Пирацетам в профилактике интоксикации, вызванной чумным микробом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.981.452

'[

С.В.Демьяненко, М.Б.Мишанькин, Б.Н.Мишанькин, Н.С.Еременко, Н.И.Пасюкова ПИРАЦЕТАМ В ПРОФИЛАКТИКЕ ИНТОКСИКАЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ЧУМНЫМ МИКРОБОМ

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

На основании анализа данных о влиянии пирацетама при его введении перед инфицированием животных суспензией клеток Y. pest is EV1290 на свободнорадикальные процессы (СРП) в мозге и сыворотке крови крыс, устойчивость мембран эритроцитов (МЭ), а также на активность кислых и нейтральных протеиназ и состояние калликреин-кининовой системы сделан вывод о возможности применения пирацетама для профилактики интоксикации, вызванной чумным микробом. Установлено, что профилактическое введение пирацетама снижало уровень ПОЛ в мозге и крови крыс, повышало активность АОС в крови крыс, способствуя стабилизации эрит-роцитарных мембран, снижало активность кислых и повышало активность нейтральных протеиназ, препятствовало чрезмерной активации калликреин-кининовой системы. Кроме того, введение пирацетама за 3 сут до инъекции «мышиного» токсина белым мышам достоверно повышало LD50.

Введение

Изучена возможность использования нейроме-таболического препарата пирацетама (ноотропила) из группы ноотропов для профилактики патологических изменений в центральной нервной системе (ЦНС) и системе крови крыс, инфицированных чумным микробом. Препарат широко применяется при лечении заболеваний сосудов, травмах, интоксикациях, приводящих к патологическим изменениям в ЦНС [3, 13, 18]. Эффективность лечения пир-ацетамом в этих случаях достигали благодаря активизации биоэнергетического метаболизма нервных клеток, уменьшению последствий гипоксии, ишемии и, как результат, мобилизации компенсаторных возможностей мозга. Сходные патогенетические механизмы имеют место и при чумной интоксикации, когда признаки поражения ЦНС наблюдаются на всех стадиях, а микроциркуляторные нарушения в системе крови как за счет изменений мембранных свойств эритроцитов, так и из-за прямого действия токсинов на стенки микрососудов приводят к возникновению ишемии и развитию ацидоза [9, 17].

Целью настоящей работы явилось изучение влияния пирацетама на свободнорадикальные процессы (СРП), состояние антиоксидантной системы (АОС) в мозге и сыворотке крови крыс, а также устойчивость мембран эритроцитов (МЭ) при его введении перед инфицированием чумным микробом. Дополнительно исследовано действие профилактического введения пирацетама на общую протеоли-тическую активность кислых и нейтральных протеиназ [16] в коре головного мозга крыс, активность калликреина [16] и антитриптическую активность [16] в сыворотке крови животных.

Проведено также сравнение значений и}50 препарата «мышиного» токсина при его подкожном введении интактным белым мышам и мышам, обработанным пирацетамом.

Методы исследования

Эксперименты выполнены на четырех группах белых беспородных половозрелых крысах в возрасте 3-4 мес. массой 180-200 г:

1-я - интактные животные (контроль I). Изученные показатели у животных, содержавшихся в условиях вивария, и контрольных животных, которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (контроль П), статистически достоверных различий не имели, поэтому здесь приводятся усредненные данные контрольных животных;

2-я - животные, которым ежедневно внутрибрюшинно в течение 3 дней до декапитации вводили пирацетам в дозе 3 мг/100 г массы;

3-я - животные, которым за 4 сут до декапитации вводили внутрибрюшинно суспензию клеток вакцинного штамма Yersinia pestis EV1290 в дозе

1 млрд клеток/100 г массы;

4-я - животные, которым ежедневно внутрибрюшинно в течение 3 дней до декапитации вводили пирацетам в дозе 3 мг/100 г массы и затем за 4 сут до декапитации вводили внутрибрюшинно EV1290 в дозе 1 млрд клеток/100 г массы.

Животных декапитировали, выделяли кору головного мозга, промывали холодным физиологическим раствором и гомогенизировали на холоду.

