vasina D., Nikiforova M., Ry-balkin S., Sergeev I., Trofimov D., Martynov A., Berzin I., Gushchin V., Kovalchuk A., Borisevich S., Valenta R., Khaitov R., Skvortsova V. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14850

32. Gattinger P., Borochova K., Dorofeeva Y., Henning R., et al. Antibodies in serum of convalescent patients following mild COVID-19 do not always prevent virus-receptor binding. Allergy. 2021; 76: 878-83. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14523

33. Syromjatnikova S., Pistsov M., Borisevich S., Khamitov R. et al. Agar overlay medium formulation applied for negative clump titration of coronavirus - pathogenic agent of serious acute respiratory syndrome. Russia. 2008: RU2325436C2. (in Russian)

34. Mook O.R., Baas F., de Wissel M.B., Fluiter K. Evaluation of locked nucleic acid-modified small interfering RNA in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther. 2007; 6: 833-43. DOI: https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-06-0195

35. Prakash T.P., Allerson C.R., Dande P., Vickers T.A., et al. Positional effect of chemical modifications on short interference RNA activity in mammalian cells. J Med Chem 2005; 48: 4247-53. DOI: https://doi.org/10.1021/ JM050044O

36. Piasecka J., Lenartowicz E., Soszynska-Jozwiak M., Szutkowska B., et al. RNA secondary structure motifs of the influenza a virus as targets for siRNA-mediated RNA interference. Mol Ther Nucleic Acids. 2020; 19: 62742. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.omtn.2019.12.018

37. Liu Y.C., Kuo R.L., Shih S.R. COVID-19: The first documented coronavirus pandemic in history. Biomed J. 2020; 43: 328-33. DOI: https:// doi.org/10.1016/J.BJ.2020.04.007

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

38. Jomah S., Asdaq S.M.B., Al-Yamani M.J. Clinical efficacy of antivi-rals against novel coronavirus (COVID-19): A review. J Infect Public Health. 2020; 13: 1187-95. DOI: https://doi.org/10.1016/JJIPH.2020.07.013

39. Hu B., Weng Y., Xia X., Liang X., Huang Y. Clinical advances of siR-NA therapeutics. J Gene Med. 2019; 21: e3097. DOI: https://doi.org/10.1002/ jgm.3097

40. Levanova A., Poranen M.M. RNA interference as a prospective tool for the control of human viral infections. Front Microbiol. 2018; 9: 2151. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02151

41. Li T., Zhang Y., Fu L., Yu C., et al. siRNA targeting the leader sequence of SARS-CoV inhibits virus replication. Gene Ther. 2005; 12: 75161. DOI: https://doi.org/10.1038/SJ.GT.3302479

42. Lu A., Zhang H., Zhang X., Wang H,. et al. Attenuation of SARS coronavirus by a short hairpin RNA expression plasmid targeting RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 2004; 324: 84-9. DOI: https://doi. org/10.1016/j.virol.2004.03.031

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 287 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования

43. Zhang Y., Li T., Fu L., Yu C., et al. Silencing SARS-CoV Spike protein expression in cultured cells by RNA interference. FEBS Lett. 2004; 560: 141-6. DOI: https://doi.org/10.1016/S0014-5793(04)00087-0

44. He M.L., Zheng B., Peng Y., Peiris J.S.M., et al. Inhibition of SARS-associated coronavirus infection and replication by RNA interference. JAMA. 2003; 290: 2665-6. DOI: https://doi.org/10.1001/JAMA.290.20.2665

45. Tang Q., Li B., Woodle M., Lu P.Y. Application of siRNA against SARS in the rhesus macaque model. Methods Mol Biol. 2008; 442: 139-58. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-59745-191-8-11

46. Li B.J., Tang Q., Cheng D., Qin C., et al. Using siRNA in prophylactic and therapeutic regimens against SARS coronavirus in Rhesus macaque. Nature Medicine. 2005; 11: 9; 11: 944-51. DOI: https://doi.org/10.1038/nm1280

47. Chen W., Feng P., Liu K., Wu M., Lin H. Computational identification of small interfering RNA targets in SARS-CoV-2. Virol Sin. 2020; 35: 359-61. DOI: https://doi.org/10.1007/s12250-020-00221-6

