CC BY
32
УДК 602.6:633.853.494
ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВЫХ СТАДИЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОБЕГОВ НА СЕМЯДОЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТАХ РАПСА (BRASSICA NAPUS L.) ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ГЕН GUS С ИНТРОНОМ ИЛИ ГЕН GFP
ХОАНГ ТХИ ЖАНГ1, Г.Н. РАЛДУГИНА2, Е.А. КАЛАШНИКОВА1
(х Кафедра генетики и биотехнологии РГАУ — МСХА имени К.А. Тимиря зева,
2 Институт физиологии растений имени К.А. Тимиря зева РАН)
С целью изучения первых стадий регенерации побегов проводили генетическую трансформацию семядольных эксплантов проростков рапса с помощью Agrobacterium tumefaciens, содержащих генетические конструкции с маркерными генами gus или gfp. При использовании конструкции с геном gus не наблюдали разницы в интенсивности окраски между различными клетками в образующихся меристемах, тогда как свечение гена gfp в тканях формирующихся трансформированных побегов было различно. Таким образом, было показано, что дл изучени первых стадий регенерации побегов на эксплантах растений рапса лучше использовать конструкцию, содержащую ген gfp.
Ключевые слова: Brassica napus, рапс, регенерация, трансформация, gfp, gus.
Известно, что при морфогенезе, происходя щем на различных растительных эксплантах в культуре in vitro, в некоторых случая х образуются химеры, сформированные из более чем одной близлежащих дедифферен-цированных клеток [6, 10, 14]. В свя -зи с тем, что образование растений-регенерантов после агробактериаль-ной трансформации может происходить через первичный каллус, такие трансформанты могут быть химерными, т.е. их ткани будут состоять как из трансформированных, так и из не-трансформированных клеток [5, 12]. В свя зи с тем, что образование х имер при морфогенезе достаточно велико, то при трансформации и последующей регенерации трансгенных растений шанс получить химерные побеги
также достаточно велик. При использовании для трансформации маркерных генов, дающих хорошо видимую окраску трансгенных клеток, таких как ген gus (Р-глюкуронидазы) [8] или gfp-ген зеленого флуоресцентного белка, впервые выделенного в 1979 г. Shimomura 0. из медузы Aequorea victoria [13], можно было бы увидеть, какого типа ткани образуютс при регенерации.
Целью нашей работы являлось изучение процессов регенерации побегов после трансформации генетическими конструкция ми, содержащими маркерные гены gus или gfp, с целью выяснить, как происходит образование химерных побегов и какие гены лучше всего использовать дл такого исследовани .
Материалы и методы
Для исследования использовали семядоли рапса (Brassica napus L.) сорта Вестар, которые получали путем проращивания стерильных семя н на среде MS [11] без добавления растительных гормонов и витаминов. Все семена стерилизовали 70%-м спиртом и 20%-м раствором гипохлорита натрия , после чего промывали стерильной дистиллированной водой, а затем высаживали на агаризованную среду и помещали на сутки в темноту, после чего переносили в световую камеру. Через 5 сут. проростки использовали для получения эксплантов, срезая с них сем дольные листь .
Для трансформации использовали генетические конструкции, содержащие ген gus с интроном или ген gfp (рис.1), содержащиеся в плазмиде pBin19, встроенной в агробактерию штамма AGL0.