Для оценки влияния пирацетама до введения суспензии клеток EV1290 на интенсивность СРП определяли показатели Н202-индуцированной лю-минолзависимой хемилюминесценции: светосумму (СС), отражающую общее содержание липопереки-сей и высоту быстрой вспышки, указывающую на общее количество гидроперекисей липидов в 10 % гомогенате коры головного мозга и сыворотке крови крыс [1]. Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по количеству малонового диальдегида (МДА) в коре головного мозга [1]. Состояние АОС оценивали по показателю общей антиокислительной активности (ОАА) мозга и сыворотки крови [1], а также по содержанию низкомолекулярных антиоксидантов: мочевины и мочевой кислоты [11]. О стабильности МЭ судили по показателям суммарной пероксидазной активности (СПА) [14] и уровню внеэритроцитарного гемоглобина (ЮГ) [11]. О типе адаптационной реакции судили по лейкоцитарной формуле [7].

Все расчеты проводили с использованием пакета программ MathCAD 2002. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Колмого-

Таблица ]

Влияние введения пирацетама на свободнорадикальные процессы, антиокислительную систему в коре головного мозга, сыворотке крови и устойчивость мембран эритроцитов крови интактных крыс и перед введением клеток У. реьім ЕУ1290 (п=4)

Серии 10 % гомогенат Сыворотка МЭ

СС Н МДА | ОАА | Моч. МК СС Н | ОАА Моч | МК СПА | ВЭГ

Пирацетам 3 сут +32* +23* +51* +272*** -15 -27* +40* +25* +128*** -37* + 10 +358*** -38*

EV-1290 4 сут +88** +77** +272*** +175*** -56** -37* +77** +114*** +191*** -67** -68** +910*** +72*

Пирацетам 3 сут + +50** +20 -8 +11 +4 + 10 -8 +71** -20 +26* +108*** -6 -24*

EV 4 сут

Примечание. Достоверность отличий по отношению к контрольным значениям: * - р<0,05, ** - р<0,01; *** - р<0,001.

рова. Средние арифметические значения ряда М и среднеквадратичное отклонение гп сравнивали по I-критерию Стьюдента. Достоверно различающимися признавали значения при р<0,05 [5]. ЦЭ50 рассчитывали по методу Кербера при малом числе подопытных животных [2].

Результаты и обсуждение

Введение пирацетама в течение 3 сут интакт-ным животным сопровождалось интенсификацией СРП, что выражалось в достоверном повышении начальных продуктов ПОЛ - перекисей и гидроперекисей липидов и МДА как в коре головного мозга, так и сыворотке крови. Подобная динамика ПОЛ характерна для действия препарата и обусловлена способностью ноотропов усиливать снабжение тканей кислородом, интенсифицировать энергетический метаболизм в мозге, оказывая тем самым активирующее влияние на пластические процессы нервной ткани и высшие интегративные функции мозга, действуя по принципу повышения «активной резистентности» [4] (табл. 1). Но из-за высокого уровня ОАА в исследуемых тканях активация ПОЛ незначительна и не превышала физиологически допустимые нормы. Введение препарата или несколько снижало, или не оказывало влияния на содержание мочевины и мочевой кислоты (МК) (табл. 1).

При введении пирацетама в течение 3 сут наблюдали достоверное снижение общей протеолити-ческой активности нейтральных протеиназ в коре головного мозга крыс, без изменения активности кислых протеиназ (табл. 2). Судя по данным электронной микроскопии [15], введение пирацетама приводило к активации протеолиза, что, однако, не отмечено в наших экспериментах. Подобную динамику, вероятно, можно объяснить тем, что экспериментальные животные нами не были разделены на типологические группы по уровню тревожности. Между тем известно, что при повышении дозы пирацетама у животных с высоким уровнем тревожности может наблюдаться переход ноотропного эффекта в анксиолитический [6]. Отсутствие изменений в активности кислых протеиназ на фоне некоторой активации СРП при введении препарата указывает на отсутствие повреждений лизосомальных мембран.

Повышение активности калликреина при некотором повышении антитриптической активности при введении препарата соответствует данным ли-

тературы о влиянии пирацетама на гемореологиче-ские показатели крови [10].

Таблица 2

Влияние введения пирацетама на общую протеолитическую активность кислых (мкМ/мг белка) и нейтральных протеиназ (нМ/мг белка) в коре головного мозга, на активность калликреина (мЕ/мл) и антитрипсическую активность (АТА) (ИЕ/мл) в сыворотке крови интактных крыс и перед введением клеток У реьйь ЕУ1290 (п=4)

Серия 10 % гомогенат Сыворотка

Кислые, % Нейтральные, % Калликреин, % АТА, %

Пирацетам 3 сут -9 -92 ** +69 ** +20

EV-1290 4 сут +294 *** +0,3 +350 *** -66 **

Пирацетам 3 сут + +158 *** +156 *** +175 *** -4

ЕУ-1290 4 сут

Примечание. Достоверность отличий по отношению к контрольным значениям: **-р<0,01; ***-р<0,001.