48. Rothe D., Wade E.J., Kurreck J. Design of small interfering RNAs for antiviral applications. Methods Mol Biol. 2011; 721: 267-92. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-61779-037-9-17

49. Khaitov M., Shilovskij I., Kofiadi I., Sergeev I., et al. Agent for inhibition of replication of SARS-CoV-2 virus mediated by RNA interference. Russia. 2020: RU2733361C1. (in Russian)

50. Lam J.K-W., Liang W., Chan H-K. Pulmonary delivery of therapeutic siRNA. Adv Drug Deliv Rev. 2012; 64: 1-15. DOI: https://doi. org/10.1016/j.addr.2011.02.006

51. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N. et al. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syn-cytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum Gene Ther. 2014; 25: 642-50. DOI: https://doi. org/10.1089/HUM.2013.142

52. Nikonova A., Shilovskiy I., Galitskaya M., Sokolova A. et al. Respiratory syncytial virus upregulates IL-33 expression in mouse model of virus-induced inflammation exacerbation in OVA-sensitized mice and in asthmatic subjects. Cytokine. 2021; 138: 155349. DOI: https://doi.org/10.1016/j. cyto.2020.155349

53. Santos A., Veiga F., Figueiras A. Dendrimers as pharmaceutical excipients: synthesis, properties, toxicity and biomedical applications. Materials. 2019; 13: 65. DOI: https://doi.org/10.3390/ma13010065

54. Luo K., Li C., Wang G., Nie Y., et al. Peptide dendrimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization. J Control Release. 2011; 155: 77-87. DOI: https://doi.org/10.1016/J. JCONREL.2010.10.006

55. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V., et al. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org Biomol Chem. 2018; 16: 8181-90. DOI: https://doi. org/10.1039/C8OB02039F

Сведения об авторах

Хаитов Муса Рахимович - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; зав. каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4961-9640

Никонова Александра Александровна - канд. биол. наук, зав. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова Минобрнауки России; мл. науч. сотр. лаб. персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9610-0935

Шиловский Игорь Петрович - д-р биол. наук, зам. директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5343-4230

56. Eggimann G.A., Blattes E., Buschor S., Biswas R., et al. Designed cell penetrating peptide dendrimers efficiently internalize cargo into cells. Chem. Commun. 2014; 50: 7254-7. DOI: https://doi.org/10.1039/ C4CC02780A

57. Wu J., Huang W., He Z. Dendrimers as carriers for siRNA delivery and gene silencing: A review. The Scientific World Journal. 2013; 2013: 630654. DOI: https://doi.org/10.1155/2013/630654

58. Braasch D.A., Corey D.R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 2001; 8: 1-7. DOI: https://doi. org/10.1016/S1074-5521(00)00058-2

59. Meng Z., Lu M. RNA interference-induced innate immunity, offtarget effect, or immune adjuvant? Front Immunol. 2017; 8: 331. DOi: https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00331

60. Jackson A.L., Linsley P.S. Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application. Nat Rev Drug Discov. 2010; 9: 57-67. DOI: https://doi.org/10.1038/ NRD3010

61. Elmén J., Thonberg H., Ljungberg K., Frieden M., et al. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality. Nucleic Acids Res. 2005; 33: 439-47. DOI: https://doi.org/10.1093/ NAR/GKI193

62. Kleinman M.E., Yamada K., Takeda A., Chandrasekaran V. et al. Sequence- and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3. Nature. 2008; 452: 591-7. DOI: https://doi.org/10.1038/NATURE06765

63. Paavilainen H., Lehtinen J., Romanovskaya A., Nygârdas M., et al. Topical treatment of herpes simplex virus infection with enzymati-cally created siRNA swarm. Antivir Ther. 2017; 22: 631-7. DOI: https://doi. org/10.3851/IMP3153

64. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA. Nat Med. 2005; 11: 50-5. DOI: https://doi.org/10.1038/NM1164

