Питательная среда на основе молок рыб для культивирования бактерий Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Известия ТИНРО

2009 Том 157

ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ

УДК 576.8:664.951

Е.А. Зайцева, Л.Н. Фатеева, A.M. Кривошеева, Г.П. Сомов*

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА НА ОСНОВЕ МОЛОК РЫБ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Представлена разработанная жидкая и сухая питательная среда для культивирования различных бактерий на основе молок дальневосточных рыб, обладающая хорошими ростовыми свойствами и накопительным эффектом. Данная среда проста и экономична в изготовлении, легко может быть освоена на производстве. Использование отходов рыбного производства — молок рыб различной стадии зрелости, в том числе текучих, — позволяет расширить отечественную сырьевую базу для приготовления питательных сред.

Ключевые слова: питательная среда, молоки рыб, бактерии, Listeria spp., Yersinia spp.

Zaytseva E.A., Fateeva L.N., Krivosheeva A.M., Somov G.P. Milt-based nutrient medium for bacteria cultivation // Izv. TINRO. — 2009. — Vol. 157. — P. 261-268.

Manufacturing of nutrient mediums requires protein hydrolyzates as specially prepared casein hydrolyzate, enzymatic peptone, soy meal papain broth, calf brain extract, beef heart extract, and others; some of them are rather expensive. Fish milt can be a cheap alternative source of protein for this purpose. Recipe of a new nutrient medium for bacteria cultivation is elaborated and its main parameters are investigated. This medium is based on the milt from fishes dwelling in Far East of Russia (pacific salmons, saffron cod, and herring) and includes also the fodder yeast extract as bacteria growth stimulator, glucose as energy source, and water soluble vitamin B complex. The medium was tested on the strains of bacteria from families Listeria (L. monocytogenes CLIP 75936; L. ivanovii NCTC 11846; L. innocua SLCC 3379; L. seeligeri SLCC 5921; L. grayi) and Yersinia (Y. pseudotuberculosis 2781; Y. enterocolitica 164; Escherihia coli) which had fast growth in the medium of all basic variants comparable with their growth in the control nutrient medium (tryptic soy broth). The most intensive was the growth of bacteria in the medium made of salmon milt (pink and chum). The proposed nutrient medium ensures quick and sustainable bacteria growth due to sufficient amino acid and microelement contents, so it does not require any additional expensive components. Other advantage of the proposed medium is a simple technique of manufacturing.

Key words: culture medium, fish milt, bacteria, Listeria, Yersinia.

* Зайцева Елена Александровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, e-mail: zaytseva@mail.primorye.ru; Фатеева Людмила Николаевна, инженер; Кривошеева Ангелина Михайловна, научный сотрудник; Сомов Георгий Павлович, академик РАМН, руководитель лаборатории, e-mail: zaytseva@mail. primorye.ru.

Введение

В настоящее время существует достаточное количество питательных сред общего назначения для культивирования бактерий (мясо-пептонный бульон, жидкая среда Хоттингера с различным содержанием аминного азота, сердечно-мозговой бульон и др.). Благодаря высокой питательности широкое распространение в последнее время получили казеиново-соевые среды — триптон-соевые и триптиказо-соевые бульоны.

Как правило, питательная среда имеет белковую и углеводную основу, а также дополнительные компоненты, которые усиливают рост бактерий: витамины, аминокислоты, минеральные компоненты. Для приготовления белковой основы чаще всего используют мясные и рыбные бульоны, белковые гидролизаты с различной степенью конверсии белка в смеси олигомеров и аминокислот. Основными источниками сырья для производства таких бульонов являются мясо (преимущественно говяжье), рыба, мясо-костная мука, казеин, плацента, кровь домашних животных, сердце, соевые бобы, горох, ячмень и т.п. В результате эти питательные среды сложны в приготовлении, многокомпонентны и, следовательно, все еще недоступны широкой сети практических лабораторий, занимающихся диагностикой патогенных бактерий. Поэтому разработка простых, недорогих питательных сред для культивирования бактерий, в частности листерий, иерси-ний и им подобных, весьма актуальна.

