CC BY
40
2007 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 3. Вып. 1
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК 576.32; 611.83
Ю. А. Толкунов, А. Д. Ноздрачее
ПЕРВИЧНЫЕ АФФЕРЕНТНЫЕ И ДВИГАТЕЛЬНЫЕ НЕЙРОНЫ ТОНКОЙ КИШКИ МОРСКОЙ СВИНКИ
Важное значение для понимания механизмов функционирования нервных сетей в стенках внутренних органов имеет исследование соотношения или корреляции морфологических и электрофизиологических свойств нейронов, которые компактно расположены в связанных между собой интрамуральных метасимпатических ганглиях [ 1 ]. Тела первичных афферентных нейронов, которые участвуют в рецепции химических и механических воздействий в стенке кишки, могут быть расположены в самой ее стенке, а также за пределами органа в пара- и превертебральных симпатических и парасимпатических ганглиях. В соответствии с этим чувствительные нейроны подразделяются на первичные внутренние и внешние [10].
Известно, что активация импульсной активности в первичных внутренних афферентных нейронах межмышечного сплетения тонкой кишки морской свинки происходит под влиянием, например, соляной кислоты [2,6]. Кроме того, эти первичные афферентные нейроны активируются при механической деформации ее слизистой оболочки и развитии сократительных реакций гладких мышц [8]. Данные реакции прежде всего обусловлены освобождением серо гонина из энтерохромаффинных клеток слизистой оболочки органа и его воздействием на дендриты первичных афферентных нейронов [5].
С другой стороны, первичные внутренние афферентные нейроны (клетки Догеля II типа), так же как и двигательные нейроны (клетки Догеля I типа), по своей химической природе в основном, вероятно, являются холинергическими [И, 13]. Поэтому исследование структурных и функциональных характеристик этих клеток, а также особенностей развития потенциалов действия в них в зависимости от места нанесения стимулирующих воздействий представляет особый интерес. Интерес этот усиливается тем, что таким образом становится ясной базовая иннервация органа, суть которой сводится к взаимодействию местных висцеро-висцеральных рефлексов, формирующих в конечном счете функциональную сеть органа.
Цель настоящей работы - исследование структурных и функциональных характеристик первичных афферентных и двигательных нейронов (клеток Догеля I и II типа) в метасимпатических (интрамуральных) ганглиях межмышечного сплетения тонкой кишки морской свинки.
Методика исследования. Опыты проводились на морских свинках массой 450-800 г, которые в ходе эксперимента находились под уретановым наркозом. Уретан применяли из расчета 1.5 г на 1 кг массы животного. В процессе опыта извлекали тонкую кишку длиной около 5 см и размещали ее на предметном столике со встроенной системой освещения [2, 6]. Сверху исследу-
© Ю. А.Толкунов, А. Д. Ноздрачев, 2006
емый участок органа прикрывали прозрачной пластинкой из органического стекла с тремя отверстиями (каждое - диаметром около 1 мм), расположенными на одной линии. Среднее из них предназначалось для работы с микроэлектродами, а два других - для аппликации различных веществ. Через отверстия осуществлялась также постоянная перфузия кишки модифицированным физиологическим раствором Кребса следующего состава: 117 ммоль/л NaCl, 5 ммоль/л KCl, 1.2 ммоль/л MgS04, 25 ммоль/л NaHCOr 1.2 ммоль/л NaH.rPO., 2.5 ммоль/л СаС12, 10 ммоль/л глюкозы при температуре + 37 °С и pH 7.2-7,4. Температуру в ходе опыта поддерживали с помощью ультратермостата U-10.
Регистрацию мембранного потенциала покоя нервных клеток осуществляли внутриклеточ-но с помощью стеклянных микроэлектродов. Микроэлектроды заполняли 2,5 моль/л раствором KCl. Соединение микроэлектродов с входным каскадом усилителя осуществлялось посредством неполяризующихся хлор серебряных электродов. Регистрацию электрических сигналов производили с помощью операционного усилителя, аналого-цифрового преобразователя MD93 (фирма «Элкус», С.-Петербург) и персонального компьютера «Pentium». Регистрируемый с выхода усилителя сигнал оцифровывался по специально разработанной программе 16-разрядным аналого-цифровым преобразователем с интервалом оцифровки 10 мке и анализировался в режиме реального времени. В ходе записи можно было регистрировать значения мембранных потенциалов покоя, амплитуду и временное параметры развивающихся потенциалов действия.
