CC BY
41
УДК 612.018:612.118:611.22-006.6
ТРИПСИНОПОДОБНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ, КИНИНОВАЯ СИСТЕМА И ОСНОВНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ ПРИ РАКЕ НОСОГЛОТКИ
© 2011 г. Л.С. Козлова, Е.В. Колычева
Ростовский научно-исследовательский
онкологический институт, ул. 14 линия, 63, г. Ростов н/Д, 344037, rnioi@list.ru
Rostov Research Oncologic Institute, 14 liniya, 63, Rostov-on-Don, 344037, rnioi@list.ru
Изучалась роль трипсиноподобных протеиназ, компонентов калликреин-кининовой системы и ингибиторов а-1ПИ и а-2М плазмы крови больных в развитии местно-распространённого рака носоглотки. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при развитии злокачественного процесса в органотканевом комплексе носоглотки нарушается протеиназо-ингибиторное равновесие плазмы крови, происходит патологическая активации калликреин-кининовой системы. Сделано заключение об участии перечисленных систем в активации провоспалительных факторов и развитии злокачественного процесса.
Ключевые слова: рак носоглотки, кининовая система.
The role of tripsin-like proteinases, kallikrein-kinin system and a-1PI and a-2M inhibitors of blood plasma in development of locally-advanced cancer of nasopharynx has been studied. According to the results, development of malignant process in organ-tissue complex of nasopharynx is accompanied by disturbance of proteinase-inhibitory balance of blood plasma and pathologic activation of KKS. Conclusion about participation of the above-mentioned systems in activation ofproinflammatory factors and development of malignant process has been made.
Keywords: cancer of nasopharynx, kinin system.
В развитии неопластического процесса принимают участие множество гидролитических ферментов [1 - 3]. Среди гидролаз особый интерес представляют наиболее распространенные в организме серино-вые протеиназы трипсинового типа, имеющие в основном широкую субстратную специфичность. Исключение составляет калликреин, который по своей кининогеназной функции обладает узкой субстратной специфичностью [4]. Калликреин-кининовая система (ККС) является ведущей регуляторной системой организма, обеспечивающей универсальную адаптивную реакцию, ответственной за реологию крови, состояние гистогематических барьеров и содержащей белки острой фазы [4]. Основными регуляторами активности трипсиноподобных протеиназ являются a-2-макроглобулин (а-2М) и a-1-про-теиназный ингибитор (а-1ПИ). Ингибитор а-2М связывает большинство известных протеиназ, а а-1ПИ обеспечивает 90 % антипротеолитической активности плазмы крови, им придаётся большое значение в развитии противодействия организма злокачественной пролиферации [4 - 6].
Целью настоящего исследования являлось изучение активности трипсиноподобных протеиназ, показателей ККС и важнейших ингибиторов плазмы крови больных раком носоглотки.
Материалы и методы
Исследована плазма крови больных с диагнозом «рак носоглотки», поступивших в отделение лучевой терапии РНИОИ. Результаты сравнивали с данными, полученными при изучении плазмы крови практически здоровых доноров. В цитратной плазме крови проведено определение компонентов ККС: активности калликреина (К), содержания прекалликреина (ПК), активности кинин-разрушающего фермента -
карбоксипептидазы N (КОП), а также суммарной активности трипсиноподобных протеиназ (САТП), активности трипсиновых протеиназ без учета калликреина (АТП) [7]. Активность универсальных ингибиторов протеолиза а-1ПИ и а-2М исследовалась унифицированными методами [8].
Для более точной интерпретации полученных количественных показателей для каждого образца плазмы крови рассчитывались вспомогательные коэффициенты соотношения: протеиназа-ингибитор, предшественник-фермент и фермент-фермент.
Достоверность различий между количественными показателями вычисляли по ^критерию Стъюдента [9].
Результаты и их обсуждение
Обследование больных показало значительные изменения практически всех изучаемых показателей в плазме крови по сравнению со здоровыми донорами (табл. 1). У всех пациентов установлена активация ККС крови по отношению к норме, которая выражалась в повышении активности К в 2 раза, снижении содержания ПК - на 77,6 %, резком снижении активности КОП - в 2,3 раза. У всех больных в плазме крови были повышены: САТП - на 67,7 %, АТП - на 70,3. При этом активность ингибиторов имела противоположную направленность: активность а-1ПИ была повышена на 33,8 %, тогда как активность а-2М, напротив, резко снижена в 3,8 раза. При неопластическом процессе происходит блокирование или извращение активности эндогенных ферментов-гидролаз, осуществляющих гибель опухолевых клеток, ингибиторами, секретируемыми самими клетками, что сокращает жизнеспособность ферментов и ослабляет индукцию апоптоза [6]. В связи с этим повышение а-1ПИ могло объединять активность ингибиторов и организма, и опухоли.
