CC BY
34
УДК 632.35:579.841.12:577.21
ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЦИДОВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО ШТАММА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧЕРНОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЯТНИСТОСТИ ТОМАТА
А. МОТАМЕДИ ТТТАЛАМ.ЗАРИ, Ф.С. ДЖАЛИЛОВ, Г.И. КАРЛОВ
(Кафедра фитопатологии, лаборатория защиты растений, центр молекуля рной биотехнологии)
Методом электропорации с использованием плазмиды рНС60, содержащей ген ОЕР, была проведена трансформация возбудителя черной бактериальной пя тнистости томата. Генетически трансформированный штамм X. “оезкаЬотш не отличался от исходного по скорости роста на искусственной питательной среде и патогенным свойствам. Показана принципиальная возможность экспресс -оценки активности бактерицидов путем измерени интенсивности флуоресценции зеленого флуоресцентного белка у трансформированного штамма фитопатогена.
Ключевые слова: зеленый флуоресцентный белок, GFP, черная бактериальная пя тнистость томата.
Черна бактериальна п тнистость томата относитс к числу наиболее вредоносных бактериальных болезней томата. В России и странах СНГ это заболевание широко встречается на томате и перце. В эпифитотийные годы распространенность болезни со-ставля ет от 40 до 70%. В России заболевание зарегистрировано на Северном Кавказе, Краснодарском и Алтайском края х, Воронежской, Читинской, Волгоградской и других об-ластя х [1]. В странах ЕС патоген явля -ется карантинным объектом (ЕРРО, список А2). Возбудителя заболевания длительное время относили к Xan-thomonas campestris pv. vesicatoria [6]. В насто щее врем вместо этого патовара предложены 4 вида: X. euve-
sicatoria, X. vesicatoria, X. perforans, X. gardneri [6].
К основным источникам инфекции относя т семена и растительные остатки. Многие элементы биологии возбудителя и патогенеза, такие как способность к выживанию в эпифитном состоянии на поверхности растений, не являющихся хозяевами патогена, длительность выживания в почве остаются малоизученными. Требует совершенствования и методика скрининга веществ, способных ограничить размножение возбудителя. Проведение этих экспериментов возможно с использованием маркированных штаммов. Наиболее пригодным для этой цели вл етс маркирование возбудител геном зеленого флуоресцентного протеина (green fluorescence protein, GFP). GFP, выделенный из медузы Aequorea victoria, флуоресцирует в зелёном диапазоне при облу-
чении его синим светом. В настоящее врем этот белок широко использу-етс в качестве свет щейс метки в клеточной и молекул рной биологии [5]. Эффективность такого подхода неоднократно была показана на р де фитопатогенных и симбиотических бактерий [3, 9].
Целью работы было создание
штаммов возбудител черной бактериальной пятнистости томата, трансформированных геном GFP, для ис-пользовани в модельных экспериментах по оценке антибактериальной активности различных препаратов.
Материал и методы
В работе использовали штамм X. vesicatoria 1111/В, полученный из Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов (ВНИИ фитопатологии РАСХН). Для трансформации использовали плазмиду pHC60 [3], несущую ген GFP и ген устойчивости к тетрациклину.
Бактерии хранили при -70°С в 15%-м глицерине. Для культивирования X. vesicatoria использовали среду YDC [8].
Для проведения трансформации методами теплового шока и электропорации готовили химически компетентные и электрокомпетентные клетки соответственно [7]. Примен -ли ранее описанные методики теплового шока и электропорации [7]. Электропорацию проводили в кюветах (BIO-RAD, Алмабион) с расстоя -нием 0,1 см между электродами с помощью электропоратора Gene Pulser (BIO-RAD) согласно рекомендациям производителя [4]. Селекцию трансформированных колоний, экпресси-рующих GFP, проводили на среде с тетрациклином 20 мг/л с использованием бинокуля рной лупы Lumar V.12 (Zeiss). Проверку видовой принадлежности трансформированных бактерий проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфич-
ными к патогену праймерами Xnth 804/1405 в термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Москва) при следующих температурно-временных
параметрах: начальная денатурация (96°C, 7 мин), 30 циклов, включая денатурацию (94°C, 40 с), отжиг (62°C, 30 с), и элонгацию (72°C, 40 с) и дополнительную одиночную элонгацию (72°C, 7 мин). После окончания амплификации около 10 мкл амплифициро-ванных продуктов разделя ли в 1,5%-м агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в буфере TBE 0,5х.
Сравнение патогенности исходного и трансформированного штаммов проводили методом инфильтрации бактериальной суспензии плотностью 109 клеток/мл в листь томата сорта Белый Налив шприцем без иглы. Изо-л цию патогена из листьев проводили на среде YDC с тетрациклином в концентрации 20 мг/л. Оптическую плотность бактериальной суспензии (OD 600) определ ли с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США) при 600 нм. Концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий определяли методом серийных разведений [8].