Одним из видов доступного и недорогого источника белкового сырья природного происхождения являются молоки рыб. В молоках любой стадии зрелости, а тем более в непищевых (5-6-я стадии), т.е. текучих, содержится большое количество дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Молоки рыб содержат нуклеопротеиды, состоящие из нуклеиновых кислот и простейших белков — протаминов и гистонов. Известно, что протамины выделены из молок осетровых (стурин), лососевых (сальмин), сельдевых (клупеин), скумбрии (скобреин), карпа (ципринин) и др.; гистоны найдены в молоках трески, налима и акулы (Дэвидсон, 1968).

Протамины и гистоны построены из аминокислот, среди которых преобладают аргинин, лизин и гистидин. Кроме того, в состав протаминов входят тирозин, триптофан, серин, валин и пролин, а в состав гистонов — серин, валин, аланин, фенилаланин и тирозин. В молоках ряда рыб присутствуют такие водорастворимые витамины, как В12 в количестве от 7 до 50 мкг%; Bj (тиамин) — 50-185; В2 (рибофлавин) — 40-600; Вс (фолиевая кислота) — 125-1300; РР (никотиновая кислота) — 1,1-5,7 мг% и др. (Технология ..., 1965).

Цель данной работы — разработать новую питательную среду для культивирования бактерий на основе молок рыб и изучить ее основные характеристики.

Материалы и методы

Для приготовления среды были использованы молоки разных дальневосточных рыб: лососевых — кеты Oncorhynchus keta, горбуши O. gorbuscha; наваги Eleginus graciclis, красноперки Tribolodon brandti, тихоокеанской сельди Clupea pallasii 3-4-й стадии зрелости.

Контроль качества разрабатываемой питательной среды проводили с тест-штаммами: 1) бактериями рода Listeria — Listeria monocytogenes NCTC 10527 (4b серовариант), L. monocytogenes CLIP 75936 (1 /2a серовариант), L. iva-novii NCTC 11846, L. innocua SLCC 3379, L. seeligeri SLCC 5921, L. grayi, полученными из коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва); 2) бактериями рода Yersinia — Yersinia pseudotuberculosis 2781, Y. enterocolitica 164; 3) Escherihia coli из коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (г. Владивосток). Все культуры бактерий

были типичными по культурально-морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам.

В качестве контрольной среды сравнения использовали триптиказо-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (ТСБ) (производства Научно-исследовательского центра фарматерапии, г. Санкт-Петербург). Культуры бактерий выращивали на плотной питательной среде ГРМ № 1 (г. Оболенск) и среде 67 (Серов, 1978).

Для приготовления питательной среды сначала готовили отвар из молок рыб (Справочник ..., 1982). Отвар можно готовить впрок, хранить в бытовом холодильнике при температуре 4-8 0С до 30 сут и более или лиофильно высушить, а затем использовать по мере необходимости. Сухой отвар из молок рыб можно транспортировать в другие регионы страны, при этом его качества сохраняются.

Для приготовления питательной среды в качестве белковой основы использовали жидкий или сухой (для лососевых) отвар из молок рыб. Среду стерилизовали при 0,5 атм в течение 20 мин.

Полученные варианты питательной среды представляют собой прозрачную жидкость янтарного цвета без запаха. На данную питательную среду подана заявка на патент РФ (Заявка № 2008111691).

Содержание белка в изучаемых средах измеряли на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) с биуретовым реактивом, пептон и аминный азот определяли по общепринятым методам (Методические указания ..., 1982; Об унификации методов ..., 1983).

Для оценки эффективности накопления бактериальной массы из исходной взвеси каждого вида исследуемого тест-штамма бактерий стерильно готовили их 10-кратное разведение путем последовательного переноса 0,5 мл культуры в 8 пробирок с 4,5 мл бульона и тщательного перемешивания. Полученные разведения бактерий в бульоне культивировали в термостате при 37 0С в течение 24-48 ч.