Анализ лейкоцитарной формулы также свидетельствует о развитии реакции «спокойной активации» при введении препарата в течение 3 сут (табл. 3).

Таблица 3

Влияние введения пирацетама на лейкоцитарную формулу интактным животным и перед интоксикацией чумным микробом (п=4-6)

Условия

Нейті рофилы

Палочко- ядерные Сегменто- ядерные

Эозино-

филы

Моно-

циты

Лимфо-

циты

Контроль 4,3+0,5 24,0±2,0 0,9+0,05 6,0+0,6 64,8±3,2

М±ш

Реакция спокойной активации Пирацетам 3 сут 3,4±0,4 17,8±1,7 1,0+0,2 6,1±0,5 71,8±4,0

М±ш

Реакция острого стресса EV-1290 4 сут 8,4±0,9 25,8+3,2 0 21,4±2,5 44,4+3,4

М±ш

Реакция спокойной активации Пирацетам 3 сут + 3,3±0,3 16,6±1,5 1,0+0,1 6,0±0,4 73,3±5,1

EV-1290 4 сут М±ш

При введении клеток Y. pestis EV1290 за 4 сут до декапитации происходит резкое повышение активности СРП: наблюдается значительный рост всех исследованных показателей уровня ПОЛ как в мозге, так и сыворотке крови животных (табл. 1). При этом недостаточная активация АОС и, в частности, низкое содержание мочевины и МК как в крови, так и в мозге при инфицировании EV1290 способствуют смещению прооксидантно-антиокси-

дантного равновесия в направлении активации процессов ПОЛ.

При интоксикации чумным микробом происходит значительное увеличение активности кислых протеиназ коры головного мозга, что, вероятно, свидетельствует о нарушении целостности лизосо-мальных мембран в нейронах коры головного мозга животных за счет чрезмерной активации процессов ПОЛ и выходе в цитозоль гидролитических ферментов лизосом (табл. 2).

Свободнорадикальное поражение, обусловленное интоксикацией чумным микробом, легко приводит к нереверзибельному дефекту или лизису эритроцитов, клеток наиболее подверженных действию окислительного стресса. Наблюдается значительный рост СПА и уровня ВЭГ (табл. 1).

1 Некомпенсируемый повышением антитрипси-ческой активности значительный рост активности калликреина в сыворотке крови крыс свидетельствует о вовлечении калликреин-кининовой системы в патологический процесс (табл. 2).

На современном этапе клинико-неврологиче-ских исследований свободнорадикальной патологии отведена роль пускового фактора в метаболических механизмах острых циркуляторных и травматических поражений головного и спинного мозга, эпилепсии, мозгового отека, церебрального вазоспазма, а также определено значение продуктов ПОЛ в структурно-функциональных повреждениях нервной системы, обусловленных гипоксией [8]. Известно, что микроциркуляторные нарушения под влиянием летальной дозы МТ наступают уже через

2 ч после его введения [9].

Анализ лейкоцитарной формулы указывает на развитие острого воспалительного процесса и соответствует «реакции острого стресса» (табл. 3)

Профилактическое введение пирацетама перед инфицированием животных суспензией ЕУ1290 предотвращало накопление гидроперекисей липидов и МДА и несколько снижало уровень липопере-кисей в коре головного мозга. При этом ОАА мозга и сыворотки крови достоверно не отличалась от контрольных значений. И хотя в коре головного мозга содержание мочевины и МК не отличается от уровня контроля, в сыворотке крови животных наблюдался рост показателей (табл. 1).

Зарегистрированное нами увеличение содержания мочевины и МК в сыворотке крови животных, которым до заражения ЕУ1290 вводили пирацетам, может быть следствием опосредованной активации ноотропом ферментов синтеза данных соединений. Обнаруженная же в эксперименте способность пирацетама снижать интенсивность ПОЛ в ткани мозга и сыворотке крови инфицированных ЕУ1290 животных может быть связана, в какой-то мере, с хе-латирующими свойствами мочевины и МК в отношении ионов железа (II), являющихся естественными прооксидантами.