В опытах на препаратах тонкой кишки ее фрагмент длиной 2-3 см разрезали в продольном направлении и располагали на предметном стекле. Для того чтобы увидеть изучавшиеся нейроны в ганглиях кишки, применялось предварительное окрашивание объекта в течение 10-15 мин метиленовьш синим в концентрации 110-6 моль/л, который разводили в физиологическом растворе. После отмывания красителя в течение 3-5 мин клетки Догеля I и II типа можно было идентифицировать по размерам и форме. Необходимые линейные измерения клеток производили с помощью сетчатого окуляр-микрометра (цена деления окуляр-микрометра - 2 мкм, общее увеличение микроскопа - 200х), установленного на микроскопе Reichard (Carl Zeiss, Jena).
Чтобы оценить чувствительность нейронов к действию серотонина и ацетилхолина, микроаппликации этих вещества производили в различных концентрациях на поверхность тонкой кишки с помощью специального микрошприца. В опытах использовали серотонин-креатинин сульфат (Reanal, Венгрия) в концентрациях 1-10"12— 1 ■ 10 9 моль/л и ацетилхолин-иодит (INC Biomedical Inc.) в концентрациях 1-10"7-1-10"6 моль/л. Фармакологический анализ развития потенциалов действия в первичных афферентных и двигательных нейронах осуществляли с помощью блокатора мускариновых холинорецепторов - атропина-сульфата в концентрации М0~9 моль/л.
Обработку результатов исследования производили с помощью компьютерной программы NCSS, достоверность различия средних осуществляли по критерию Фишера-Стьюдента. Все данные представлены как М±т.
Результаты исследования и их обсуждение. Предпринятые нами микроскопические исследования показали, что ганглии в стенке кишки на всем ее протяжении распределены неравномерно. Наибольшее их число имеется в двенадцатиперстной кишке. В самих ганглиях крупных нейронов с многочисленными отростками (клеток Догеля II типа) также значительно больше в двенадцатиперстной кишке, чем в других участках тонкой кишки. По мере перемещения вдоль органа в каудальном направлении число клеток Догеля II типа уменьшалось, снижалось также и их общее количество в отдельных ганглиях. В конечном отделе тонкой кишки ганглии встречались относительно редко, хотя без труда можно было видеть характерное переплетение нервных волокон. Таким образом, нервные клетки в ганглиях и сами ганглии представлены неравномерно по направлению от начального к конечному отделу исследуемой части пищеварительного канала.
Для общей характеристики распределения нейронов в ганглиях межмышечного сплетения двенадцатиперстной и начального отдела тощей кишки были проведены специ-
альные исследования 50 ганглиев. Оказалось, что минимальное количество нервных клеток в них составляло 4, максимальное - 48. Среднее количество нейронов в ганглиях равнялось 17±1. Наиболее часто встречались ганглии, которые содержали от 11 до 24 нервных клеток.
Далее было необходимо определить размеры и соотношение встречаемости различных типов нейронов (клеток Догеля I и II типа). Следует напомнить, что по классификации А. С. Догеля клетки I типа считаются типичными двигательными нейронами с одним отростком (аксоном), в то время как клетки II типа (первичные афферентные нейроны) имеют большое число отростков. Несмотря на то, что по существующим представлениям первые из них имеют меньшие размеры, возникает необходимость иметь четкие количественные критерии их линейных размеров в дополнение к приведенным морфологическим различиям. Тем более современные оптические возможности позволяют это сделать. Было исследовано ровно 100 нервных клеток. Для повышения точности измерений первичные афферентные нейроны просматривались в двенадцатиперстной кишке, двигательные нейроны - в тощей кишке.
Так как известно, что первичные афферентные нейроны (клетки Догеля II типа) имеют множество отростков, выбирались клетки, соответствующие именно этому описанию. Их максимальный диаметр составил 30 мкм, минимальный - 10 мкм. Средний линейный размер первичного афферентного нейрона оказался равным (с учетом точности измерения) 19±2 мкм. Важно отметить, что чаще всего встречались клетки с линейным размером около 20 мкм, реже - от 10 до 12 мкм и от 27 до 30 мкм.
