CC BY
13
(Lonza, Швейцария) в течение 24 и 48 часов, соответственно. Оценку люминол-зависимой и ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат)-индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов и макрофагов проводили с помощью хемилю-менометра Lum-100 и определяли максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (Imax). Обработка данных проводились в программе PowerGraph, STATISTICA 8.0.
В сокультуре с гипоксическими ММСК установлено увеличение Imax как спонтанной люминол-зависимой хеми-люминесценции нейтрофилов до 0,53 (0,33-1,40) мВ, так и ФМА-стимулированной до 12,46 (6,22-23,54) мВ относительно ко-культур с ММСК, культивируемых в условиях нормоксии (0,21 (0,10-0,63) мВ и 4,03 (3,84-19,44) мВ, соответственно, p<0,05). В то же время в ко-культурах с макрофагами отмечалось повышение ФМА-стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции в присутствии гипоксических ММСК до 8,08 (4,16-12,00) мВ относительно ММСК, культивируемых в условиях нормоксии (1,28 (0,86-1,70), p<0,05), при отсутствии статистически значимых изменений в спонтанной люминол-зависимой хемилюминесценции макрофагальных фагоцитов.
Таким образом, пробоподготовка ММСК в условиях гипоксии способствует усилению стимулированной хеми-люминесцентной активности нейтрофилов и макрофагов. Результаты исследования согласуются с данными Cassatella и соавт., которые показали, что ММСК могут поддерживать и сохранять жизнеспособность и функции фагоцитов за счет согласованного действия эндогенно продуцируемых интерлейкина 6 и интерферона р, определяющих большинство иммуномодулирующих эффектов [2]. Исследования выполнены в рамках НИР № 05/22 «Антиокислительный и регенеративный потенциал мультипотентных мезенхи-мальных стромальных клеток в условиях гипоксии» (грант Министерства образования Республики Беларусь).
Литература:
1. Lapuente J.P., Blazquez-Martinez A., Marco-Brualla J. et al. Bio-
molecules. 2022. V. 12. № 534.
2. Cassatella M.A., Mosna F., Micheletti A. et al. Stem Cells. 2011.
V. 29. P. 1008.
ПРИМЕНЕНИЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В РЕКОНСТРУКЦИИ ГОЛОСОВЫХ СКЛАДОК
М.В. Свистушкин1, А.А. Бакулина2, проф. С.В. Старостина1, проф. А.Б. Шехтер2, А.И. Шпичка2, А.Л. Файзуллин2,
A.В. Золотова1, А.Н. Никифорова1, проф.
B.М. Свистушкин1, П.С. Тимашев2
1 Кафедра болезней уха, горла и носа Института Клинической Медицины им. Н.В. Склифосовского, Москва, Россия
2 Институт регенеративной медицины, ФГАОУ
ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки, голосовые складки, слизистая гортани, рубцевание, клеточная терапия.
Рубцевание голосовых складок (ГС), приводящее к стойкому нарушению голосовой функции, является одной из самых сложных проблем в отоларингологии. В настоящее время, несмотря на существующее разнообразие подходов к лечению, не существует метода для восстановления
структурных и вибрационных характеристик ГС. Разработка методов лечения, основанных на клеточной терапии, открывает новые перспективы в этом направлении.
Целью данного исследования являлось изучение потенциала мезенхимных стромальных клеток (МСК), полученных из костного мозга человека, в восстановлении морфологических и механических характеристик (ГС) при рубцевании in vivo.