65. Zou X., Chen K., Zou J., Han P., et al. Single-cell RNA-seq data analysis on the receptor ACE2 expression reveals the potential risk of different human organs vulnerable to 2019-nCoV infection. Front Med. 2020; 14: 185-92. DOI: https://doi.org/10.1007/S11684-020-0754-0

66. Youngren-Ortiz S.R., Gandhi N.S., España-Serrano L., Chougu-le M.B. Aerosol delivery of siRNA to the lungs. Part 1: Rationale for gene delivery systems. KONA Powder and Particle Journal. 2016; 33: 63-85. DOI: https://doi.org/10.14356/kona.2016014

67. Muñoz-Fontela C., Dowling W.E., Funnell S.G.P., Gsell P.S. et al. Animal models for COVID-19. Nature. 2020; 586: 509-15. DOI: https://doi. org/10.1038/S41586-020-2787-6

68. Tostanoski L.H., Wegmann F., Martinot A.J., Loos C., et al. Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nat Med. 2020; 26: 1694-700. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-1070-6

Authors' information

Musa R. Khaitov - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Prof., Director, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Head of the Immunology Chair, MBF of N.I. Pi-rogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4961-9640

Aleksandra A. Nikonova - PhD, Head of Molecular Biotechnology Lab. of I.I. Mechnikov RIVS of the MSHE of Russia; Junior Researcher of the Personalized Medicine and Molecular Immunology Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9610-0935

Igor P. Shilovskiy - Dr.Sci, PhD, Deputy Director on Science and Innovation, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5343-4230

Кожихова Ксения Вадимовна - канд. хим. наук, ст. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5124-6826X

Кофиади Илья Андреевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-9280-8282

Гудима Георгий Олегович - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. физиологии иммунитета и аллергии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунопатологии и иммунодиагностики Академии постдипломного образования ФГБУ ФНКЦ ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2864-6949

Вишнякова Людмила Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3555-3268

Никольский Александр Аркадьевич - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4169-0760

Ковчина Валерия Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3134-5776

Тимотиевич Екатерина Драгановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9407-7054

Юмашев Кирилл Валерьевич - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1544-0597

Смирнов Валерий Валерьевич - д-р фарм. наук, зав. лаб. клинической фармакологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-8232-6682

Ksenia V. Kozhikhova - PhD, Senior Researcher of the Peptide Imunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5124-6826X

Ilya A. Kofiadi - Dr.Sci., Head of Molecular Immunoge-netics Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of the Immunology Chair, MBF of N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation

E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-9280-8282

Georgii O. Gudima - Dr. Sci., Prof., Head of Physiology of Immunity and Allergy Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Immunopathology and Im-munodiagnostics Chair, Acad. of Postdiplomal Education, FRCC FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2864-6949

Lyudmila I. Vishniakova - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3555-3268

Aleksandr A. Nikolskii - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4169-0760

Valeriia I. Kovchina - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3134-5776

Ekaterina D. Timotievich - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9407-7054

Kirill V. Yumashev - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1544-0597

Valery V. Smirnov - Dr.Sci., PhD, Head of Clinical Pharmacology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry Chair named after A.P. Arzamastsev, Institute of Pharmacy named after A.P. Neliubin, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-8232-6682

Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И. А., Гущин В. А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. 289 МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования

Маерле Артем Владимирович - науч. сотр. отд. им-муногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]

Козлов Иван Борисович - науч. сотр. лаб. молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1921-7715

Шатилов Артем Андреевич - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4675-8074Х

Шатилова Анастасия Витальевна - мл. науч. сотр. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3780-2878Х

Андреев Сергей Михайлович - канд. хим. наук, зав. лаб. пептидных иммуногенов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8297-579X

Колоскова Олеся Олеговна - канд. биол. наук, и.о. ст. науч сотр. лаборатории персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3949-8582

Кузнецова Надежда Анатольевна - науч. сотр., Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]

Васина Дарья Владимировна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. отдела арбовирусов и экспериментального производства, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, ФГБОУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1965-0700

Никифорова Мария Андреевна - науч. сотр. лаб. механизмов популяционной изменчивости патогенных микроорганизмов, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5823-6508

Artem V. Maerle - Researcher of Immunogenetics Dept., NRC, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]

Ivan B. Kozlov - Researcher of the Molecular Immunogenetics Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1921-7715