Дл выбора искусственной питательной среды, обеспечивающей наилучший рост трансгенного штамма и лучшую эспрессию GFP, сравнивали среды LB, Кинг B, модификация King B с содержанием глицерина
0,1% и пептона 0,2%, модификация King B — с содержанием глицерина 0,1%, YD (YDC без карбоната кальци ). Среды засевали суспензией бактерий до конечной концентрации 105 клеток/мл и инкубировали на шейкере 200 об/мин при 27°С. Через 4, 8, 12, 16, 20, 24 и 48 ч отбирали пробы, в которых измеряли уровень флуоресценции, оптическую плотность при 600 нм (OD 600) и концентрацию КОЕ.
Интенсивность флуоресценции GFP в бактериальных суспензи х из-
меряли в условных единицах с использованием флуориметра «Джин» (ДНК-технология).
Для оценки бактерицидного действия испытывали антибиотик фито-бактериомицин (ООО «Фармбиомед-сервис») с активностью 3750 ЕА/мг. Антибиотик добавляли в различных количествах в жидкую среду Кинг Б, инокулированную трансформированным штаммом. Через 4, 8, 12, 16, 20 и 24 ч отбирали пробы по 600 мкл и измеряли ОБ 600 и интенсивность флуоресценции.
Повторность опытов 3-кратная. Статистическую обработку полу-
ченных данных проводили методом сравнени средних по критерию Дункана с использованием программы БРББ^.
Результаты и их обсуждение
Для создания флуоресцентно меченого штамма возбудителя черной бактериальной пятнистости томата использовали плазмиду рНС60. При сравнении методов трансформации (тепловой шок и электропорация) выяснилось, что эффективным является метод электропорации, так как только при его использовании удалось получить трансформированные штаммы фитопатогенной бактерии с экспрессией СЕР. Трансформированные бактерии дважды пересевали на среде ЬБ с тетрациклином 20 мг/л. Высокую интенсивность флуоресценции показали 11 изолированных колоний (рис. 1) и их принадлежность к X. ьезгсаЬапа была подтверждена ме-
«* ф . * . % • 1 г » / "•. -
• # • • - / # • ч • * • ф % Г • % ;
ч % ч - 4і т . • +
' ; ч • ^ л % ч Д • * | ' * >• V о • • • '• X ч ф •
- 1 - ф % % * N » * м
• % * і М * А / * ' ” • %* • •
* ^ ^ * ■* Ф , * * і ' Х* * і % * Ф в ш * * <1 ' ' Ч «1 - * * 1* •
т - ♦ ~
Рис. 1. Флуоресценция зеленого флуоресцентного белка у клеток трансформированного
штамма Х^вэ1оа(опа 1111/В0РР
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Рис. 2. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР с праймерами ХпШ 804/1405. ДНК:
11 трансформированных колоний X. уввісаіогіа 1111/В (дорожки 1 — 11), Ху 1111/В (дорожка 12, положительный контроль), Е. соїі ОИ10В (дорожка 13, отрицательный контроль), контроль — вода (дорожка 14, отрицательный контроль)
тодом ПЦР со специфичными праймерами (рис. 2).
Следующим этапом работы был выбор искусственной питательной среды, обеспечивающей быстрый
рост культуры штамма X. ьгзісаЬотіа 1111/BGFP и наивысший уровень флуоресценции. Результаты показали, что из 8 испытанных питательных сред среда Кинг Б в классической прописи обеспечивала наивысшую скорость роста культуры трансформированного штамма X. ьгзісаЬо-гіа 1111/BGFP и наибольшие значе-ни интенсивности флуоресценции
(табл. 1). Различия были статистически достоверны.
Также было проведено сравнение характеристик исходного и трансформированного штамма. Через 24 ч культивирования на шейкере на жидкой среде ЬБ у исходного штамма ОБ 600 было 0,147, у трансформированного штамма X. ьгзжаЬота 1111/ БСЕР — 0,140. Между этими показа-тел ми не было статистически значимых различий, что указывало на то, что присутствие плазмиды рНС60 не оказывало вли ни на скорость размножения бактерий на питательной
Т а б л и ц а 1
Рост и флуоресценция штамма X. vesicatoria 1111/ВСРР на различных жидких питательных средах
Питательная среда OD бйй Интенсивность флуоресценции, у.е.
Минеральная основа + 1% глюкозы G,G17 а 1,GG а
Минеральная основа + 1% глицерин G,G18 а 1,23 а
Минеральная основа + 1% сахарозы G,G19 а 1,25 а
King B (G,1% глицерин) G,28G б 2б,22 б
King B (G,1% глицерин + G,2% пептон) G,45G в 3G,53 в
LB G,52G г 32,97 г
YD G,75G д 3б,72 д
King B G,8GG е 43,1б е
П р и м е ч а н и е. В таблицах 1, 2 и 3 между вариантами, обозначенными одинаковыми буквами, нет статистически достоверных различий при 95%-м уровне вероятности.
среде. Сравнение патогенных свойств при инокул ции листьев томата также не выявило каких-либо различий между исходным и трансформированным штамами. Эти факты показывают, что полученный нами штамм фитопатогена с флуоресцентной меткой может быть использован в качестве адекватной модели дл изучени различных аспектов патогенеза при бактериозах растений.