Таблица 1
Состояние трипсиноподобных протеиназ, ККС и ингибиторов плазмы крови у больных раком носоглотки
Исследуемый Здоровые Больные
показатель доноры раком носоглотки*
К, мед/мл 47,79±3,4 95,99±5,8
ПК, мед/мл 352,0±14,4 198,2±9,1
КОП, мкМ/мл 0,806±0,01 0,352±0,02
САТП, мЭЕ/мл 353,4±17,6 592,8±27,6
АТП, мЭЕ/мл 292,0±13,1 497,2±24,2
а-1ПИ, ИЕ/мл 27,81±1,0 37,22±1,7
а-2М, ИЕ/мл 4,232±0,1 1,124±0,05
*— различия достоверны по сравнению с плазмой крови здоровых доноров (р<0,01).
Наши результаты согласуются с данными об изменении состояния ККС, трипсиноподобных протеиназ и ингибиторов, общей активации протеолиза тканей и биологических жидкостей при онкологической патологии, полученными ранее [1 - 3, 10]. При различных локализациях злокачественного новообразования отклонения от нормы были однонаправленными, имели место различия лишь в амплитуде изменений показателей и коэффициентов взаимосвязи компонентов указанных систем крови [10, 11 и др.].
При малигнизации уменьшается сцепление между клетками, которые, теряя взаимную ориентацию и способность выстраивать монослой, начинают громоздиться друг на друга и безудержно размножаться. В процессах разрыхления внеклеточного матрикса участвуют сериновые протеиназы из лизосом нейтрофилов, катепсины, а также нейтральные протеиназы из макрофагов и фибробластов [12]. Появление больших количеств брадикинина, наблюдаемое и в нашем обследовании по активности К (табл. 1), обычно сопровождается дегрануляцией нейтрофилов и активацией протеи-наз внеклеточного матрикса [4]. Основной эффект нейтральных протеиназ (в том числе трипсинового типа) состоит в деструкции волокон базальной мембраны сосудов и участии в повышении сосудистой проницаемости [13]. Трипсин проявлял особые свойства: при контакте с фибробластами в культуре клеток изменял их биологические качества так же, как если бы они стали злокачественными: нормальные клетки ускользали от контактного торможения, выходили за пределы монослоя и начинали бурно размножаться [14]. При формировании неоплазмы в патогенезе развивающихся местных нарушений, кроме протеолитических ферментов, участвуют и биологически активные вещества, в том числе медиаторы воспаления - факторы контактной полисистемы крови и др. [1-4]. В результате их активации и сочетанного действия (особенно при изменении равновесия между ними) развиваются нарушения микроциркуляции, повышается проницаемость сосудов, появляется отек тканей и развивается ацидоз [4]. В условиях ацидоза проявляют свою активность кислые протеиназы, которые воздействуют на мембраны собственных структур, а также денатурируют а-2М, ряд регуляторных пептидов, в том числе и сам бради-кинин [13]. Активаторами калликреин-кининового каскада крови могут быть нейтральные и кислые протеи-назы из лизосом и других гранул нейтрофилов и мак-
рофагов. Некоторые из активированных компонентов комплемента являются индукторами высвобождения лизосомных ферментов из нейтрофилов и макрофагов [13], т.е. в данном случае можно говорить о непрерывной стимуляции образования кининов. ККС ткани также активируется в условиях ацидоза и вовлекается в процессы миграции и пролиферации опухолевых клеток, поскольку содержит факторы роста, способствует повышению проницаемости мембранных структур, развитию отека [10]. Высокая активность К, установленная нами в плазме крови, является отражением процессов, происходящих в ткани, и предполагает его активное участие в описанных клеточных и ферментативных взаимодействиях, направленных на пролиферацию опухолевых и миграцию эндотелиальных клеток. В результате освобождения кининов в ткани накапливаются токсичные окислы азота, усиливающие ацидоз и также блокирующие а-2М [4, 6].