Artem A. Shatilov - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4675-8074Х

Anastasia V. Shatilova - Junior Researcher of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3780-2878Х

Sergey M. Andreev - PhD, Head of the Peptide Immunogens Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8297-579X

Olesya O. Koloskova - PhD, Acting Senior Researcher of the Personalized Medicine Lab., NRC Institute of Immunology FMBA, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3949-8582

Nadezhda A. Kuznetsova - Researcher, D.I. Ivanovsky Institute of Virology, «NRCEM named after Honorary Academician N.F. Gamaleya» of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]

Daria V. Vasina - PhD, Senior Researcher of Arboviruses and Experimental Prod. Dept., D.I. Ivanovsky Institute of Virology, «NRCEM named after Honorary Academician N.F. Gamaleya» of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1965-0700

Maria A. Nikiforova - Researcher of the Lab. of Mechanisms of Popular Variability of Pathogenic Microorganisms, D.I. Ivanovsky Institute of Virology, «NRCEM named after Honorary Academician N.F. Gamaleya» of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5823-6508

Рыбалкин Сергей Петрович - д-р биол. наук, директор Научно-исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов - филиала ФГБУ ГНЦ институт иммунологии ФМБА России, Серпухов, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2107-136

Сергеев Илья Викторович - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. отд. иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected]

Трофимов Дмитрий Юрьевич - член-корр. РАН, д-р биол. наук, зав. отд. иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; директор Института репродуктивной генетики ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация Е-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1569-8486

Мартынов Александр Игоревич - канд. мед. наук, первый зам. директора ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9761-8058

Берзин Игорь Александрович - д-р мед. наук, проф., начальник управления организации научных исследований ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]

Гущин Владимир Алексеевич - канд. биол. наук, руководитель лаб. механизмов популяционной изменчивости патогенных микроорганизмов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

https://orcid.org/0000-0002-9397-3762

Ковальчук Алексей Валерьевич - канд. биол. наук, начальник отд. ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад-6, Российская Федерация E-mail: [email protected]

Борисевич Сергей Владимирович - член-корр. РАН, д-р биол. наук, профессор, начальник ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, Сергиев Посад-6, Российская Федерация

E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-6742-3919

Скворцова Вероника Игоревна - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., руководитель ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2815-280X

Sergei P. Rybalkin - MD, PhD, Director of the Res. Center for Toxicology and Hygienic Regulation of Biological Products - Branch of the NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Serpukhov, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2107-136

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Ilya V. Sergeev - PhD, Senior Researcher of Immunoge-netics Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]

Dmitriy Yu. Trofimov - Corr. Member of RAS, Dr.Sci., Head of Immunogenetics Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Director of the Institute of the Reproductive Genetics, VI. Kulakov NMRC OGP, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation Е-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1569-8486

Аlexandr I. Martynov - PhD, First Deputy Director of NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9761-8058

Igor A. Berzin - MD, PhD, Prof., Head of the Dept. of Scientific Research Organization, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]

Vladimir A. Gushchin - PhD, Head of the Lab. of Mechanisms of Popular Variability of Pathogenic Microorganisms, D.I. Ivanovsky Institute of Virology, «NRCEM named after Honorary Academician N.F. Gamaleya» of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation https://orcid.org/0000-0002-9397-3762

Aleksey V. Kovalchuk - PhD, Head of Dept., «48 CSRI» of the MOD of Russia, Sergiev Posad 6, Russian Federation E-mail: [email protected]

Sergey V. Borisevich - Corr. Member of RAS, Dr.Sci., PhD, Prof., Head of «48 CSRI» of the MOD of Russia, Sergiev Posad 6, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-6742-3919

Veronika I. Skvortsova- Corr. Member of RAS, MD, PhD, Prof., Head of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2815-280X

MIR 19® - WORLD FIRST SPECIFIC ANTIVIRAL DRUG FOR COVID-19 TREATMENT: DEVELOPMENT AND PRECLINICAL STUDIES

Текст научной работы на тему «МИР 19® - ПЕРВЫЙ В МИРЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ COVID-19: РАЗРАБОТКА И ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ»