CC BY
27
МЕТОДЫ
УДК 57.087.3
ЭКСПРЕСС-МЕТОД СКРИНИНГА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПО ИНТЕНСИВНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ РЕПОРТЕРНОГО БЕЛКА GFP
Н.О. Юрьева1*, А.С. Воронков1,2, Д.В. Терешонок1, Е.С. Осипова1, Е.В. Платонова1, Д.В. Беляев1
Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН, Россия, 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 35;
2Государственный гуманитарно-технологический университет, Россия, 142611, г. Орехово-Зуево, ул. Зеленая, д. 22
*e-mail: yuorieva@mail.ru
Разработан экспресс-метод первичного анализа трансформированных растений по интенсивности флуоресценции зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP). По сравнению с распространенными методами скрининга трансгенных растений методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени или Нозерн-гибридизации, оценка по интенсивности флуоресценции GFP предлагаемым методом не требует дорогостоящих реактивов и занимает меньше времени. Такой подход может позволить вести скрининг первичных трансгенных регенерантов, сохраняя их для дальнейшей работы. Для доказательства корректности разработанного метода соотносили экспрессию модифицированного гена GFP (hGFP) в листьях трансформированных растений картофеля сорта "Скороплодный", определенную по накоплению мРНК, с интенсивностью флуоресценции белка GFP в микропрепаратах листьев. Высокая степень корреляции данных, полученных этими двумя методами, свидетельствует о наличии зависимости интенсивности флуоресценции от количества целевой мРНК.
Ключевые слова: GFP, генетическая инженерия, интенсивность флуоресценции, картофель, скрининг, первичные регенеранты
Зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP) из медузы Aequorea victoria широко используется в качестве репортера для изучения экспрессии генов и локализации целевых белков в клетках бактерий, человека и растений [1]. Ген GFP кодирует белок, который флуоресцирует зеленым светом с максимумом около 506 нм при возбуждении синим светом с длиной волны 488 нм [2].
Флуоресценция GFP не зависит от типа клеток и их локализации и устойчива к фотообесцвечиванию. Белок GFP стабилен в довольно разнообразных условиях [3] и может быть оптически детектирован и количественно определен в флуоресцирующих тканях живых растений без использования лизиса клеток или других биохимических предобработок. Этот белок делает возможным оптическое изучение клеточных структур и динамики молекул, а также мониторинг патогенов в растительных препаратах минимального размера [4]. Известно, что по мере увеличения уровня экспрессии гена GFP увеличивается интенсивность флуоресценции GFP как в интактных листьях, так и в экстрактах белков трансгенных растений [5].
Чаще всего факт встраивания гена GFP в геном определяют только по наличию свечения, тогда как для определенных целей важно получить количественную оценку экспрессии гена, для чего обычно используют методы Нозерн-гибридизации или поли-меразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени, которые тре-
буют дорогостоящих реактивов, оборудования и времени. Существующие в настоящее время методы измерения флуоресценции позволяют с высокой точностью определять накопление белка GFP в изолированных клетках, но они плохо применимы для сложных объектов, которыми являются неповрежденные ткани листьев растений.
Принимая во внимание большое количество информации об исследованиях тканей трансгенных растений с использованием гена GFP в качестве репортера, мы поставили цель создать экспресс-метод для первичного скрининга регенерантов и предварительной оценки уровня экспрессии гена GFP с использованием минимального количества оборудования и реактивов, а также в кратчайшие сроки.