а
Трансформацию проводили методом совместного культивирования
эксплантов с агробактерией, находя-щейся на поверхности агаризованной среды по ранее разработанному методу [3]. Суспензию «ночной» культуры A. tumefaciens наносили на среду для каллусогенеза (среда МС, 3% сахароза, 0,1 мг/л 2,4-Д, 4 мг/л кине-тин, 2 мг/л НУК), помещали на нее 5-дневные семя дольные экспланты проростков и инкубировали в течение двух суток в темноте при температуре 25°С. Затем экспланты переносили на среду дл морфогенеза (среда МС, 1% сахароза, 4 или 8 мг/л БАП, 0,5 или 1 мг/л НУК), дополненную антибиотиком клафораном (800 мг/л) и АБК (3 мг/л) и помещали в световую камеру. Через 3-4 нед. экспланты переносили на питательную среду для роста побегов (среда МС, 1% сахароза), дополненную клафораном (500 мг/л). Сформированные побеги
pA3011
pBIN-GFP
(•у __ — -I—
oocgE шс/)^сосп
оос о
35S
GFPs
и
3'NTR
о _а z х
Nos
pBIN19-35S-GFPs
from4351
Nos terminator ~250bp
i^0-[ 3SS-pro
ев .Г
штгоц
HOSter NOSpro
і-------1------ґ
1-І 1-І H
О ■—I M ¿dH X ЇЛ 73
NP TU
б
Рис. 1. Схемы генетических конструкций, использованных для трансформации семядольных эксплантов рапса: а — схема генетической конструкции, содержащей ген gfp; б — схема генетической конструкции, содержащей ген gus
отделяли от каллуса и пересаживали на среду дл укоренени .
Определение экспрессии гена gus проводили по гистохимическому методу Jefferson [7], используя в качестве субстрата X-gluc. Продукт имел синий цвет и выпадал в осадок внутри клеток. Флуоресценцию GFP наблюдали в флюресцентном микроскопе при освещении его ультрафиолетовым светом (440-480 nm).
Частоту регенерации рассчитывали как отношение числа каллусов, образовавших побеги, к общему числу эксплантов, помещенных на среду для каллусогенеза [4]. Результаты экспериментов статистически обрабатывали с использованием программы Excel.
Результаты и их обсуждение
При изучении способности сем -дольных эксплантов рапса сорта Ве-стар к регенерации побегов с использованием агробактерий, содержащих различные генетические конструкции, была изучена зависимость частоты регенерации от используемой конструкции при различном соотношении регул торов роста в питательной среде. Из данных, представленных в таблице 1, видно, что регенерация при трансформации конструкцией с геном gus происходит при всех используемых соотношени х гормонов, тогда как применение конструкции с геном gfp регенерацию ингибирует.
В дальнейшей работе нами для трансформации была использована среда, содержащая 4 мг/л БАП,
0,5 мг/л НУК и 3 мг/л АБК.
При трансформации растений
конструкцией, содержащей ген gus, через 2-3 нед. культивирования экс-плантов на среде дл морфогенеза на срезах черешков были видны образующиеся регенеранты. Они были отделены от экспланта и окрашены Х^1ис. Макроскопическая оценка подтверждала экспрессию gus-генов, визуализируемую gus-окрашиванием в ткан х побегов предполагаемых трансформантов. При этом наблюдали и синие и белые побеги. В ткан х отрицательного контрол (нетрансген-ных побегов) никакой gus-активности не наблюдали (рис. 2 А, Г). В проанализированных срезах gus-активность визуализировалась как синие осадки в клетках побегов (рис. 2 Б, В).
Из рисунка 2 можно видеть, что экспрессия gus в тканях исследованных побегов варьировала по локализации и интенсивности, окрашивание происходило по част м побегов и по жилкам, при этом там, где, по-видимому, активность gus была больше, там цвет был более интенсивным (рис. 2 Д, Е).
После проведени трансформации 50 адвентивных почек, изолированных из дедифференцированных тканей, были обработаны Х^Шс. Из них 42 шт. были полностью или частично
Т а б л и ц а 1
Зависимость регенерации побегов от содержания БАП и НУК (мг/л) в среде культивирования при трансформации различными генетическими конструкциями
Содержание БАП:НУК Частота регенерации
gus gfp
4:0,5 74,25* (69,96-78,54) ** 54,96 (50,43-59,49)
4:1 27,50 (21,85-33,15) —
8:1 30,73 (24,2-37,26)
П р и м е ч а н и е. * Частота регенерации рассчитана по формуле: р=(п1/п2).100%, где п1 — число эксплантов с регенерацией, п2—общее число эксплантов; ** Доверительный интервал.
Рис. 2. Регенеранты и срезы, окрашенные Х-д1ис: А — нетрансформированный регенерант; Г — продольный срез нетрансформированной ткани; Б, В — трансформированный регенерант; Д — поперечный срез трансформированной почки; Е — продольный срез трансформированного регенеранта. 1, 3 — неокрашенные части; 2 — окрашенные части
окрашены, т.е. 84% регенерантов содержали экспрессирующийся ген gus. От остальных морфогенных каллусов через 6$7 нед. были отделены сформировавшиеся побеги и высажены на среду дл укоренени . На срезанных с этих побегов листь х после обработки Х^Ыс не наблюдали никакого окрашивания, т.е. встроенный gus-ген не экспрессировалс .
При трансформации растений конструкцией, содержащей ген gfp , исследования показали, что свечение белка gfp наблюдалось на всех ста-ди х развити трансформированных растений — как на стадии первичного морфогенеза, на каллусах с формирующимися почками, так и при образовании оформленных побегов. Было показано, что у более чем 90% всех образовавшихс каллусов про-я влялась я ркая флюоресценция gfp, котора сохран лась и на стадии по-
бегообразовани (рис. 3). У сформировавшихся побегов свечение gfp наблюдали на листьях верхнего и нижнего русов. При этом свечение было значительно рче на старых листь х, чем на молодых (рис. 4).
На листь х растений-регенерантов свечение gfp лучше проявлялось на сосудистых ткан х, трихомах и устьицах (рис. 5).
Таким образом, можно отметить, что из двух использованных дл трансформации конструкций лучшие результаты были получены с геном gfp, хотя частота регенерации после трансформации была выше дл конструкции с геном gus, однако экс-пресси в сформировавшихс побегах в этих случа х отсутствовала. Вполне вероятно, что ген gus в нашем случае экспрессировалс только краткое врем после трансформации. Достаточно известным фактом вл етс
А
■ЪХ-Щк А
. 1
Рис. 3. Экспрессия гена gfp в клетках меристематических образований на первичном каллусе, образовавшемся на срезах черешков семядольных эксплантов проростков рапса (ув. х500): А — нетрансформированное растение; Б — срез меристемы: 1) примордии,
2) меристема, 3) каллусные клетки; В — срез ризоидного образования: 1) срез черешка, 2) клетки апикальной меристемы корня, 3) клетки эндодермы, 4) прокамбий
* V
Б
Рис. 5. Экспрессия гена gfp в трихомах на листьях сформировавшихся побегов
Рис. 4. Экспрессия гена gfp в листьях сформировавшихся трансформированных растений: А — старый лист, Б — молодой лист (ув. х10)
использование этого гена в основном для транзиентной экспрессии, чтобы показать работу, например, каких-нибудь промоторов. Ген gfp экспрес-
сировалс на всех стади х развити побега, что позволяло наблюдать за развитием растительных тканей. Очень интересно, что свечение белка gfp в некоторых листьях наблюдали только в группах клеток, тогда как основная ткань листа не флуоресцировала. Это может свидетельствовать о генотипической химерности образу-ющихс при регенерации растений, состо щих из трансформированных и нетрансформированных клеток [12], так как меристематическа ткань может происходить как из одной клетки, так и из нескольких клеток, образуя или мериклинальные, или пе-риклинальные химеры, т.е. трансформированные клетки могут находитьс
в любом из слоев образующейся меристемы, туника которой состоит, как правило, из нескольких слоев, обозначаемых Ь1, Ь2, Ь3 и т.д. Как правило, химерность обычно выяс-н етс только на стадии образовани семян, когда обнаруживается, что не соблюдаютс менделевские правила наследовани одного признака дл самоопыленных растений. В некоторых случа х наследование встроенного гена наблюдали только в 2-3 растениях из 100 проверенных семян [9]. Этот феномен элиминации чужеродного гена объя сня ли различными способами: либо как результат мутации,
либо потерей гена вследствие рекомбинации [1, 2]. Вполне вероя тно, что он может объя сняться и химерностью полученных растений, так как известно, что гаметы, как правило, образуются из Ь2-слоя, который может состоять как из тех, так и из других клеток. Однако есть надежда, что включение в генетическую конструкцию гена зеленого флуоресцирующего белка позволит отбирать химерные растения уже на достаточно ранних стадиях развития, исключая трудоемкую работу по получению семенного потомства.