Для изучения ростовых свойств разработанной питательной среды, приготовленной на основе отвара молок различных видов рыб, суточные культуры тест-штаммов бактерий высевали по 0,1 мл из разведения в бульоне 103 КОЕ/мл на 3 чашки с агаровой питательной средой (истинное содержание бактерий в используемой дозе контролировали количественным высевом на плотной среде). Чашки с посевами инкубировали при 37 0С в течение 24-48 ч с ежедневным учетом результатов. Прирост числа бактерий в бульоне определяли до и после их инкубирования.

Для исследования динамики роста бактерий в жидкой питательной среде на основе молок рыб концентрацию биомассы определяли используя величину светорассеяния суспензии культур, измеряемую фотоколориметрически на приборе КФК-2 (Россия) при X = 590 нм и на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) при X = 600 нм. Замеры оптической плотности проводили трижды и рассчитывали средний показатель.

Было проведено 18 серий экспериментов. Все эксперименты по изучению ростовых свойств каждого тест-штамма проводились трижды, с обязательным подсчетом количества колониеобразующих единиц не менее чем в трех чашках для каждого вида бактерий после культивирования их в разных вариантах разработанной питательной среды и с вычислением среднего значения показателя (средняя арифметическая) с помощью программы

Результаты и их обсуждение

Первоначально были подобраны наиболее оптимальные концентрации отваров из молок разных видов рыб для приготовления основы жидкой питательной среды. В ходе экспериментов установлено, что готовый отвар из молок рыб является сильно концентрированным раствором, бактерии растут на нем плохо, медленно. В готовом виде он может представлять собой желеобразный раствор разной плотности в зависимости от того, из молок каких видов рыб он приготовлен.

Поэтому экспериментально было доказано, что для приготовления среды можно использовать разведения первичного отвара в 2-4 раза, что способствует оптимальному и быстрому росту бактерий. Несмотря на то что молоки рыб содержат определенное количество витаминов группы В (Технология ..., 1965), следующим этапом исследований был поиск дополнительных факторов и стимуляторов роста для бактерий, которые могли бы способствовать максимальному накоплению микробных клеток и сокращению сроков появления их роста. В качестве стимуляторов роста и как дополнительный комплекс водорастворимых витаминов группы В использовали экстракт кормовых дрожжей, а в качестве энергетического источника — глюкозу.

Приготовленные из молок разных видов рыб варианты питательной среды исследовали на содержание белка, пептона, аминного азота.

Содержание белка в ТСБ составило 8,56 мг/мл, в экспериментальной питательной среде на основе жидкого отвара из молок лососевых рыб — 11,40 мг/мл, сухого отвара молок лососевых рыб — 9,64, молок тихоокеанской сельди — 9,0, молок наваги — 9,80, молок красноперки — 8,20 мг/мл.

Содержание пептона в ТСБ составило 0,25 %, в питательной среде, приготовленной на основе жидкого и сухого отваров из молок лососевых рыб — по 0,5 %, молок тихоокеанской сельди — 0,5, молок наваги — 0,5, молок красноперки —

0.5 %.

Содержание аминного азота в ТСБ — 50 мг%, в питательной среде на основе жидкого отвара из молок лососевых рыб — 35,0-52,5 мг%, сухого отвара молок лососевых рыб — 28,0-52,5, молок тихоокеанской сельди — 70,0, молок наваги — 77,0, молок красноперки — 70,0 мг%.

После суточного культивирования бактерий при температуре 37 0С в разработанной питательной среде и в ТСБ проводили первичный учет результатов путем первоначального визуального осмотра засеянных пробирок со средой. При росте культуры через 24 ч бульон каждого варианта среды становился мутным, непрозрачным. Через 48 ч культивирования микроба при 37 0С на дне пробирки, как правило, наблюдался осадок.

Количество бактерий, выросших после суточного культивирования при температуре 37 0С в разработанной питательной среде и в ТСБ, представлено в табл.

