CC BY
61
УДК 616.981.452:543.9
С.В.Демьяненко, Л.В.Романова, Б.Н.Мишанькин, А.С.Водопьянов
ИЗУЧЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ПРИ ЧУМНОЙ ИНФЕКЦИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону
Использование ПЦР не выявило наличие ДНК чумного микроба в ликворе крыс при экспериментальной чуме. В неперфузированной ткани мозга реакция была положительна в 20 % случаев. В крови наличие ДНК методом ПЦР показано в 100 % случаев. Таким образом, функциональные нарушения нервной системы при чуме из-за непроницаемости гематоэнцефалического барьера, видимо, не связаны с непосредственным влиянием токсических веществ чумного микроба на ткань мозга, а опосредованы развитием синдрома эндогенной интоксикации.
Ключевые слова: ПЦР, нервная система, Yersinia pestis EV, эндогенная интоксикация.
Одним из основных клинических признаков чумной инфекции является резкое нарушение функций нервной системы [5]. Согласно имеющимся в литературе данным, считается, что основной причиной этих нарушений является непосредственное действие на клетки мозга токсических веществ чумного микроба.
Известно, что экзогенные и эндогенные токсические вещества из системы кровеносных и лимфатических сосудов в ликвор не поступают за счет барьерной функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), но при некоторых патологических состояниях происходит изменение проницаемости ГЭБ. Исследование проницаемости ГЭБ при экспериментальной чуме в отношении некоторых индикаторных веществ (трипановая синь, конго красный, фер-роцианистый натрий) не выявило существенных нарушений. Более того, проведенные К.М.Мохиным и соавт. [7] исследования свидетельствуют об отсутствии продуктов распада чумных микробов в ткани мозга и глазной жидкости, которые не удалось обнаружить серологическими методами. На основании этого авторы делают вывод о том, что при чумной инфекции антигены чумного микроба не проникают через ГЭБ и гематоофтальмический барьер (ГОБ), и нарушения нервной деятельности, наблюдаемые при чумной инфекции, обусловлены не присутствием чумного микроба в тканях мозга, а «другими механизмами». Однако современные методы диагностики позволяют обнаруживать вирусные, микологические и бактериальные агенты в мозге и ликворе больных [2, 9, 11, 13].
Целью настоящей работы было выявление клеток и ДНК Yersinia pestis в ликворе, мозге и крови белых крыс при чумной инфекции бактериологически и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на 50 беспородных белых крысах в возрасте 3-4 мес. массой 180-200 г. Животных ослабляли путем введения гидрокортизона (Richter, Венгрия) в дозе 0,1 мг на 100 г веса, через 2 ч крысам внутрибрюшинно вводили клетки вакцинного штамм EV1290 Y. pestis, выращенного
при 28 °С, в дозе 2,5 109м.к. на 100 г веса, которая соответствовала 1 LD50. Через 12 ч у выживших животных с признаками резко выраженной интоксикации в агональный период брали субакципитальную фракцию ликвора, животных при этом обездвиживали введением 1,2 мл 1 % раствора тиопентала на 100 г веса. Далее проводили декапитацию, выделяли кору головного мозга, которую промывали холодным физиологическим раствором и гомогенизировали на льду. Производили посевы ликвора, мозга и крови на агар Хотингера (pH 7,2) с добавлением до 2 % гемолизированной крови крупного рогатого скота.
Из ликвора, мозга и крови белых крыс выделяли хромосомальную ДНК методом фенол-хлорофор-мной экстракции с использованием протеиназы К [6].
Качество нативной ДНК и результаты ПЦР визуализировали электрофорезом в 5 % полиакриламидном геле после окрашивания бромистым этиди-ем (1 мкг/мл). Электрофорез проводили в трис-аце-татном электродном буфере (pH 8,2) в присутствии маркеров в аппарате для электрофореза «Midget» (Hoefer Scientific Instrument, USA) и фотографировали с помощью цифровой камеры «Minolta. Dimage 7i». Синтез фрагментов ДНК осуществляли с помощью термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-no-лимераза производства «Амплисекс», Москва) в термоциклере МС-2 «Терцик» (АО «ДНК-техноло-гия», Москва).
