CC BY
5
УДК: 577.21
Венедиктова Д.Н., Баурина М.М.
ПЕРЕКЛОНИРОВАНИЕ ПЦР АМПЛИКОНОВ С ГЕНОМ ЗЕЛЁНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА МЕДУЗЫ AEQUOREA VICTORIA В ШТАММ -ПРОДУЦЕНТ E.COLITG1 ПРИ ПОМОЩИ PAL2-T -ВЕКТОРА
Венедиктова Диана Николаевна студентка 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Баурина Марина Михайловна - кандидат химических наук, доцент, доцент кафедры биотехнологии; email: baurinamm@mail.ru.
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева», Москва, Россия; 125480, ул. Героев Панфиловцев, дом 20.
В статье исследуется способность к экспрессии в штамме продуценте Escherichia coli TG1 двух модификаций зелёного флуоресцентного белка GFP (sf GFP и pBAD GFP), а также изучается интенсивность флуоресценции данных белков в клетках E. coli.
Ключевые слова: GFP, sf GFP, pBAD GFP, флуоресцентные белки, переклонирование, ПЦР, Escherichia coli, PAL2-T-вектор.
RECLONING OF PCR AMPLICONS WITH THE GENE OF THE GREEN FLUORESCENT PROTEIN OF THE JELLYFISH AEQUOREA VICTORIA INTO THE PRODUCER STRAIN E.COLI TG1 USING THE PAL2-T VECTOR
Venediktova Diana Nikolaevna 4th year student of the Faculty of Biotechnology and Industrial Ecology; Baurina Marina Mikhaylovna - Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Biotechnology;
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "D.I. Mendeleev Russian University of Chemical Technology", Moscow, Russia; 20 Geroyev Panfilovtsev str., 125480.
The article investigates the ability to express two modifications of the green fluorescent protein GFP (sf GFP and pBAD GFP) in Escherichia coli TG1 producer strain, also the fluorescence intensity of these proteins in E. coli is studied. Keywords: GFP, sf GFP, pBAD GFP, fluorescent proteins, recloning, PCR, E. coli, PAL2-T vector.
Динамические процессы изменения экспрессии генов в организме и его морфологические изменения представляют большой интерес. На данный момент существует множество методов, которые дают возможность изучить не только эти процессы, но и получать данные о количественных изменениях продуктов в различных клетках. В настоящий момент эти методы не дают полной картины о функции генов, из-за отсутствия данных о локализации исследуемых продуктов в клетке, поскольку маркерные белки, использованные при решении данной проблемы, затрудняли анализ динамики накопления и местоположения изучаемого белка.
Ответом на данную проблему стал зелёный флуоресцентный белок GFP (green fluorescent protein), выделенный из медузы Aequorea victoria, который широко используется в качестве маркера в клеточной и молекулярной биологии. Зелёный флуоресцентный белок GFP отличается небольшим размером (239 аминокислот) и устойчивостью к действию внутриклеточных протеаз. Белок даёт возможность визуализировать множество процессов
происходящих в клетке.
Способность GFP образовывать хромофор без участия кофактора в процессе автокаталитической циклизации позволяет ему быть более стабильным по сравнению с другими маркерными белками. Данное свойство флуоресцентного белка позволило использовать его в живых системах. Также GFP при
слиянии с белком не изменяет функцию или местоположение белка [1].
Биолюминесценция - процесс, при котором видимый свет излучается организмом в результате химической реакции. Реакция включает в себя окисление субстрата (люциферина) ферментом (люциферазой), при этом кислород обычно является окислителем. Биолюминесцентные организмы встречаются в различных средах. Типичными примерами являются насекомые, рыбы, кальмары, креветки и медузы. Биолюминесцентные системы в этих организмах не все эволюционно консервативны, а гены, кодирующие белки участвующих в биолюминесценции, не гомологичны. Излучаемый свет обычно выполняет одну из трех функций: защиту, нападение и общение у живых организмов [2].