1. Из данных табл. 1 видно, что тест-штаммы бактерий хорошо растут на предлагаемой питательной среде во всех вариантах основ, причем экспериментальная питательная среда, изготовленная из молок разных пород рыб, по чувствительности и скорости роста не уступает питательной среде, взятой в качестве сравнения. Ростовые свойства тест-штаммов бактерий при культивировании в ТСБ (контроль) и в экспериментальной питательной среде, приготовленной на основе отвара молок рыб, стабильны. За сутки культивирования в ТСБ численность бактерий увеличилась на 9 порядков. Аналогичное увеличение численности бактерий наблюдалось и в разработанной питательной среде, независимо от тест-штамма. Интенсивный рост бактерий лучше всего отмечался в питательном бульоне, приготовленном на основе молок лососевых рыб (горбуши, кеты) для всех исследованных тест-штаммов. Эффективность накопления бактериальной массы была на 2-4 порядка меньше на экспериментальной среде, приготовленной из молок наваги, красноперки и тихоокеанской сельди, по сравнению с основой из молок лососевых рыб.

Исследуя динамику численности бактерий, выросших на плотной питательной среде, мы определили, что ростовые свойства тест-штаммов, культивируемых в среде, приготовленной на основе жидкого или сухого отвара из молок лососевых рыб, были идентичными (табл. 2).

Определение начала роста бактерий (на примере L. monocytogenes) в экспериментальной среде по сравнению с ТСБ представлено на рисунке. Рост лис-терий в питательной среде, приготовленной на основе жидкого или сухого отва-

ра молок лососевых рыб, отмечается уже через 1 ч после внесения культуры L. monocytogenes в среду. В ТСБ и в среде, приготовленной на основе молок наваги и сельди, рост листерий отмечается только после 8 ч культивирования бактерий.

В результате проведенных исследований была разработана рецептура питательной среды для культивирования бактерий, приготовленной из молок разных видов дальневосточных рыб, которая обусловливает быстрый и стабильный рост бактерий за счет содержания в ней достаточного количества аминокислот и микроэлементов и не требует дополнительных дорогостоящих компонентов. Определены физико-химические качества среды по содержанию азота, белка, пептона и рН среды (7,2-7,4).

Содержание белка во всех средах не уступает (среда на основе молок тихоокеанской сельди) или превышает (среда на основе молок лососевых рыб, наваги, красноперки) таковое в сравнении с ТСБ.

Содержание пептона в разработанной питательной среде на основе молок разных видов дальневосточных рыб превышает в два раза количество пептона в ТСБ. Однако аминный азот в питательной среде на основе молок лососевых рыб на 15-20 мг% ниже, а на основе молок сельди, наваги и красноперки — на 2027 мг% выше, чем в сравниваемой контрольной среде.

При изучении ростовых свойств питательной среды, приготовленной из молок разных видов рыб, было отмечено, что рост бактерий лучше всего наблюдался на среде из молок лососевых рыб (горбу-

то а

К

ч ю то

н

си Ч си

о

=к о к

Л

ч

си н то н к с

=к о к

Л

4 то н к

си

5

к * с

о 4—' « -

CQ

X +1

к О S

к ч То s

CQ \

ам

S о

са W

S Л

Н -

Л си

ч к ^ о « i-Q

ч о

си -

а о с

=к к

си

н «

то о

S н о о к к

си

4 о

к у

то «

к

5 то к

S

ч

К то к

Л

4

си н

5

к

CQ

то

о

_си

-Q

то

Н

си

ч

си

о

=S

о

-С к

Л

о с

<и

-Q н

>> то н

О СЛ к с

о

=S

ty о к н

о

-а с ч с

то то

В к X к

-а a

В о о

"S 3

.Si са

'С

=к

3 S

с к

,__ о

то ч

о

с «

ш

.13 о са

с

си ч

о

X X

си

С

С

о

то

:з

о

си

-а

с

3

t^

си

-Q

В

^

с

.