Инкубационная смесь (15 мкл) для ПЦР содержала 6,7 тМ трис-НС1, pH 8,8; 16,6 mM (NH4)2S04; 3 тМ MgCl; 0,1 % твин 20; 100 мкг/мл желатины; по 250 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифос-фатов; 0,1-1 мкМ соответствующей пары праймеров и 2 ед. Тац-полимеразы.
Режим амплификации после внесения минерального масла составлял: 94 °С (денатурация) -13 с; 58 °С (отжиг) - 22 с; 72 °С (синтез) - 15 с. Всего 38 циклов.
Для обнаружения ДНК Y. pestis использовали праймеры, сконструированные на основе гена caf 1 плазмиды pFra [8]. Результат амплификации оценивали как положительный при обнаружении фрагмента размером 501 п.н. и отсутствии в отрицательном контроле.
Результаты и обсуждение
! ■
Проведенные опыты показали, что во всех случаях при посевах на питательные среды образцов тканей мозга и ликвора получены отрицательные результаты. При посеве крови выявлены колонии В то же время при применении ПЦР для исследования крови положительные результаты получены в 100 % случаев, а также в 20 % при исследовании ткани мозга, что обусловлено прохождением клеток чумного микроба через мелкие сосуды коры головного мозга, на что указывалось ранее [7]. В ликворе крыс методом ПЦР ДНК чумного микроба не обнаружена (рисунок). Это дает основание заключить, что нарушения нервной деятельности при чумной интоксикации не связаны с непосредственным действием на клетки мозга продуктов лизиса чумных микробов, а обусловлены, вероятно, биохимическим и иммунологическим компонентами эндогенной интоксикации (ЭИ). Известно, что при шоковом состоянии, вызванном бактериальными токсинами, происходит резкое повышение концентрации биологически активных веществ, таких как гистамин, серотонин, катехоламины, ацетилхолин, простагландины и пр. и их метаболитов, которые могут выступать как в качестве звена мобилизации внутренних ресурсов - фактора быстрой адаптации, так и в роли патогенетического фактора. Результатом действия биологически активных веществ является изменение микроциркуляции в органах и тканях, возникновение внутриклеточной гипоксии, ацидоза, что, в свою очередь, вызывает развитие комплекса патофизиологических нарушений функций клетки и, в частности, способствует активации ПОЛ в мозге и крови [4].
При чуме характерно повреждение сосудов, особенно мелких, во всех органах, геморрагический отек мозга, легких и др. Наблюдается фазное изменение степени агрегации тромбоцитов крови, которое происходит не только и не столько за счет изменений мембранных свойств эритроцитов, но, по-видимому, и за счет прямого действия мышиного токсина (МТ) К резйэ на стенки микрососудов [10]. Отмечается повышенная гемолитическая активность чумного микроба, обеспечивающая его железом в виде гемоглобина из разрушенных эритроцитов при инфицировании [1]. Чумной микроб вызывает свертывание плазмы крови. Под влиянием эн-
ГЩР-профиль ДНК У. реьпз штамма ЕУ1290 в тканях крыс:
1-3-кровь; 4-6-мозг; 7-8-ликвор; 9-контроль культуры;
10 - маркер молекулярных весов; 11—13 — кровь+культура; ■ 14-16 - мозг+культура; 17 - ликвор+культура; 18 - положительный -контроль; 19 - отрицательный контроль; 20-27 - мозг; 28-30 - ликвор; 31 - маркер молекулярных весов; 32-35 - мозг+культура;
36-38 - ликвор+культура; 39 - положительный контроль
дотоксина тканевый тромбопластин запускает каскад реакций, способствующих внутрисосудистому свертыванию крови. Не остаются безразличными к эндотоксину и белки крови, включая компоненты комплемента и фактор Хагемана. Так, фатальным фактором является эндотоксемия, влекущая развитие тромбоза в сосудах различных органов [5]. Все вышеперечисленное, несомненно, ведет к развитию ишемии и отеку головного и спинного мозга.