Материалы и методы
1. Исходный материал
1.1. Генетическая конструкция. Для экспрессии репортерного гена GFP в клетках растений нами создана генетическая конструкция pBI-RbcS-GFP. Промотор rbcS (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase small subunit promoter) гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы был амплифицирован из геномной ДНК табака сорта "Самсун" с помощью праймеров RB-F-Hind (5'-GCGCAAGCTTGTGGGAACGAGATAAGGGC GAAGT-3') и Rb-R-Xba (5'-GCGTCTAGATGTTAA
TTACACTTAGACAGAA-3'), встроен в вектор pTZ57R/T (Fermentas, Литва) и секвенирован. Последовательность промотора полностью идентична опубликованной [6]. Затем промотор был встроен в вектор pBI121 (Clontech, США) по сайтам рестрикции HindIII и XbaI. Полученная конструкция названа pBI-RbGUS. Модифицированный ген hGFP был вырезан из pTR-UF2 [7] рестриктазой NotI и встроен в вектор pBluescriptII KS(+) (Stratagene, США) по сайту рестрикции NotI, чтобы воспользоваться сайтами XbaI и SacI, присутствующими как в pBluescriptII KS(+), так и в pBI121. Полученная плазмида была названа KS(+)-hGFP. Затем фрагмент ДНК, содержащий hGFP, был вырезан из KS(+)-hGFP и встроен в описанную выше конструкцию pBI-RbGUS, из которой с помощью XbaI и SacI был предварительно вырезан ген GUS, кодирующий глюкуронидазу. Полученная конструкция названа pBI-RbcS-GFP.
1.2. Растительный материал. С использованием модифицированного метода трансформации [8] были получены трансгенные растения с геном hGFP сорта картофеля "Скороплодный". Трансгенные растения с геном hGFP, нетрансформированные растения исходного сорта, а также NPHI-линии (линии с селективным геном, кодирующим неоми-цинфосфотрансферазу-II) выращивали в течение 3 недель в пробирках на среде с минеральными компонентами по Мурасиге и Скугу [9] с 2%-ной сахарозой и 7%-ным агаром, без гормонов и антибиотиков, при +22—24°C и освещенности 6000 люкс, 16-часовом фотопериоде и влажности воздуха 75%.
2. Генетический анализ
2.1. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Геномную ДНК растений картофеля выделяли методом с использованием цетилтриэтиламмония [10]. Для обнаружения гена hGFP использовали метод ПЦР со следующими праймерами: прямой — GFPhNdeI (5'-CCCCATATGAGCAAGGGCGAGG AA-3') и обратный - 3'myGFP (5'-CCGGTCACCA CCTAGGAGGGCCCTTGTACAGCTCGTCC AT-3'). Длина амплифицированного фрагмента составляла 742 п.н. Амплификацию проводили в объеме 25 мкл в программируемом термоциклере Терцик (ЗАО "ДНК-Технология", Россия) при следующих условиях: первичная денатурация 2 мин при 94°С; 5 циклов: денатурация 20 с при 94°С, отжиг 10 с при 60°С, элонгация 10 с при 72°С; 35 циклов: денатурация 5 с при 94°C, отжиг 5 с при 60°С, элонгация 5 с при 72°С; заключительная элонгация 2 мин при 72°С. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле с 0,01%-ным бромистым этидием в однократном Трис-боратном буфере. Для верификации длины фрагментов использовали маркер молекулярной массы M11 (ДНК маркер 1 Kb, "СибЭнзим", Россия).