си

о

то

'сЗ

СЛ

о

Е

то

с

y

-а

си

ТО

то

в

о

и

CQ

СО

=к о к к

си

ч

са о

о «

fa ° К Ч п, о с S

2 к

о

=S о к

Л

4

си н то н

5

с

=S о к

Л

4 то н к

си

5 S

си с

о «

СП

2 s

2 л £ ш

3 ь

Н ТО

н

t"- " О

о CD О

^_) сэ

^ ^ со

со ■cf СО СО со с^ СО ОО

+1 ОО +1 см +1 со +1 см

О от от

со т—( ю см

^^ LO

О о о

о

а, 00 сэ

со ОО .—| С5 о

О от со от см ОО

+1 от +1 +1 со +1 см

от со

О т—1 о см

с^ со ^^

^-( 1—( 1—(

О сЪ о о

^

^—) ^—) ^—) ^—)

сэ ОО «э сэ

ао о СЭ СО С5 о ао

со см со ОО

+1 с- +1 см +1 со +1 см

ю о СО со

ю о о ■Cf

со

о О о

Ъ

^ ,_„ ,_ч ,_ч

с^ ао С5 с^

t-— ^-V ._^ СО

LO со см см от

+1 | +1 со +1 со +1 со

ОО со от

со о ОО

ю ю

ъ О

О ^_) о

<Э ^—) ^—) ^ ^—)

<■0 см 43

^—) от сэ ю ^—) ._т

со о о LO см

+1 +1 со +1 +1 со

О со ю о

ю СО СО ■Cf

1—( 1—( 1—( 1—(

о н

О

СО Н

к

е то ^ s ¡эд a о то са

:y о ^ a о ш е о

is .«с

^со О

о

о о о <

^

^-V ^-V LO

ОО см см

+1 +1 +1 +1

ОО СО

■Cf см от

со о

CJ

-о О

"а ^

со ■2

со оо

со ^

о

'С

•С cj со

О

ч

=S о к

са си о о с

=к о к

4 о X о

5

о к

Л

4

си н

5 о о к н о

3 н к

си

a

о

с

Таблица 2

Динамика численности тест-штаммов бактерий после культивирования их в экспериментальной питательной среде (24 ч при 37 °С), приготовленной на основе жидкого или сухого отвара из молок лососевых рыб, КОЕ/мл, (%)*

Table 2

Dynamics of test strains of bacteria cultivated (24 hours at 37 °C) in experimental nutrient mediums made of liquid

and dry broth from salmon milt

Исходная посевная доза Численность бактерий на плотной питательной среде после культивирования их

Тест-штаммы в питательной среде (с учетом разведения), приготовленной на основе

бактерий жидкого отвара из молок лососевых рыб из сухого отвара молок лососевых рыб

Listeria monocytogenes NCTC 10527 (4b серовариант) (60 + 9) • 101 (528 + 22) (422) • 109, (193 + 21) (406) • 109,

Listeria monocytogenes CLIP 75936 (l/2a серовариант) (109+ 11) • 101 (63 + 8) • (356) 109, (53 + 5) • (353) 109,

Listeria ivanovii NCTC 11846 (74 + 6) • 101 (36 + 9) • (368) 109, (12 + 4) • (351) 109,

Listeria innocua SLCC 3379 (189+ 11) • 101 (406 ±38) (354) • 109, (162 + 23) (342) • 109,

Listeria seeligeri SLCC 5921 (30 + 4) • 101 (360 + 62) (466) • 109, (356 + 6) • (466) 109,

Listeria grayi (201 +40) • 101 (58 + 24) (265) • ю7, (90 + 6) • (271) ю7,

Yersinia pseudotuberculosis 2781 (92 + 9) • 101 (33 + 5) • (355) 109, (47 ± 20) (360) • 109,

Yersinia enterocolitica 164 (15 + 3) • 101 (104 + 21) (506) • 109, (52+ 11) (492) • 109,

Escherihia coli (190 + 60) • 101 (589 + 26) (359) • 109, (829 + 43) (363) • 109,

* Проценты относительно исходной посевной дозы.