Далее, подобным образом были оценены линейные размеры также 100 клеток, соответствующих описанию двигательных нейронов (клеток Догеля I типа). Их максимальный линейный размер составил 25 мкм, минимальный - 5 мкм. Средний линейный размер оказался равным 13 2 мкм. Наиболее часто встречались клетки с линейными размерами от 10 до 12 мкм. При сопоставлении этих показателей с рассмотренными выше оказалось, что линейные размеры первичных афферентных и двигательных нейронов достоверно различаются (р<0.01). Отметим еще раз, что клетки Догеля II типа в большем количестве встречаются в двенадцатиперстной кишке и число их в ганглиях постепенно уменьшается в проксимальном отделе тощей кишки.
Теперь об электрофизиологических показателях. Значения мембранных потенциалов покоя в 100 первичных афферентных нейронах (клетках Догеля II типа) в среднем составляло -54.0±1.1 мВ при диапазоне колебаний от -30 мВ до -70 мВ. Наиболее часто встречаемые величины мембранного потенциала этих нейронов оказались расположены в диапазоне от - 57 до -66 мВ.
В 100 двигательных нейронах (клетках Догеля I типа) также были зарегистрированы мембранные потенциалы покоя в диапазоне от -30 до -70 мВ. Среднее значение в этом случае составило -52.2±1.0 мВ. Чаще всего встречались нейроны, мембранный потенциал которых находился в диапазоне от -53 мВ до -62 мВ. Сравнение величины мембранных потенциалов покоя первичных афферентных и двигательных нейронов свидетельствует о том, что они достоверно не отличаются друг от друга (р>0.05). Поэтому для проведения физиологических исследований предварительная морфологическая идентификация соответствующих клеток по размеру и форме имеет существенное значение.
Известно, что первичные афферентные и двигательные нейроны в ганглиях тонкой кишки по своей природе являются в основном холинергическими [1,2,6]. Проведенные нами специальные исследования показали, что активация и первичных афферентных, и двигательных (моторных) нейронов в стенке тонкой кишки происходит при аппликациях серотонина, а также ацетилхолина. Здесь важно отметить, что первичные афферент-
1 мс
1 мс
СГ
1 О мВ
Ж
Рис. 1. Потенциалы действия в первичных афферентных нейронах межмышечного сплетения тонкой кишки морской свинки при действии серотонина (СТ) (110 й моль/л) и ацетилхолина (АХ) (1-Ю-6 моль/л).
ные нейроны активируются при нанесении того и другого вещества на расстоянии нескольких миллиметров от места регистрации и передача импульсов происходит исключительно в восходящем направлении [2, 6]. Нанесение ацетилхолина и серотонина на сому первичного афферентного нейрона развития потенциалов действия не вызывает.
Таким образом, для развития потенциалов действия в первичных афферентных нейронах необходима предварительная активация соответствующих чувствительных денд-ритов. Использование серотонина в пороговой концентрации (1 • 10"12-1 ■ -10"11 моль/л) вызывает развитие монофазных, применение ацетилхолина в пороговой концентрации (5-10~7-1-10~6 моль/л) - двухфазных (с длительной следовой гиперполяризацией) потенциалов действия в этих клетках (рис. 1).
Важно отметить еще одно обстоятельство, касающееся того, что увеличение расстояния аппликации серотонина от места регистрации (так, чтобы между ними был расположен еще по крайней мере один ганглий) приводит к тому, что в первичном афферентном нейроне будет развиваться типичный потенциал действия, вызываемый примене-
1 мс
1 мс
Ж
1 0 мВ
СГ
1 о
мВ
Рис. 2. Потенциалы действия в двигательных нейронах межмышечного сплетения тонкой кишки морской свинки при действии ацетилхолина (АХ) (МО4' моль/л) и серотонина (СТ) (МО-11 моль/л).
нием ацетилхолина. Развитие двухфазных потенциалов действия (со следовой гиперполяризацией) при действии ацетилхолина и серотонина угнеталось предварительным применением атропина в концентрации 1 ■ 10 9 моль/л. Следовательно, взаимодействие первичных афферентных нейронов в рассматриваемом случае происходит за пределами ганглиев и основным типом взаимодействия между ними является аксо-дендритный контакт, в котором происходит освобождение ацетилхолина.