2.2. Анализ экспрессии GFP с помощью Нозерн-гибридизации. Тотальную РНК выделяли по мето-
дике, любезно предоставленной Иль-Хо Кангом (Университет Флориды, США). Растительную ткань (0,2 г) измельчали с жидким азотом пестиком в ступке, затем заливали 400 мкл смеси (1:1) кислого фенола (Sigma, США) и буфера для экстракции РНК (0,1 М LiCl, 0,1 M Трис-HCl pH 7,5, 1% додецилсульфата натрия и 10 мМ динатриевой соли ЭДТА). После оттаивания содержимое ступки переносили в микроцентрифужные пробирки, встряхивали 5 мин, добавляли 200 мкл хлороформа, встряхивали 15-30 мин, центрифугировали при 20000 g 30 мин и переносили верхнюю фазу в новую пробирку. Затем экстракцию хлороформом повторяли. К водной фазе добавляли 1/3 объема 8 М LiCl и инкубировали 16 ч при 4°C, затем РНК осаждали 30 мин в центрифуге при 12000 g, осадок промывали 96%-ным этанолом и растворяли в 1530 мкл воды. Концентрацию РНК определяли измерением оптической плотности её раствора на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Электрофорез 30 мкг РНК в 2%-ной агарозе с формальдегидом, а также перенос РНК на мембрану Hybond-N+ (GE Healthcare, США) проводили, как описано в сборнике "Методы генетической инженерии" [11]. Фрагмент hGFP вырезали из pTR-UF2 рестриктазой NotI, выделяли из агароз-ного геля с помощью Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва) и затем из него готовили меченный 32P ДНК-зонд с использованием NEBlot Kit (New England Biolabs, США). Предгибридиза-цию и гибридизацию проводили в буфере, содержащем 7% SDS, 0,25 М фосфат натрия, 1 мМ эДтА, 10 г/л бычьего сывороточного альбумина и 50 мг/л низкомолекулярной ДНК спермы сельди в гибри-дизационном инкубаторе Robbins (США) при 65°С. В гибридизационный буфер добавляли ранее приготовленный ДНК-зонд. После отмывок в последовательно x1, x0,1 и x0,1 цитратном буфере c добавлением 0,1% додецилсульфата натрия при 65°С мембрана была экспонирована в течение 20 сут в кассете PhosphoImager (GE Healthcare, США), и интенсивности сигналов были измерены с помощью программного обеспечения ImageQuant ^версии 7.0 (GE Healthcare, США).
3. Измерение флуоресценции
3.1. Приготовление микропрепаратов. От растения первичного регенеранта, выращенного в пробирке, в стерильных условиях ламинар-бокса пинцетом отделяли второй полностью развернувшийся верхний лист длиной 4-6 мм. Скальпелем удаляли черешок и 1 мм основания листа. Подготовленный эксплантат помещали в каплю дистиллированной воды на предметном стекле и накрывали покровным стеклом, немного надавливая на него, чтобы удалить пузырьки воздуха. Подготавливали по 3 препарата на 1 генотип.
3.2. Микроскопирование. Исследовали под микроскопом и фотографировали по 5 полей зрения
на препарат. Анализировали участки листа: между жилками, жилки и в некоторых случаях трихомы. Для анализа флуоресценции использовали флуоресцентный микроскоп AxioImager Z2 (Carl Zeiss, Германия). Зеленый флуоресцентный белок исследовали в свете ртутной лампы HBO 100 с набором фильтров №38 (Кат № 000000-1031-346; Carl Zeiss, Германия) возбуждение 440—470 нм, эмиссия 525— 550 нм. Все изучаемые линии растений были исследованы при одинаковой экспозиции и одинаковом значении пропускающей диафрагмы ртутной лампы. Фотографии получали с помощью высокочувствительной монохромной камеры AxioCam MRm (Carl Zeiss, Германия).
3.3. Анализ изображений. Полученные снимки обрабатывали с помощью программ AxioVision или ZEN Blue (Carl Zeiss, Германия).
Стандартное отклонение в опытах и коэффициент корреляции (r) для массивов данных вычисляли с помощью программы Microsoft Excel.
Результаты
Исходный материал для разработки метода был получен посредством агробактериальной трансформации с использованием созданной нами конструкции и модифицированной методики [8]. Получено 15 первичных регенерантов картофеля сорта "Скороплодный". В 9 линиях с помощью ПЦР было подтверждено наличие целевого гена и определен уровень накопления мРНК методом Нозерн-гибри-дизации (рис. 1А).