0,8

0 1 2 3 4 6 8 24 31 48

Время, ч

Изменение оптической плотности L. monocytogenes на этапах периодического культивирования при использовании различных основ: ТСБ — триптиказо-соевый бульон; 1 — питательная среда на основе жидкого отвара из молок лососевых рыб; 2 — на основе сухого отвара из молок лососевых рыб; 3 — на основе молок сельди; 4 — на основе молок наваги

L. monocytogenes absorbency (vertical axis) changes at periodical cultivation (horizontal axis) stages with different bases: TSB — tryptic soy broth; 1 — nutrient solution made of salmon milt liquid broth; 2 — nutrient solution made of salmon milt dry broth; 3 — nutrient solution made of herring milt; 4 — nutrient solution made of navaga milt

ши, кеты) для всех исследованных тест-штаммов. Эффективность накопления бактериальной массы была на 2-4 порядка меньше на экспериментальной среде, приготовленной из молок других видов рыб (наваги, красноперки и тихоокеанский сельди). Это может быть связано, во-первых, с различным химическим составом молок сельди, лососевых, наваги, красноперки, хотя известно, что исходное сырье — мороженые молоки лососевых и сельди — практически не различается по содержанию в нем ДНК: в мороженых молоках лососевых рыб ДНК составляет 4,6-6,0 %, сельди — 4,5-5,5, минтая — 1,2-2,7 % (Касьяненко, Пивненко, 1999; Позднякова и др., 1999). Во-вторых, возможно, это связано и с показателями биологической активности препаратов ДНК, полученных из различных видов рыб. Например, установлено, что препарат низкомолекулярной ДНК из молок горбуши обладает большой биологической активностью, а у препаратов ДНК из сельди, минтая такой активности не обнаружено (Позднякова и др., 1999).

Использование для приготовления питательной среды в качестве белковой основы сухого или жидкого отвара молок лососевых рыб в подобранных экспериментальным путем концентрациях показало идентичные результаты динамики роста бактерий (см. рисунок, табл. 2). Это дает возможность использовать для приготовления питательной среды различные варианты основ — сухие или жидкие. Естественно, что преимущество в данном случае в использовании сухой основы, потому что ее можно хранить длительно, до 6 мес и больше, соблюдая условия герметичного хранения, так как она очень гигроскопична.

Заключение

Результаты проведенных исследований показывают преимущества разработанной среды, заключающиеся в возможности использования недорогих компо-

нентов в качестве питательной белковой основы, более высоких ростовых свойств среды в отношении различных видов бактерий, простой технологии приготовления по отношению к контрольной среде (ТСБ). Это позволяет расширить отечественную сырьевую базу и удешевить питательные среды для культивирования бактерий.

Список литературы

Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот : монография. — М. : Мир, 1968. — 333 с.

Технология рыбных продуктов : монография. — М. : Пищ. пром-сть, 1965.

Заявка № 2008111691. Питательная среда для культивирования бактерий (РФ) / Е.А. Зайцева, Л.Н. Фатеева, А.М. Кривошеева, Г.П. Сомов. Заявлено 26.03.2008.

Касьяненко Ю.И., Пивненко Т.Н. Сравнительные физико-химические характеристики низко-молекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из морских гид-робионтов // Изв. ТИНРО. — 1999. — Т. 125. — С. 152-158.

Методические указания по применению физико-химических и химических методов контроля медицинских биологических препаратов. — М. : МЗ СССР, 1982. — 15 с.

Об унификации методов контроля медицинских иммуно-биологических препаратов. Приказ МЗ СССР № 31 от 13 января 1983 г. — М. : МЗ СССР, 1983.

Позднякова Ю.М., Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Влияние ферментативного гидролиза на нуклеотидный состав молок различных видов рыб // Изв. ТИНРО. — 1999. — Т. 125. — С. 147-151.

Серов Г.Д. Усовершенствованная питательная среда для первичного определения разных микробов // Лаб. дело. — 1978. — № 11. — С. 15-18.

Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. — М. : Медицина, 1982.

Поступила в редакцию 20.11.08 г.