Люцифераза экворин окисляет люциферин коэлентеразин. При связывании трех ионов кальция экворин окисляет коэлентеразин кислородом, связанным с белком, в результате чего образуется комплекс Са3-апо-экворин-коэлентерамид, который in vitro испускает синий свет. Однако, сама медуза не излучает синий свет, вместо этого комплекс экворина подвергается безызлучательной передаче энергии GFP, который даёт зелёную флуоресценцию. Отсутствие связывания экворина и GFP наблюдается в растворе. Перенос энергии in vitro осуществляется путём совместной адсорбции экворина и GFP на ДЭАЭ целлюлозной мембране [3].
pBAD GFP - одна из модификаций GFP, которая обладает способностью регулировать арабинозный путь в E. coli. Рекомбинантный белок не склонен к растворению при экспрессии на высоких уровнях и имеет максимальный выход. Промотор araBAD инициирует экспрессию гена. Он как положительно, так и отрицательно регулируется продуктом гена AraC, транскрипционного регулятора, который образует комплекс с L-арабинозой [4].
sfGFP ( superfolder GFP ) - вид GFP обладающий способностью сворачиваться даже с белками и пептидами неспособными к правильному рефолдингу. Также он имеет большое количество аминокислотных замен, по сравнению с другими вариантами: Phe99Ser, Met153Thr, Val163Ala, Phe64Leu, Ser65Thr, Ser30Arg, Tyr39Asn, Asn105Thr, Tyr145Phe, Ile171Val, Ala206Val. Данный белок является димером и имеет молекулярную массу 26,8 кДа, а спектр поглощения 485-510 нм. sfGFP способен нормально флуоресцировать при значениях pH 4,5 - 9,4 [5].
E.coli являются аэробами или факультативными анаэробами, оптимальная температура роста 35-37°С, хорошо растут на простых питательных средах. В жидких средах E.coli при культивировании вызывают равномерное помутнение, иногда образуют незначительный осадок. Характерным признаком E. coli является ферментация лактозы.
Основная масса клеточной ДНК E. coli содержится в хромосоме до 4 млн пар нуклеотидов. Однако кроме хромосом бактерии могут содержать большое количество небольших кольцевых молекул ДНК - плазмид. Плазмиды способны к автономной репликации, в той или иной мере проходящей под контролем хромосомной ДНК. Размер природных плазмид может варьировать от тысяч до миллиона пар оснований. Плазмиды широко используются в молекулярной биологии в качестве векторов для переноса генетической информации и генетических манипуляций. Структура экспрессионной плазмиды, как правило, содержит сайт инициации репликации, селективный маркер, промотор (с регуляторным оператором), сайт связывания рибосом, последовательность терминации транскрипции [6].
pAL2-T вектор предназначен для быстрого клонирования продуктов ПЦР без предварительной обработки рестриктазами или экзонуклеазами. pAL2-T вектор представляет собой линеаризованную плазмиду с выступающими фосфорилированными 3'-концевыми тимидинами. Эффективное лигирование ПЦР-продукта в pAL2-T вектор основано на способности Таq-полимеразы и ее аналогов нематрично добавлять на 3'-конец синтезированной цепи ДНК дезоксиаденозин. Таким образом, продукт ПЦР и pAL2-T вектор несут выступающие комплементарные 3'- концевые нуклеотиды А:Т. Вектор pAL2-T несёт гены устойчивости к ампициллину. Клонирование ПЦР-продуктов в вектор не требует дополнительной ферментативной обработки, также pAL2-T вектор обеспечивает возможность бело-голубой селекции
клонов, при этом рекомендуемый размер вставки — до 1 500 п.о [7].
Цель получить переклонированные ПЦР ампликоны с геном зелёного флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria в штамм-продуцент E.coli TG1 при помощи pAL2^ вектора с внедрёнными вставками генов белков sfGFP и pBAD GFP с визуальной флуоресценцией белка без нарушения рамки считывания, а также изучение особенностей экспрессии и флуоресценции генов белков sfGFP и pBAD GFP.