Ключевую роль в развитии синдрома ЭИ играют активированные нейтрофилы [14,15] и медиаторы различных типов. Прежде всего это дериваты активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов, цитокины [12], обладающие повреждающим действием на ткани [16], затем компоненты комплемента. Стимуляция цитокиновой системы является общим путем развития многих патологических состояний: сепсиса, геморрагий, ишемии, травмы мягких тканей и т. д., приводящих к активации макрофагов и гиперпродукции провоспалительных цитокинов. В последнее время установлено, что мышиный токсин является потенциальным суперантигеном чумного микроба и обладает выраженной цитокининдуци-рующей активностью, обеспечивая синтез цитокинов провоспалительного характера (ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-альфа) [3].
Таким образом, можно с уверенностью утверждать, что значительные функциональные нарушения нервной системы при чуме из-за непроницаемости ГЭБ не связаны с непосредственным влиянием токсических веществ чумного микроба на ткань мозга, а обусловлены развитием синдрома ЭИ. В пользу этого свидетельствуют отрицательные результаты исследования ликвора и мозга зараженных крыс бактериологическим методом и в ПЦР.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсул Yersinia pestis: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Саратов. -2000. - 32 с. - 2. Балязин В. А., Сучков И.Ю., Литман
A.О., Коновалова Т.А. // Акт. пробл. неврологии и нейрохирургии: Сб. науч. тр. - Ростов н/Д, 1999. - С. 126-127. -З.Васильева Г.И., Мишанькин М.Б., Козловский
B.Н. // ЖМЭИ. - 1998. - № 1. - С. 61-64. - 4. Демьяненко
C.В., Мишанькин М.Б., Мишанькин Б.Н. и др. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2004. - Вып. 1 (87). -С. 55-58. - 5. Домарадский И.В. Чума. - М.: Медицина, 1998. - 176 с. - 6. Маниатис Т., Фрис Э., Сэмбрук Д.Т. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 394 с. -7.Мохин К М., Белобородов P.A., Свистунов В.М. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 1969. - Вып. 2. - С. 147-152,-8.Норкина О.В. Детекция возбудителя чумы с использованием полимеразной цепной реакции: Дис. ... канд. мед. наук. - Саратов. - 1993. - 9. Романова JI.B., Мишанькин Б.Н., Сучков И.Ю.//Биотехнология. - 1996.-№ 3. - С. 27-32. - 10. Шалыгина Н.Б., Шепелева Г.К., Титов В.В. и др. // Профилак. особо опасных инф. - Саратов, 1988. -№108.- С. 33-39. - 11. Шостакович-Корецкая JI.P., Маврутенков В.В. и др. // Генодиагн. инф. бол.: Сб. тр. 5-ой Всерос. науч.-практ. конф. - М., 2004. - Т. 2. - С. 150-151. -12.Dinarello C.A., Gelfand J.A., Wolf S.M. //JAMA.-1993. - Vol. 269, N14 - P. 1829-1835. - 13.Masahiró K., Seishi U., Yoshinobu K. et al. II Brit. J. Haematol. - 1999. -Vol. 106, N 2. - P. 536-537. - 14. Fujishima S., Aikava N.// Intfens. Care Med. - 1995. - Vol. 21, N3 - P. 277-285. -15. Schlag G., Redl H. // World J. Surg. - 1996. - Vol. 20, N4,- P. 406-410. -,16. Smith R.S. // Med. Hypoth. - 1991. -Vol. 34. - P. 49-57.
S.V.Demyanenko, L.V.Romanova, B.N.Mishan'kin,
A. S. Vodopyanov
A PCR Study of Permeability of the Blood-Cerebral Barrier under the Plague Infection
Laboratory of Microbial Biochemistry; Anti-Plague Research Institute, Rostov-on Don
PCR assaying revealed no Yersinia pestis DNA in the liquor of plague challenged rats. Twenty per cent specimens of non-perfused brain tissue gave positive results by the PCR analysis in contrast to blood samples show-
ing the presence of the plague pathogen DNA in 100 per cent cases. Hence, the functional disorders in the nervous system observed in the case of plague infection due to impermeability of the blood-cerebral barrier, seem to be associated with the development of the endogenous intoxication syndrome rather than with immediate effects of Y. pestis toxic substances on the brain tissues.