Кроме того, известно, что пирацетам предупреждает снижение активности ферментов АОС, а благодаря антирадикальной активности, наличию аминогруппы, реагирующей с промежуточными по-перечно-сшивающими продуктами ПОЛ - альдегидами, а также способности нормализовывать работу

Na+, К+-насоса и активность 5’-нуклеотидазы препарат препятствует перестройкам мембранных структур с последующей стабилизацией нарушенных ли-пид-липидных и липид-белковых комплексов [19].

Профилактическое введение в течение 3 сут перед заражением EV1290 пирацетама несколько снижало активность кислых протеиназ и повышало активность нейтральных протеиназ, что, вероятно, способствовало разрушению деградированных макромолекул.

Механизм противогипоксического действия но-отропов обусловлен не только способностью к стабилизации биомембран, но и способностью нормализовывать реактивность мозговых сосудов и снижать локальный мозговой кровоток рядом с зоной деструкции мозга, а в неповрежденном мозге, не изменяя реактивности мозговых сосудов, снижать локальный мозговой кровоток [12].

Некоторое снижение активности калликреина, без повышения активности ингибиторов, свидетельствует, по-видимому, о том, что препарат не оказывает прямого влияния на состояние калликреин-ки-ниновой системы, но на фоне общего улучшения состояния организма препятствует ее чрезмерной активации (табл. 2).

Профилактическое введение пирацетама перед интоксикацией чумным микробом способствовало стабилизации эритроцитарных мембран. Уровень СПА достоверно не отличался от контрольных значений, а содержание ВЭГ даже несколько снижалось (табл. 1).

Анализ лейкоцитарной формулы свидетельствует о развитии более щадящей для организма реакции на стресс - «реакции спокойной активации» (табл. 3).

Введение пирацетама за 3 сут до инъекции МТ белым мышам достоверно повышало LD50 (78 %, р<0,05).

Таким образом, результаты проведенного на модели чумной интоксикации исследования свидетельствуют о целесообразности применения пирацетама в профилактике бактериальных инфекций. Нормализуя метаболические сдвиги на нейрональном уровне, способствуя стабилизации мембранных структур, что нередко лежит в основе гипоксии с последующим отеком мозга, и восполняя энергетический дефицит, пирацетам тем самым способствует «выживаемости» клеточных структур мозга и крови, препятствует развитию тяжелых судорожных, неврологических и соматических расстройств на этапе взаимодействия организма с сильнодействующим фактором, способствуя его адаптации.

Результаты нашего исследования не следует считать окончательными. Представляется важным уточнение оптимальных дозировок пирацетама, изучение его клинической эффективности по сравнению с другими препаратами нейрометаболиче-ского действия, а также возможность его использования при проведении антибиотикотерапии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е., Зыбина H.H. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиокси-дантной системы организма. - СПб, 2000. - 102 с. - 2. Ашма-

рин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - JL, 1962. - 179 с. - 3. Бень-кович Б.И. Психофармакологические препараты и нервная система. - Ростов н/Д, 2000. - 509 с. - 4. Вальдман A.B., Александровский Ю.А. Психофармакотерапия невротических расстройств. - М.: Медицина, 1987,- 286 с. -5. Владимирский Б.М. Математические методы в биологии. - Ростов н/Д, 1983. - 302 с. - 6. Воронина Т. А., Моло-давкин Г.М., Борликова Г.Г. и др. //Эксп. и клин, фарма-кол. - 2000. - Т. 63. - № 2. - С. 9-11. - 7. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма. - Ростов н/Д, 1990. - 224 с. -8. Завалишин И.А., Захарова М.Н. // Журн. неврол. и психиатр. - 1996. -№ 2. - С. 111-114. -9. Крупенина В.И. // Докл. Иркут, противочумн. ин-та. - Улан-Удэ, 1961. - Вьт.1. -С. 44—45. - 10. Лысенко А., Альперович Д., Мендже-рицкий А. // Hypoxia Medical J. - 1998. - № 1. - C. 2-7. -

11. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. Меньшикова В.В. - М., 1987. - 368 с. -

12.Мирзоян P.C., Ганьшина Т.С., Волобуева Т.Н., Романычева H.A. Нейромедиаторы в механизме действия цереброваскулярных средств.-М., 1991.-Вып. 26.-С. 5—19. —

13. Нисс А.И., Уманский'К.Г. и др. // Журн. невропатол. и психиатр, - 1985.- №2. - С. 189-195. - 14. Биохимические методы исследования в клинике / Под ред. Покровского A.A. - М., 1969. - 652 с. - 15. Самецкий Е. А. Пластичность нейрональных структур при действии пирацетама и дельта-сон индуцирующего пептида в условиях гипероксии. - Автореф. дис. . .. канд.биол.наук. - Ростов н/Д, 1996. - 24 с. -16. Современные методы в биохимии. - М., 1977. - 390 с. - 17. Шалы-