Экспериментальная модель включала формирование дефекта голосовой связки и имплантацию клеточного продукта через 3 месяца путём инъекции во вторичную рану ГС после иссечения рубца. В эксперименте было задействовано 30 кроликов, которым проводили резекцию средней 1/3 ГС. На основании вида имплантируемого материала были сформированы 4 группы по 6 животных: 1 группа — физиологический раствор,
2 группа — полиэтиленгликоль(ПЭГ)-фибриновый гель,
3 группа — суспензия МСК костного мозга человека,
4 группа — комплекс МСК с ПЭГ-фибриновым гелем, в качестве группы чистого контроля были взяты 6 интактных голосовых складок из биобанка. Для оценки выживаемости клеток 3 животным была имплантирована суспензия МСК человека, трасдуцированных лентивирусным вектором, экспрессирующим зелёный флюоресцирующий белок (GFP) и 3 животным — комплекс МСК и ПЭГ-фибринового геля, содержащим аналогичные клетки. 24 кролика из экспериментальных групп 1-4 выводились из эксперимента через 3 месяца после имплантации клеточной культуры, 6 кроликов — с имплантированными МСК-GFP в суспензии и геле через 3 дня после имплантации.
По результатам морфологических, механических и вибрационных исследований было выявлено, что МСК костного мозга человека способствует регенерации ГС, приближая её морфологические и механические свойства к нативным, не выявлено статистически значимых отличий от интактных голосовых складок (р=0,898 — МСК в комплексе с ПЭГ-фибриновым гелем). Рубцы после клеточной терапии отличаются меньшей толщиной собственной пластинки ГС (р<0,05), восстановлением архитектоники кол-лагеновых структур (р<0,05 — для МСК в комплексе с ПЭГ-фибриновым гелем). Применение ПЭГ-фибринового геля в качестве клеточного носителя снижает интенсивность интраоперационного кровотечения (p=0,03945), не увеличивает риск дыхательных нарушений в раннем послеоперационном периоде (p — от 0,9497 до 1) и уменьшает потерю клеток при имплантации.
Полученные результаты демонстрируют механизмы восстановления голосовых складок при имплантации МСК костного мозга после иссечения рубца, показывая перспективы развития данного направления и необходимость дальнейших исследований.
ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННЫЙ ПОДХОД К СОЗДАНИЮ И ИЗГОТОВЛЕНИЮ БИОРАЗЛАГАЕМЫХ КЕЙДЖЕЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ 3D-ПЕЧАТИ
Н.Г. Седуш1, А.Е. Крупнин1, Е.П. Банин1, М.М. Алексанян2, А.Г. Аганесов2, С.Н. Чвалун1
1 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 ФГБНУ Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: биоразлагаемые имплантаты, спондило-дез, полилактид, персонализированные медицинские изделия, 3й-печать.
Гены & Клетки XVII, №3, 2G22
Бурное развитие аддитивных технологий в последнее десятилетие открыло возможность изготовления персонализированных медицинских изделий, в том числе сложной формы, оптимизированных под конкретного пациента. Особенно перспективным направлением представляется получение биоразлагаемых имплантатов, распадающихся в организме после выполнения своей функции на безопасные продукты. Стандартом хирургического лечения пациентов с грыжами межпозвонковых дисков является дискэк-томия. Для создания спондилодеза после дискэктомии применяются межпозвонковые кейджи. В настоящее время в практике применяются неразлагаемые кейджи из титана, керамики и PEEK. Однако их использование может быть сопряжено с рядом осложнений в долгосрочном периоде: псевдоартроз, проседание или смещение имплантата, осте-опороз и др. Целью настоящего исследования было создание персонализированного биоразлагаемого кейджа на основе полилактида для сращения поясничных позвонков.
На первом этапе по данным КТ пациента создавали трехмерную твердотельную модель сегмента позвоночника, требующего лечения. Далее по полученной модели создавали трехмерную модель персонализированного межтелового кейджа. Форма и размер кейджа в точности соответствовали анатомии позвоночника, а его высота определялась необходимым расстоянием между телами позвонков. Кейдж состоял из внешнего сплошного контура, обеспечивающего несущую способность и прочность изделия, и внутренней пористой части (скаффолда) для прорастания через нее костной ткани. Изделие изготавливали из биоразлагаемого полимера полилактида (PLA) методом FDM-печати на 3й-принтере Picaso Designer PRO 250. Кейдж дополнительно покрывали гидроксиа-патитом, который обладает остеоиндуктивными и осте-окондуктивными свойствами. Механические испытания кейджа на сжатие были проведены на испытательной машине INSTRON 5965 при температуре 37°С. Установлено, что изделие способно выдерживать усилие как минимум в 500 кг, что гарантирует прочность и целостность имплантата при физиологических нагрузках. Методом 3D-печати также изготавливали необходимую для установки кейд-жа пластину и винты. Дизайн пластины оптимизировали с применением конечно-элементного моделирования, что позволило создать наиболее ажурную и легкую конструкцию. Для верификации способности оптимизированной пластины выдерживать физиологические нагрузки провели численный анализ напряженно-деформированного состояния при следующих условиях: нагрузка 100 кг, изгибающий момент 700 Н-мм. Установлено, что возникающие напряжения достигали 43 МПа и не превышали предела прочности материала (70 МПа). Таким образом, показано, что метод 3D-печати является перспективным при изготовлении персонализированного кейджа и фиксирующей пластины для спондилодеза.
ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ПЛЕНОЧНЫХ РАНЕВЫХ ПОКРЫТИЙ НА ОСНОВЕ ХИТИН-ХИТОЗАНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ИЗ БИОМАССЫ ВЫСШИХ ГРИБОВ
Н.М. Семенихина, Д.В. Минаков, А.А. Минакова, Д.А. Филиппенко
ФГБОУ ВО Алтайский государственный университет, Барнаул, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: регенеративная медицина, раневые покрытия, хитин, хитозан, культуры клеток, цитотоксичность.
В современной биомедицине при лечении ран особое внимание уделяется использованию нетоксичных, антибактериальных, биосовместимых и биодегради-руемых полимерных волокон, таких как, хитин и его производное — хитозан. Альтернативным источником получения хитина может выступать биомасса высших грибов, полученных биотехнологическим способом. В связи с чем, разработка ранозаживляющих композиций на их основе является актуальным направлением исследований [1].
В качестве объектов исследования послужили пленочные материалы, полученные на основе хитин-глюка-новых комплексов и их производных, выделенных из биомассы гриба A. mellea.
Исследование проводили согласно ГОСТ ISO 10993-5-2011. При этом оценивали три вида покрытий на основе карбоксиметилированного хитин-глю-канового комплекса (1 группа), хитин-глюканового комплекса (2 группа), хитозан-глюканового комплекса (3 группа). Перед исследованием образцы подвергали автоклавированию. Оценку цитотоксичности проводили методом экстракции. В качестве клеточной культуры использовали 5 пассаж дермальных фи-бробластов, выделенных из кожи человека. При этом предварительно подготавливали монослой клеток, чтобы он достигал не менее 80%.
Качественную оценку клеток проводили путём визуального осмотра окрашенных кристаллвиолетом клеток под микроскопом (Nicon). Оценивали изменение морфологии клеток опытных групп и сравнивали с контролем. Количественную оценку (пролифератив-ную активность) проводили при помощи XTT-теста (PanReac Applichem).
В ходе исследований при визуальном осмотре нами было выявлено минимальное количество различий по морфологии между первой и контрольной группами, в частности по характеру расположения клеток. Фибробласты из второй группы изменили свою первоначальную веретеновидную форму на звездчатую и имели неодинаковый размер. Клетки третьей опытной группы не образовывали монослой, располагались отдельными кластерами, но сохраняли ядро.
При проведении ХХТ теста были выявлены схожие результаты после 4 и 6 часов культивирования. При этом максимальные значения были отмечены в контрольной группе, что связано с высокой пролиферативной активностью без воздействия токсических факторов. В опытной группе минимальные значения теста были выявлены в третьей опытной группе, что соответствует хитозан-глюкановому комплексу.
Таким образом, разрабатываемые раневые покрытия на основе хитин-хитозановых комплексов, обладают в той или иной мере степенью токсичности, которая связана в первую очередь с замедлением пролиферации клеток. При этом пленка на основе карбоксиметилиро-ванного хитин-глюканового комплекса проявила самую низкую токсичность, в связи с чем, может быть рекомендована для дальнейших испытаний.
Литература:
1. Минакова, А.А. Химические проблемы современности — Донецк, 2022. — С.284-287.
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