Key words: PCR, nervous system, Yersinia pestis EV, endogenous intoxication.
Поступила 05.07.05.
УДК б 16.981.51:615.371/.372
И.В.Касина1, Л.В.Саяпина1, Т.И.Анисимова1, А.Н.Шевцов2, В.С.Лобастов2, А.А.Бывалов2,
И.С.Барулина2
ИЗУЧЕНИЕ НОВОГО ОТРАСЛЕВОГО СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ВАКЦИНЫ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ЖИВОЙ СУХОЙ
'ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Москва;
2Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ, Киров
Разработан новый ОСО вакцины сибиреязвенной живой сухой. Изучение его по аттестуемым значениям -общей концентрации спор, проценту живых спор, наличию посторонней микрофлоры, средней массе содержимого в ампуле, потере в массе при высушивании, стабильности и однородности, индексу иммунитета, специфической безвредности - показало, что он соответствует требованиям, предъявляемым к ОСО.
Ключевые слова: сибиреязвенная вакцина, отраслевой стандартный образец, индекс иммунитета, общая концентрация спор, стабильность.
Возбудитель сибирской язвы способен больше 100 лет сохраняться в почве в виде спор и образовывать стойкие очаги инфекции. Эта болезнь, поражающая сельскохозяйственных животных, является постоянной угрозой для здоровья человека и приносит большой экономический ущерб [2]. По данным ВОЗ, в мире ежегодно заболевают около 20 тыс. человек. В 2004 г. в нашей стране зарегистрировано 16 случаев заболевания, в том числе у 1 ребенка [4]. Не исключается возможность биотерроризма и использования возбудителя сибирской язвы как биологического оружия [3]. Поэтому плановая и экстренная профилактика сибирской язвы актуальна и в настоящее время, так как является одним из основных этапов противоэпидемических мероприятий.
Для профилактики сибирской язвы используется вакцина сибиреязвенная живая. Одной из задач стандартизации оценки методов контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) является использование отраслевых стандартных образцов (ОСО), предназначенных для воспроизведения показателей, характеризующих свойства препарата и его компонентов, значение которых предварительно установлены в результате метрологической аттестации [1, 5]. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение отраслевого стандартного образца вакцины сибиреязвенной живой сухой, который используется для оценки правильности результатов определения им-муногенности производственных серий вакцин по индексу иммунитета в тесте активной защиты мор-
ских свинок против летального действия тест-заражающего штамма В. апхкгас1$ 71/12.
Основные требования к стандартным образцам МИБП изложены в СП 3.3.2.128-03 «Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов» [1]. Областью применения стандартных образцов является контроль качества МИБП. Различают 3 вида стандартных образцов: международные, национальные и стандартные образцы организации. Порядок разработки национального стандартного образца и стандартного образца организации предусматривает следующее: составление программы разработки ОСО, изготовление ОСО, выполнение научно-исследовательских работ, разработку проекта нормативных документов.
Материалы и методы
В соответствии с действующей НД (РП 1503-04 и ФСП 42-0095-1376-01) в НИИМ МО РФ (г. Киров) была приготовлена испытуемая серия вакцины сибиреязвенной живой сухой, предлагаемая в качестве кандидата в ОСО. Вакцина сибиреязвенная живая сухая была изучена по следующим аттестуемым значениям: общая концентрация спор, которую определяли методом подсчета в камере Горяева в 20 ампулах вакцины; процент живых спор, определение посторонней микрофлоры. Стандартность препарата определяли по средней массе и потере в массе при высушивании ОСО вакцины в 15 ампулах, а также по стабильности и однородности. Специфическую безопасность определяли на двух кроликах,