гина Н.Б., Шепелева Г.К., Титов В.В. и др. // Про-филакт. особо опасных инф. - Саратов, 1988. - С. 33-39. -18. Giurgea С. // Act. Pharmacol. - 1972. - Vol. 25. - P. 115-156. - 19. Qian Z-N., Gu Z-L., Jin L-Q., Xie M-L., Chen B-Q. // Acta Pharmacol. Sin. - 1992. - Vol. 13, N 1. -P. 48-50.

S.V.Demyanenko, M.B.Mishan'kin, B.N.Mishan'kin, N.S.Yeremenko, N.I.Pasiukova

Pyracetamum for the Prevention of Intoxication Caused by the Plague Agent

Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute

Analysis of observations on pyracetamum effects upon the' processes of free radicals (PFR) in the brain and blood sera of rats, stability of erythrocytic membrane (EM), and on the activity of acidic and neutral proteinases as well kallikrein-kinin system in the animals prior to their infection with Y. pestis strain EV/209, brought us to conclusion that the drug might be used for the prophylaxis of intoxication induced by Yersinia pestis infection. Preventive inoculation of pyracetamum facilitated decreased POL levels in the brain and blood of rats, higher activity of AOS in their blood, thus promoting stabilization of the erythrocytic membranes. It also reduced the activity of acidic proteinases and raised that of the neutral proteinases, and prevented excessive activation of the kallikrein-kinin system. Moreover, inoculation of pyracetamum 3 days before the injection of the murine toxin to white mice significanty increased the LD50dose.

Поступила 24.11.03

УДК 576.8:576.809.7

М.В.Ломтатидзе, Н.П.Храпова, В.В.Свиридов, Т.П.Крючкова

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ АНТИГЕНОВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Получены 12 стабильных клонов антителопродуцирующих гибридом к антигенам синегнойной палочки, являющейся одной из наиболее частых этиологических причин возникновения нозокомиальных инфекций. При проведении электрофореза антигенных препаратов P. aeruginosa и постановки иммуноблотта установлено, что МКА 1В7 взаимодействуют с эпитопами полисахаридного компонента ЛПС с молекулярной массой от 10 до 20 кДа, а остальные 11 МКА реагируют с эпитопами в составе биополимеров с молекулярной массой от 35 до 70 кДа белковой природы. Сконструированы и успешно испытаны в лабораторных условиях иммуноферментная тест-система и флуоресцирующий препарат на основе полученных МКА. Обсуждается перспектива использования сконструированных препаратов для экспресс-обнаружения госпитальных штаммов P. aeruginosa.

В последнее десятилетие за рубежом широкое распространение получили моноклональные антитела (МКА) против различных антигенов Pseudomonas aeruginosa, в том числе и как ингредиенты им-мунодиагностических тестов [3, 4, 5, 6]. В нашей стране исследования по получению и применению МКА к антигенам синегнойной палочки не проводились, несмотря на очевидную актуальность проблемы конструирования высокоактивных диагностических средств на основе антител заданной специфичности.

В настоящее время коммерческие средства экспресс-обнаружения госпитальных штаммов синегнойной палочки в арсенале отечественных диагностических лабораторий отсутствуют. Это относится как к препаратам, приготовленным на основе МКА, так и поликлональным иммуноглобулинам против антигенов P. aeruginosa. Исследования по получению МКА к диагностически значимым антигенам

данного микроорганизма и оценке их свойств с точки зрения перспектив создания современных образцов препаратов бесспорно способствуют совершенствованию надзора за патогенами - возбудителями нозокомиальных инфекций.

Данное исследование выполнено на модели синегнойной палочки. Воспроизведение гибридом-ной технологии осуществлено согласно общепринятому протоколу. До начала опытов по гибридизации мышиных клеточных линий проведен ряд предварительных экспериментов по оптимизации условий стимуляции мышиных спленоцитов - одного из партнеров при гибридизации клеточных линий антигенами P. aeruginosa и подбору метода скрининга МКА.

Апробированы 9 схем иммунизации мышей линии BALB/c УЗ-дезинтегратами микробных клеток (м.к.) и ЛПС P. aeruginosa. Последующий анализ эффективности гибридизации мышиных В-лимфо-