Интенсивность флуоресценции GFP оценивали по ее среднему значению для:
Рис. 1. Нозерн-гибридизация мРНК с GFP-зондом (А), а также взаимосвязь между накоплением мРНК hGFP и его относительной флуоресценцией в тканях листьев, вычисленной с помощью инструментов "профиль" (Б) и "прямоугольник" (В). 29 — исходный сорт "Скороплодный"; М — маркер (High Range RNA Ladder, Fermentas, Литва) молекулярной массы РНК (на рисунке виден фрагмент длиной 1000 н.); NPT — трансгенная линия с NPTII; 400—408 — трансгенные линии с hGFP
Рис. 2. Микрофотографии участка листа трансгенного картофеля: А — "профиль" флуоресценции; Б — "прямоугольник". В — микрофотографии с различной экспозицией съемки. Масштабная линейка — 100 мкм. Г — зависимость интенсивности флуоресценции ОРР от экспозиции
1) профиля, проведенного в программе Axio-Vision 4.8 (Carl Zeiss, Германия) по диагонали фотографии (инструмент "Profile") (рис. 2А);
2) всего поля зрения в программе ZEN Blue с использованием инструмента "Rectangle (aligned)" (прямоугольник) (рис. 2Б).
Для подбора условий получения репрезентативных снимков исследуемых препаратов, когда величина интенсивности флуоресценции укладывалась в границы значений чувствительности камеры от 0 (черный цвет) до 4095 (белый цвет), был использован косвенный подход. Мы оценили зависимость интенсивности флуоресценции GFP от изменения времени экспозиции съемки камерой AxioCam MRm в границах от 1 до 10000 мс. Для этого была сделана серия снимков одного и того же образца с разным временем экспозиции без изменения расстояния до объекта (рис. 2В). Из этой серии снимков видно, что как при малых (от 1 до 100 мс), так и при больших (от 3000 до 10 000 мс) экспозициях нет заметных "на глаз" изменений интенсивности флуоресценции образца.
В программе ZEN с помощью инструмента "прямоугольник" мы оценили интенсивность флуоресценции не менее десяти снимков для каждой из выбранных экспозиций и представили средние значения измерений, а также их стандартное отклонение в виде графика (рис. 2Г).
Из графика (рис. 2Г) следует, что в границах экспозиций от 10 мс до 1500 мс зависимость носит линейный характер, поэтому используемый нами
подход можно считать вполне обоснованным. При более высоких значениях появляются "пересве-ченные" пиксели, их интенсивность >4095 отн. ед., что выходит за границы чувствительности камеры, и в них невозможно оценить интенсивность флуоресценции, а начиная с 3000—4000 мс, уже весь образец получается "пересвеченным", и график выходит на плато.
Перед съемкой всех исследуемых линий было подобрано такое время экспозиции, которое обеспечивало получение "непересвеченных" фотографий образцов. Первые пробные фотографии были сделаны с экспозицией в границах линейной зависимости чувствительности камеры. С помощью функции OverExposition программы Ахю^юп 4.8 была выбрана оптимальная экспозиция (500 мс), которая позволила получить репрезентативные снимки, с видимыми клетками. Все фотографии исследуемых образцов были сделаны с одинаковым временем экспозиции. На фотографиях тканей листьев растений исходного сорта (29), ИРТИ и ОРР-трансгенов 400—408 (рис. 3) отчетливо видны различия по интенсивности флуоресценции между образцами с геном ОРР и без него.
: -> ® у . г. -» -vt V "у Ч. . .. '' ' ¡»J&a v "■ • V , v' *. - - N^ * > . • . v :
® • S> •■ '•-' ■■ <1 ■ i. ; t ■ ' ' _/ ® • —"V V ■ & '• ' , * ■ v - у* i , /v:' ШШШ Шт тш . :,
% Ш .• i- - , ч ; -r ■ ■■ . ' . Ш ■ : * r 1 - • \ . I V - , J Is ''vV. . : "rA* . — I
Щ
Рис. 3. Фотографии тканей участков листьев растений картофеля с различной интенсивностью флуоресценции ОРР. 29 — исходный сорт "Скороплодный", КРТП — трансгенная линия с ИРТ11, 400—408 — трансгенные линии с ИОРР. Масштабная линейка — 100 мкм
Анализ относительной интенсивности флуоресценции в листьях асептических растений исходного сорта "Скороплодный" и его трансгенных линий с подтвержденной вставкой GFP, а также с вставкой NPTII по отношению к максимальному уровню флуоресценции выявил достоверные различия (p<0,05) между относительными интенсив-ностями флуоресценции GFP-трансгенов и растений, не несущих ген hGFP (исходного сорта и NPTII), измеренными как методом "профиль" с помощью компьютерной программы AxioVision 4.8 (рис. 1Б), так и методом "прямоугольник" с помощью программы ZEN Blue (рис. 1В).