Что касается двигательных нейронов, то развитие потенциалов действия в них происходило при непосредственной аппликации ацетилхолина на сому клетки (рис, 2). Здесь будет уместным отметить, что специальные исследования показали наличие между двигательными нейронами в ганглиях восходящих и нисходящих связей [3]. Таким образом, в отличие от первичных афферентных клеток, двигательные нейроны связаны друг с другом с помощью аксо-соматических синапсов, основным медиатором в которых является ацетилхолин. Развитие потенциалов действия в двигательных нейронах можно вызвать также с помощью серотонина (МО11 - 1-10-9 моль/л) при его нанесении в каудальном, относительно места регистрации, направлении. При этом в двигательном нейроне возникает типичный холинергический потенциал действия (см. рис. 2). Так же как у афферентных нейронов, развитие двухфазных потенциалов действия (со следовой гиперполяризацией) при действии ацетилхолина и серотонина угнеталось предварительным применением атропина в концентрации 1-10~9 моль/л. Стало быть, передача возбуждения от первичных афферентных нейронов (клеток Догеля II типа), которые активируются серо-тонином, к двигательным нейронам (клеткам Догеля I типа), которые могут выполнять также функцию вставочных нейронов [3], происходит с помощью другого нейромедиато-ра - ацетилхолина.
Специальный сравнительный статистический анализ показал, что длительность монофазных потенциалов действия в первичных афферентных нейронах при аппликациях серотонина (1-10 12 - 1-10 11 моль/л) составляет 1.25±0.17 мс (п=40), а длительность двухфазных потенциалов действия в этих же нейронах при применении ацетилхолина (5-10-7 - МО-6 моль/л) оказался равным 4.2±0.8 мс (я-40) (р<0.05), причем 2.1 ±0.4 мс относится к периоду следовой гиперполяризации. В двигательных нейронах серотонин (1-10 11 - 110 9 моль/л) вызывал развитие двухфазных потенциалов действия с общей длительностью 3.1+1.1 мс (период следовой гиперполяризации - 2.3±1.1 мс) (п=21). Применение ацетилхолина (5-10 7 - 140 е моль/л), так же как и в первичных афферентных нейронах, сопровождалось развитием двухфазных потенциалов действия длительностью 3.2±1.6 мс (период следовой гиперполяризации - 1.9±1.1 мс) (п=30). Нельзя не заметить, что параметры развития потенциалов действия в двигательных нейронах при действии пороговых концентраций серотонина и ацетилхолина чрезвычайно близки друг к другу и не имеют статистически значимых различий (р>0.05). Также не имеют подобных различий длительности периодов следовой гиперполяризации в тех и других клетках. Эта особенность позволяет предполагать, что развитие рассматриваемых констант в тех и других нейронах обусловлено развитием одних и тех же ионных процессов. Специальные исследования других авторов [9,10] показали, что при действии ацетилхолина в первичных афферентных нейронах происходит Са2+ - зависимое освобождение ионов К+.
Ранее проведенные морфологические исследования показали, что отдельный мета-симпатический (интрамуральный) ганглий может содержать до 60 нервных клеток [1, 4]. Настоящие опыты свидетельствуют о том, что количество нейронов в ганглиях уменьшается в направлении от двенадцатиперстной кишки к конечным участкам тощей кишки. Число же нейронов в отдельных ганглиях постепенно снижается с 48 до 4. Как уже
упоминалось, ранее было принято считать, что линейный размер клеток Догеля II типа достигает 25 мкм [1]. Результаты настоящих исследований показывают, что их размеры близки к этой величине, средний линейный размер первичных афферентных нейронов составил 19±2 мкм, двигательных нейронов - 13±2 мкм. Установлено также, что имеется достоверное различие в линейных размерах первичных афферентных и двигательных нейронов.
Наряду с совпадениями показателей предыдущих исследований [7,12], отличительной особенностью данной работы является то, что, используя оригинальный методический подход, удалось показать, что первичные афферентные и двигательные нейроны в стенке кишки имеют не только четкие морфологические характеристики, но еще и то, что первичные внутренние афферентные нейроны в стенке кишки связаны, по-видимо-му, друг с другом с помощью аксо-дендритных синапсов, двигательные же нейроны - с помощью аксо-соматических контактов. Полученные в данной работе сведения могут оказаться весьма полезными и необходимыми для понимания координации и управления происходящими в стенке кишки висцеро-висцеральными процессами, охватывающими моторные, секреторные, эндокринные, иммунные, микроциркуляторные и другие функции, характерные для висцеральных органов и систем.