При росте злокачественной опухоли некротические участки обычно распространяются с ткани на сосудистую стенку [15], что находит своё отражение в состоянии протеолитических систем крови и подтверждалось зарегистрированной в настоящем исследовании повышенной активностью трипсиноподоб-ных протеиназ (табл. 1). При исследовании плазмы крови больных раком носоглотки регистрировалась избыточная активация ККС, которая (табл. 1), выражалась в высокой активности калликреина (индуцирующего хемотаксис нейтрофилов и стимулирующего в них окислительные процессы). Об этом свидетельствовали коэффициенты соотношений, подсчитанные для взаимосвязанных протеиназ и баланса К с предшественником (табл. 2).
Таблица 2
Коэффициенты протеиназо-ингибиторных соотношений в плазме крови больных раком носоглотки
Коэффициенты Здоровые Больные
соотношений доноры раком носоглотки*
САТП/К 7,4±0,3 6,2±0,3
ПК/К 7,4±0,4 2,1±0,1
К/КОП 59,3±4,9 274±11,9
К/а-2М 11,3±0,8 85,0±3,6
САТП/а-2М 83,5±6,8 527±22,9
АТП/а-2М 69,0±5,7 442±19,2
САТП/а-1ПИ 12,7±0,9 15,9±0,7
АТП/а-1ПИ 10,5±0,6 13,4±0,6
* - различия достоверны по сравнению с коэффициентами доноров (р<0,01).
Так, САТП/К был ниже нормы на 19,4 %, а ПК/К -в 3,5 раза, что свидетельствовало об увеличении долевого участия К в суммарной активности трипсино-вых протеиназ и истощении его предшественника. Коэффициент К/КОП был увеличен в 4,6 раза, что свидетельствовало о преобладании образования ки-нинов практически без контроля карбоксипептидазой N. Следствием являлась гиперпродукция брадикинина (расширяющего артериолы и капилляры, повышающего проницаемость микрососудов и активирующего систему простагландинов) при сниженной активности карбоксипептидазы N. Это приводило к нарушению баланса между процессами вазоконстрикции и вазо-
дилятации, а также могло оказывать повреждающее действие на прилежащие ткани [4]. Очень важно свойство кининов освобождать цитокины, такие как интерлейкин-1, фактор некроза опухоли и другие мо-редиаты, из которых многие, в том числе простаглан-дины и лейкотриены, образуются в результате активации фосфолипазы А2 кининами [4]. Однако для реализации этих функций необходим постоянный контроль кининообразования карбоксипептидазами и ограничение активности калликреина ингибиторами. Известно, что ингибиторы протеиназ способны подавлять миграцию клеток как in vitro, так и in vivo [3, 12], это подтверждает важную роль а-1ПИ и а-2М в развитии противодействия организма злокачественной пролиферации. Блокируя увеличение активности протеиназ, обеспечивая их взаимодействие с рецепторами, оба ингибитора являются эффективными протекторами клеток от протеолитической деградации. В условиях онкологической ситуации осуществление такого контроля является жизненно важным условием. В крови больных раком носоглотки зарегистрированная резко сниженная активность а-2М и достоверно и умеренно повышенная активность а-1ПИ (табл. 1) изменили протеиназо-ингибиторное равновесие крови, о чём свидетельствовали коэффициенты соотношений, подсчитанные для их взаимодействия с ингибиторами (табл. 2). Баланс протеиназ с ингибитором а-2М отражают коэффициенты К/а-2М, САТП/а-2М и АТП/а-2М, которые были резко увеличены по отношению к норме в 7,5, 6,3 и 6,4 раз соответственно. Это подтверждало преобладание протеолитиче-ских процессов при дефиците универсального ингибитора, задачей которого является санация биологических сред организма. Коэффициенты САТП/а-1ПИ и АТП/а-1ПИ повышены на 25,2 и 27,6 % соответственно по сравнению с нормой. Иными словами, небольшого увеличения активности а-1ПИ было недостаточно для контроля трипсиновых протеиназ, что являлось отражением тканевой патологии и также свидетельствовало о преобладании процессов протео-литической деградации.
Таким образом, нарушения кровообращения, повреждение сосудов микроциркуляторного русла при местно-распространённом раке носоглотки, возможно, в значительной степени обусловлены не только активацией протеолиза при недостаточной ингиби-торной активности, установленной в наших исследованиях (табл. 1), но и разбалансировкой между кинин-образующим и кинин-разрушающим звеньями ККС, связанной с пониженной активностью карбоксипеп-тидаз (табл. 2). ККС ткани и плазмы крови могла быть вовлечена в процессы миграции и пролиферации опухолевых клеток, способствуя повышению проницаемости гистогематических барьеров, мембранных структур, развитию отека и освобождая факторы роста. Повышенная проницаемость сосудов микроцирку-ляторного русла могла усиливать экссудацию плазмы, миграцию лейкоцитов, макрофагов, эндотелиоцитов в межклеточное пространство, способствовать высвобождению гидролитических ферментов из лизосом нейтрофилов и макрофагов, что стимулировало в них окислительный метаболизм [2, 4]. По-видимому, наблюдаемые нами и другими авторами изменения в
активности трипсиновых протеиназ, ККС и основных ингибиторов крови и ткани при онкологических заболеваниях являются частью общей реакции организма на развитие неоплазмы, поскольку картина их изменений универсальна, хоть и не однозначна.