На рис. 1 видны корреляции уровня накопления мРНК со значениями относительной флуоресценции, определенными методами "профиль" (рис. 1Б) и "прямоугольник" (рис. 1В). Коэффициенты корреляции между значениями относительной флуоресценции и накоплением мРНК в популяции GFP-трансгенов при использовании методов измерения интенсивности флуоресценции "профиль" и "прямоугольник" составили +0,832 и +0,852, соответственно.
Кроме того, из рис. 1 видно, что значения относительной флуоресценции каждой из исследуемых линий GFP-трансгенов картофеля, измеренные методом "профиль", достоверно не отличаются от значений относительной флуоресценции, измеренной методом "прямоугольник" (p<0,05). Статистический анализ выявил высокий уровень корреляции значений относительной флуоресценции, полученных методами анализа "профиль" и "прямоугольник" (г = +0,962).
Обсуждение результатов
Экспресс-метод был разработан с использованием трансгенных растений картофеля, экспрессирующих модифицированный ген hGFP, оптимизированный для экспрессии в клетках млекопитающих [7]. Однако анализ частоты использования кодонов в этом гене близким к картофелю видом Nicotiana tabacum не выявил редко используемых этим растением кодонов (http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html), поэтому кодоновый состав этого гена не должен представлять проблемы для его экспрессии в картофеле. Ген находится под контролем сильного и специфичного для зеленых частей растения промотора малой субъединицы рибулозобисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы табака, использованного ранее для экспрессии репортерных генов в растениях [12].
На рис. 3 приведены микрофотографии флуоресценции GFP в трансгенных растениях. Видны клеточные ядра, в которых GFP локализуется чаще, чем в цитоплазме, что было также замечено другими
исследователями [13]. Несмотря на схожесть результатов измерений флуоресценции методами "профиль" и "прямоугольник", последний дает более точные значения сигнала флуоресценции, так как сигнал "профиль" зависит от того, как проводится линия профиля. На рис. 2Г показано, что данные измерения интенсивности флуоресценции линейны в широком (по крайней мере, 10-кратном) диапазоне. Это позволяет изучать регулируемую экспрессию GFP и детектировать наличие ОБР в растениях, в которых по каким-то причинам экспрессия GFP понижена (например, из-за неоптимального места встройки переносимого фрагмента ДНК агро-бактерии).
В последние годы все чаще используется автоматизированный анализ тканей трансгенных растений, в которых используется ген GFP в качестве репортера. Для того чтобы избежать субъективного влияния оператора на результаты, получение и сбор изображений исследуемых тканей и клеточных структур, а также количественный анализ флуоресценции ОБР производятся с помощью автоматизированных систем, включающих в себя флуоресцентный микроскоп, "роботизированную платформу" и специализированную компьютерную программу [14]. Несомненно, такой подход может обеспечивать высокую точность данных из-за большего количества автоматизированно исследуемых образцов, однако эти методы являются узкоспециализированными, поэтому использование их для широкого спектра объектов ограничено. Кроме того, эти методы не применимы для анализов сложнооргани-зованных эксплантатов и целых органов растений.