Работа выполнена при поддержке гранта НШ-2549.2006.4. Summary
Tolkunov Yu. А. , Nozdrachev A. D. The primary afferents and motoneuros in the guinea pig small
intestine.
The studies on preparation of the small intestine have shown that diameters of primary afferent neurons (i 9±2 p) and motor neurons (13±2 p) significantly differ. The primary afferent neurons (Dogiel type II neurons) are mostly present in duodenum and less in a proximal section of the intestine. Membrane potential in primary afferent neurons is -54±1.1 mV and 52+1.0 mV in motor neurons. Serotonin (5-hydroxytryptamine) and acetylcholine cause action potentials in primary afferent neurons and motor neurons. The primary afferent neurons are activated with application of these substances few mm caudally from the place of the registrations. The applications of acetylcholine and serotonin (5-hydroxytryptamine) to soma of primary afferent neurons does not cause the development of action potentials. Probably that primary afferent neurons are connected with axson-dendrite contact and motor neurons have axon-somatic contacts.
Литература
i. Ноздрачев А. Д. Физиология вегетативной нервной системы // Л., 1983.2. Ноздрачев А. Д., Лопатина Е. В., Толкунов Ю. А. Один из механизмов рецепции соляной кислоты в тонкой кишке // ДАН. 2003. Т. 388. № 2. С. 278-281. 3. Ноздрачев А. Д.. Толкунов Ю. Л., Лощагин О. В., Орешкова С. Д. Идентификация и тестирование одноаксональных нейронов (клеток Догеля I типа) в миентеральном сплетении тонкой кишки морской свинки // ДАН. 2004. Т. 394. №2. С. 1-3. 4. Скок В. И. Физиология вегетативных ганглиев. Л., 1970.5. Сотников О. С., Лукашин В. Г., Чихман В. #., Соловьева И. А. Количественный компьютерный анализ асинаптических дендритов сенсорных нейронов метасимиатической нервной системы // Механизмы функционирования висцеральных систем (III Всероссийская конференция с межд. участием, посвященная 175-летию со дня рождения Ф.В. Овсянникова). Тез. докл. 29 сент.-1 окт. 2003 г., Санкт-Петербург. С. 309-310.
6. Толкунов Ю.А. Сенсорные нейроны метасимпатических (интрамуральных) ганглиев тонкой кишки морской свинки // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 2. С. 221-229.
7. Cornelissen W., De Laet A., Kroese А. В. A., Van Bogaert P.-P., Scheuermann D. W., TimmermansJ.-P. Electrophysiological features of morphological Dogiel type II neurons in the myenteric plexus of pig small intestine //J. Neurophysiol. 2000. Vol. 8. P. 102-111. 8. Costa M„ Brookes S.J. #.,
Hennig G. W. Anatomy and physiology of the enteric nervous system // Gut. 2000. Vol. 47 (Suppl IV). P. iv 15—ivl9. 9. FurnessJ. В., Clerc N„ Kunce W. .4. A. Memory in the enteric nervous system // Gut. 2000. Vol. 47 (Suppl IV). P. iv60-iv 62.10 .Furness J. В., Jones C.,NurgaliK., Clerc N. Intrinstic primary afferent neurons and nerve circuits within the intestine // Progress in Neurobiology. 2004. Vol. 72. P. 143-164. 11. Nurgali K., Furness J. В., Stebbing M. J. Correlation of electrophysiology, shape and synaptic properties of myenteric AH neurons of the guinea pig distal colon // Auton. Neurosci. 2003 a. Vol. 103. P. 50-64.12. Nurgali K., Stebbing M. J., Furness J. B. Correlation of electrophysiologyical and morphlogical characteristics of the enteric neurons in the mouse colon // J. Сотр. Neurol. 2003 b. Vol. 468. N 1. P. 112-124.13. Tamura K., Ito H., Wade P. R. Morphology, electrophysiology, and calbindin immunnoreactivity of myenteric neurons in the guinea pig distal colon //J. Сотр. Neurol. 2001. Vol. 437. N 4. P. 423-437"
Статья принята к печати 2 октября 2006 г.