Производилось клонирование двух вариантов GFP (sfGFP и pBAD GFP) в pAL2-T вектор. Для этого были выделены из штамма E.coli MC1061 плазмиды, содержащие гены белков sf GFP и pBAD GFP, которые затем были использованы для амплификации при помощи ПЦР с применением пар праймеров: sf.rev, unirev и revGFP, unirev, соответственно. Полученные ампликоны были вставлены в pAL2-T вектор, позволяющий проводить сине-белую селекцию, и при помощи кальциевой трансформации модифицированные pAL2-T вектора были введены в E. coli TG1. Полученные клоны были проверены по фенотипу с помощью флуоресценции и отобраны с помощью сине - белой селекции (рис.1).
Рис. 1. Вариант проведения сине-белой селекции штаммов E. coli TG1 при клонировании sfGFP и pBAD GFP в рЛЬ2-Т-векторе
Из полученных неокрашенных (белых) трансформантов E. coli TG1была выделена ДНК и проведена её обработка рестриктазами: SmaI, ApaI и BamHI. Полученные фрагменты были проанализированы на ориентацию вставки при помощи электрофореза в 1,5% ПААГ (рис.2).
Рис.2. Электрофорез обработанной рестриктазами плазмидной ДНК выделенной из неокрашенных трансформантов E. coli TG1 для определения
ориентации вставки
В таблице 1 показаны результаты анализа клонов на присутствие вставки генов sfgfp и pBAD gfp путём визуализации под ультрафиолетом полученных клонов E. coli TG1 и необходимой ориентации вставки при помощи электрофореза в 1,5% ПААГ.
В результате анализа было показано, что клоны №16 для sfGFP и №1 для pBAD GFP отвечали необходимым требованиям.
Таким образом, были получены штаммы Escherichia coli TG1 с внедрёнными вставками генов белков sfGFP и pBAD GFP в PAL2-T вектор без нарушения рамки считывания. При этом белки sfGFP и pBAD GFP под ультрафиолетом проявляли свойства люминесценции диапазон спектра поглощения, которого 485-510 нм, что позволило выявить различия между интенсивностью свечения штаммов Escherichia coli TG1 с экспрессируемыми белками sfGFP и pBAD GFP. Следует отметить, что помимо того, что ген белка sfGFP встраивается с меньшей вероятностью ошибки визуально отмечается, что интенсивность свечения белка sfGFP под действием ультрафиолета выше по сравнению с белком pBAD GFP.
анал 1 из клонов 2 на присут З ствие вста 4 зки (1 пар 5 й прайме б ров ) l s 9 10 11 12 1З 14 15 1б 1l
SF GFP + + + + +
PBAD GFP + + + + p p p + +
анализ клонов на ориентацию вставки(2 пара праймеров)
1 2 З 4 5 б l s 9 10 11 12 13 14 15 1б 1l
SF GFP PBAD GFP + + + + + + + + + + + + + +
Табл. 1. Анализ клонов на присутствие вставки гена белков sfGFP и pBAD GFP на присутствие вставки путём визуализации под ультрафиолетом полученных клонов E. coli TG1 и определение ориентации вставки
при помощи электрофореза в 1,5% ПААГ
Список литературы
1. Zimmer M. Green fluorescent protein (GFP): Applications, structure, and related photophysical behavior // Chemical Reviews. 2002. № 3 (102). C. 759781.
2. Haddock SH, Moline MA, Case JF. Bioluminescence in the sea. Ann Rev Mar Sci. 2010;2:443-93.
3. Alonso MT, Rodríguez-Prados M, Navas-Navarro P, Rojo-Ruiz J, García-Sancho J. Using aequorin probes to measure Ca2+ in intracellular organelles. Cell Calcium. 2017 Jun;64:3-11.
4. Invitrogen Bacterial Protein Expression The pBAD system offers : • Tightly regulated.
5. Наук Р. А. СТЕПАНЕНКО ОЛЕСЯ ВИКТОРОВНА Структурные свойства биомаркеров на основе СЕР- подобных флуоресцентных белков и бактериальных фитохромов , определяющие их оптические характеристики 2021. С. 1-282.
6. Литусов Н. В. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования " Уральский государственный медицинский университет " Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии , вирусологии и иммунологии Иллюстрированное учебное пособие. рЛЬ2-Т вектор 2019. С. 1-8.