Предлагаемый нами экспресс-метод анализа флуоресценции листьев не требует каких-либо специализированных систем и дорогостоящего программного обеспечения. Он может быть применим для широкого спектра растительных объектов, его использование возможно практически в любой лаборатории и ограничено лишь наличием флуоресцентного микроскопа хотя бы начального уровня. Кроме того, предлагаемый нами метод может получить применение для использования флуоресцирующего белка в качестве количественного репортера, что особенно актуально при использовании генетических конструкций, в которых целевой ген слит с репортерным геном GFP. Так, использование ОБР позволяет дать оценку новых векторов, предназначенных для гетерологичной экспрессии других белков или для изучения активности промоторов [15, 16].
В практике экспресс-методов наиболее ценным является быстрое получение искомых данных. Предлагаемый нами подход не требует последующей
обработки и графического редактирования микрофотографий, но при этом позволяет с высокой степенью достоверности получить информацию об экспрессии репортерного гена.
Для первичного скрининга растений-регене-рантов картофеля после трансформации с использованием маркерных генов — например, NPTII -традиционно используется отбор форм, укоренившихся на селективных средах, с последующим применением ПЦР-анализа, Нозерн-гибридизации или ОТ-ПЦР. Процесс размножения и подращивания регенерантов с целью получить вегетативную массу, достаточную для проведения биохимического анализа, занимает 2—3 месяца, трудоемок и требует материальных затрат на реактивы и обеспечение условий культивирования. Кроме того, после двухмесячного доращивания регенерантов для получения необходимой биомассы последую-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sheen J., Hwang S., Niwa Y., Kobayashi H., Galbraith D.W. Green-fluorescent protein as a new vital marker in plant cells // Plant J. 1995. Vol. 8. N 5. P. 777-784.
2. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20. N 11. P. 448-455.
3. Patterson G.H., Knobel S.M., Sharif W.D., Kain S.R., Piston D.W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescent microscopy // Biophys. J. 1997. Vol. 73. N 5. P. 2782-2790.
4. Shaw S.L., Ehrhardt D.W. Smaller, faster, brighter: advances in optical imaging of living plant cells // Annu. Rev. Plant Biol. 2013. Vol. 64. P. 351-375.
5. Richards HA, Halfhill M.D., Millwood R.J., Stewart Jr C.N. Quantitative GFP fluorescence as an indicator of recombinant protein synthesis in transgenic plants // Plant Cell Rep. 2003. Vol. 22. P. 117-121.
6. Mazur B.J., Chui C.F. Sequence of a genomic DNA clone for the small subunit of ribulose bis-phosphate carbox-ylase-oxygenase from tobacco // Nucleic Acids Res. 1985. Vol. 13. N 7. P. 2373-2386.
7. Zolotukhin S., Potter M., Hauswirth W.W., Guy J., Muzyczka N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells // J. Virol. 1996. Vol. 70. N 7. P. 4646-4654.
8. Юрьева Н.О., Егоров Ц.А., Беляев Д.В., Соболькова Г.И., Деревягина М.К., Рогожин ЕА., Терешонок Д.В., Мелешин АА., Шелухин П.Г. Способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза. Патент РФ № 2524424 от 14.06.2014. Опубликовано: 27.07.2014. Бюл. № 21.
9. Murasige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. N 3. P. 473-497.
щая процедура выделения и анализа целевой ДНК и РНК также требует больших затрат труда, времени и реактивов. Таким образом, время, затрачиваемое на скрининг растений-трансформантов, при традиционном методическом подходе может составлять до полугода. Использование предложенного нами экспресс-метода позволяет проводить скрининг линий по флуоресценции белка на стадии первичного регенеранта в пробирочной культуре, не прибегая к сложным молекулярно-биоло-гическим методам, тем самым ускоряя и облегчая создание новых форм (хозяйственно-ценных растений) картофеля с заданными полезными признаками.
Авторы благодарят проф. В.В. Хаусвирта из Университета Флориды за плазмиду рТ^-иБ2 и канд. биол. наук Г.Н. Ралдугину за предоставление растений табака.