Выводы
1. При развитии злокачественного процесса в орга-нотканевом комплексе носоглотки нарушается протеи-назо-ингибиторное равновесие плазмы крови, выражающееся в росте активности трипсиноподобных про-теиназ при недостаточном антипротеолитическом контроле, что влечёт за собой нарушение сосудистой проницаемости, развитие отёка и миграцию клеток, способствующие процессам злокачественной пролиферации.
2. Патологическая активации ККС крови, выраженная в резкой активации калликреина, истощении его предшественника и снижении активности карбок-сипептидазы N, приводит к гиперпродукции свободных кининов, нарушающих стабильность стенок сосудов микроциркуляторного русла, активирующих провоспалительные факторы и опосредованно поддерживающих течение злокачественного процесса.
Литература
1. Сидоренко Ю.С., Мусиенко Н.В., Франциянц Е.М. Некоторые показатели активности протеолитической системы в ткани злокачественной опухоли при различных локализациях рака // Вестн. Южн. науч. центра. 2008. Т. 4, № 2. С. 93 - 98.
2. Total proteolytic activity and levels of the main proteinases inhibitors in blood plasma of mice bearing Lewis lung carcinoma upon development of resistance to cisplatin / V.F. Chekhun [et al.] // Exp. Oncol. 2005. Vol. 4, № 27. P. 286 - 289.
3. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion / W. Katarina [et al.] // Nature Cell Biol. 2007. Vol. 8, № 9. P. 893 - 904.
4. Яровая Г.А. Калликреин-кининовая система: новые факты и концепции (обзор). URL: http://www.informnauka.ru/ rus/2008/2008-06-06-8-163_r.htm (дата обращения: 12.03.2011).
5. Оглоблина О.Г., Арефьева Т.И. Роль протеолитиче-ских ферментов и их ингибиторов в инвазии злокачественных опухолей (обзор литературы) // Биохимия. 1994. Т. 59, вып. 3. С. 340 - 352.
6. Зорин Н.А., Зорина В.Н., Зорина Р.М. Роль альфа-2-макроглобулина при онкологических заболеваниях // Вопросы онкологии. 2004. Т. 50, № 5. С. 515 - 519.
7. Пасхина Т.С., Кринская А.В. Упрощенный метод определения калликреиногена и калликреина в сыворотке (плазме) крови человека в норме и при некоторых патологических состояниях // Вопросы мед. химии. 1974. Т. 20, вып. 6. С. 660 - 663.
8. Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. Унифицированный метод определения активности альфа-1-антитрипсина и альфа-2-макроглобулина в сыворотке (плазме) крови человека // Вопросы мед. химии. 1979. Т. 25, вып. 4. С. 494 - 500.
9. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам. М., 1990. 127 с.
10. Состояние кининовой и фибринолитической систем перифокальной зоны злокачественных глиом головного мозга / Е.М. Франциянц [и др.] // Рецидивная болезнь в плане оценки прогноза и выбора адекватного лечения: сб. ст. / под ред. Ю.С. Сидоренко. М., 2010. С. 564 - 572.
11. Кининовая и фибринолитическая системы крови крыс в динамике формирования перевитой опухоли С-45 / Л.С. Козлова [и др.] // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Ес-теств. науки. 2010. № 3. С. 78 - 80.
12. Капустина И.Н., Сидорова И.С. Межклеточное взаимодействие в васкуляризации и прогрессии опухолей // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. 2004. Вып. 2. С. 48 - 52.
13. Dean R.T. Cellular degradative processes. L.; N.Y., 1981. 120 p.
14. BurgerM.M. Proteolytic enzymes initiating cell division and escape from contact ingibition of growth // Nature. 1970. Vol. 227. P. 170 - 171.
15. Enam S.A., Rock J.P., Rosenblum M.L. Malignant glioma // Neurooncology. The Essentials. N.Y., 2000. Ch. 31. P. 309 - 318.
Поступила в редакцию 19 апреля 2011 г.