Библиографический список
1. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Пухначева Н.В., Шумный В.Л. Инактивирование чужеродных генов у трансгенных растений табака (обзор) // Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001. С. 132-142.
2. Дейнеко Е.В. Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений (На примере Nicotiana tabacum L.): Дис. доп биол. наук: 03.00.15: Новосибирск, 2004. C. 198 РГБ ОД, 71:05-3/80.
3. Малышенко С.И., Тюлькина Л.Г., Зверева С.Д., Ралдугина Г.Н. Получение трансгенных растений Brassica campestris, экспрессирующих ген gfp // Физиология растений, 2003. 50. С. 309-315.
4. Смиряев А.В., Кильчевский А.В. Генетика популяций и количественных признаков. М.: КолосС, 2007. С. 215-218.
5. Соболева А.Г., Соболев В.В., Казаков И.В. Разработка метода агробакте-риальной трансформации ремонтантной малины на основе термостабильности лихеназы // Известия ТСХА, 2008. Вып. 3 . С. 81-88.
6. Christou P. Morphological description of transgenic soybean chimeras created by the delivery, integration and expression of foreign DNA using electric discharge particle acceleration // Ann. Bot., 1990. 66. P. 379-86, 104.
7. Jefferson R.A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system // Plant Mol Biol Rep., 1987. 5. P. 387-405.
8. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusions: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // The EMBO Journal, 1987. 6. P. 3901-3907.
9. Kirk J.T.O., Tilney-Bassett R.A.E. Chimeras. In The Plastids: Their Chemsitry, Structure, Growth and Inheritance, 1987. 49. P. 329. New York: Elsevier.
10. Marcotrigiano M., Gouin F.R. Experimentally synthesized plant chimeras 1. In vitro recovery of Nicotiana tabacum L. chimeras from mixed callus cultures // Ann. Bot., 1984. 54. P. 503-511.
11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant, 1962. 15. P. 472-493.
12. Schmulling T., Schell J. Transgenic tobacco plants regenerated from leaf disks can be periclinal chimeras // Plant Mol. Biol., 1993. 21. P. 705-708.
13. Shimomura O. Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein // FEBS Letters., 1979. 15. P. 220-222.
14. Williams E.G. and Maheswaran G. // Annals of Botany, 1986. 57. P. 443-462.
SUMMARY
Genetic transformation of rape seedlings cotyledonary explants using Agrobacterium tumefaciens, containing genetic constructions with marker genes GUS or GFP, has been done in order to investigate the first stages of twigs regeneration. Using gene GUS construction there exists no difference in colouring power between various cells in forming meristems, whereas gene GFP glow in tissues of forming transformed twigs is different. Thus, GFP gene construction is recommended in order to research the first regeneration stages in rape explants.
Key words: Brassica napus, rape, regeneration, transformation, GFP, GUS.
Хоанг Тхи Жанг — асп. кафедры генетики и биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 976-40-72.
Калашникова Елена Анатольевна — д. б. н. Эл. почта: [email protected]. Ралдугина Галина Николаевна — к. б. н. Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН. Тел. 977-80-22. Эл. почта: [email protected].