10. Moller E.M., Bahnweg G., Sandermann H., Geiger H.H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant tissues // Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. N 22. P. 6115-6116.
11. Maniatis T, Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. 545 pp.
12. Herrera-Estrella L., Van den Broeck G, Maenhaut R., Van Montagu M., Schell J., Timko M., Cashmore A. Light-in-ducible and chloroplast-associated expression of a chimaeric gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vector // Nature. 1984. Vol. 310. N 5973. P. 115-120.
13. Chiu W, Niwa Y, Zeng W, Hirano T, Kobayashi H, Sheen J. Engineered GFP as a vital reporter in plants // J. Curr Biol. 1996. Vol. 6. N 3. P. 325-330.
14. Finer J.J., Beck S.L., Buenrostro-Nava M.T., Chi Y., Ling P.P. Monitoring gene expression in plant tissues. Using green fluorescent protein with automated image collection and analysis // Plan tissue culture engineering. Focus on biotechnology, vol 6 / Eds. S.D. Gupta and Y Ibaraki. Dordrecht: Springer, 2006. P. 31-46.
15. Haikonen T, Rajamaki M.L., Valkonen J.P. Improved silencing suppression and enhanced heterologous protein expression are achieved using an engineered viral helper component proteinase // J. Virol. Methods. 2013. Vol. 193. N 2. P. 687-692.
16. Naylor L.H. Reporter gene technology: the future looks bright // Biochem. Pharmocol. 1999. Vol. 58. N. 5. P. 749-757.
Поступила в редакцию 22.12.2018 Принята к печати 21.03.2018
METHODS
AN ASSAY FOR EXPRESS SCREENING OF POTATO TRANSFORMANTS BY GFP FLUORESCENCE
N.O. Ymrieva1*, A.S. Voronkov12, D.V. Tereshonok1, E.S. Osipova1, E.V. Platonova1, D.V. Belyaev1
1K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, Botanicheskaya ul. 35, Moscow, 127276, Russia; 2State Humanitarian-Technological University, Zelenaya ul. 22, Orekhovo-Zuyevo, 142611, Russia
*e-mail: yuorieva@mail.ru
An express assay for primary screening of potato transformants by their GFP fluorescence intensities is developed. In comparison to the widely used methods of transgenic plant screening by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Real-Time RT-PCR) or Northern-blotting, the GFP fluorescence assay needs no expensive reagents and takes less time. This approach may allow to carry out nondestructive screening of the primary transgenic regenerants which can be further grown and used. To prove this assay reliability, the expression of the modified GFP (hGFP) gene in the leaves of transgenic potato (cv. "Skoroplodny") plants, determined by its mRNA accumulation, was compared to GFP fluorescence intensity in the micro-samples of aseptic plant leaves. The strong correlation between the results of these two methods is the evidence of positive dependence of GFP fluorescence intensity on the target mRNA content.
Keywords: GFP, genetic engineering, fluorescence intensity, potato, screening, primary regenerants
Сведения об авторах
Юрьева Наталия Олеговна — канд. c-х. наук, ст. науч. сотр. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН. Тел.: 8-499-678-54-00; e-mail: yuorieva@mail.ru
Воронков Александр Сергеевич — канд. биол. наук, науч. тетр. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН; доц. Государственного гуманитарно-технологического университета. Тел.: 8-499-678-53-18; e-mail: voronkov_as@mail.ru
Терешонок Дмитрий Викторович — канд. биол. наук, науч. сотр. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН. Тел.: 8-499-678-53-34; e-mail: diman_ter_vi@mail.ru
Осипова Екатерина Сергеевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН. Тел.: 8-499-678-54-00; e-mail: gsc@ippras.ru
Платонова Екатерина Владимировна — мл. науч. сотр. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН. Тел.: 8-499-678-53-02.
Беляев Денис Вадимович — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН. Тел.: 8-499-678-53-02; e-mail: bdv@ippras.ru