На отобранной среде Кинг Б было проведено изучение кинетики роста трансформированного штамма X. ьгзжаЬота 1111 /БСЕР с измерением оптической плотности (ОБ 600), концентрации КОЕ и интенсивности флуоресценции.
Оптическа плотность бактери-
альной суспензии достоверно повышалась начина с 12 ч культивиро-вани и непрерывно возрастала в течение всего периода отбора проб (табл. 2). Концентраци КОЕ достигала максимума через 24 ч культивиро-вани и не возрастала в течение вторых суток культивирования . Интен-
сивность флуоресценции достоверно возрастала через 8 ч культивирования , наблюдался также рост в период 24-48 ч, несмотря на выход концентрации КОЕ на «плато». Это указывало на стабильность флуоресцентного белка, т.е., вероятно, на участие в общей флуоресценции СЕР мертвых клеток.
Сравнение скорости роста штамма X. ьгзжаЬота 1111/БСЕР в присутствии и отсутствии селектирующего фактора — т етрациклина — показало, что на среде без тетрациклина размножение бактерий проходило быстрее, в то же время между интенсивностью флуоресценции в этих двух вариантах не было достоверных различий (табл. 3). Это позволя ет предположить, что в процессе размножения бактерий на среде без селектирующего фактора (тетрациклина) часть бактериальных клеток способна терять плазмиду рНС60.
Отсутствие различий между исходным и трансформированным штаммом позволило нам использовать пос-
Т а б л и ц а 2
Динамика роста и интенсивности флуоресценции штамма X. vesicatoria 1111/ВвРР
на жидкой среде Кинг Б
Длительность культивирования, ч Ой 600 1-П КОЕ/мл Интенсивность флуоресценции, у.е.
0 0,018 а 14,78 а 6,29 а
4 0,020 а 15,41 аб 8,47 а
8 0,120 а 17,99 бв 13,80 б
12 0,217 б 19,25 в 34,01 в
16 0,300 в 20,28 г 35,64 в
24 0,480 г 22,59 г 39,58 г
48 0,750 д 20,39 г 64,08 е
Т а б л и ц а 3
Оптическая плотность и интенсивность флуоресценции бактериальной суспензии штамма X. vesicatoria 1111/ВвРР через 24 ч культивирования в жидкой среде Кинг Б
Среда Ой 600 Интенсивность флуоресценции, у.е.
Кинг Б 0,420 а 19,36 а
Кинг Б + тетрациклин 20 мг/л 0,380 б 21,38 а
ледний в качестве модели для оценки эффективности бактерицидов. В эксперименте нами был использован фитобактериомицин — антибиотик, способный подавлять большинство фитопатогенных бактерий [2]. Добавление этого антибиотика в жидкую среду Кинг Б для культивирования трансформированного штамма показало, что размножение тест-объекта и флуоресценция существенно подавлялись при концентрации 1 мг/л и
полностью подавл лись при концентрациях антибиотика свыше 5 мг/л (рис. 3). Различия опытных вариантов с контролем (без антибиотика) по уровню флуоресценции были статистически достоверны уже через 4 ч культивировани .
Таким образом, нами показана принципиальная возможность
экспресс-оценки активности бактерицидов путем измерени интенсивности флуоресценции зеленого флуо-
Рис. 3. Интенсивность флуоресценции зеленого флуоресцентного белка при культивировании штамма X. vesicatoria 1111/В0РР на среде Кинг Б при различных концентрациях фитобактериомицина
ресцентного белка у трансформиро- раторном скрининге средств защиты ванного штамма фитопатогена. Метод растений от бактериальных болезней может быть использован при лабо- растений.
Библиографический список
1. Матвеева Е.В. Черная бактериальная пятнистость томата (Возбудитель Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) // Агро XXI, 2006. № 10-12. С. 30-32.
2. Петрухина М.Т., Буянова Н.Д., Буцевич Л.А. Фитобактериомицин — отечественный антибиотик для защиты растений. Обзор. М.: ОНТИТЭИмикробиопром, 1973.
3. Cheng H.P., Walker G.C. Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti // J. Bacteriol., 1998. V. 180. P. 5183-5191.
4. Eppendorf A.G. Basic Applications Manual Electroporation, 2006. Hamburg.
5. Green fluorescent protein : properties, applications, and protocols / edited by M. Chalfie and S.R. Kain. 2nd ed. p. John Wiley & Sons, Inc., 2006.
6. Jones J.B., Lacy G.H., Bouzar H., Stall R.E., Schaad N.W. Reclassification of the xanthomonads associated with bacterial spot disease of tomato and pepper // Syst. Appl. Microbiol., 2004. V. 27. P. 755-762.
7. Laboratory Protocols: CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory. Third Edition. Mexico, CIMMYT, 2005.
8. Schaad N.W., Jones J.B., Lacy G.H. Laboratory guide for the identification of plant pathogenic bacteria. 3rd edition. St. Paul, Minnesota // American Phyto-pathological Society, 2001.
9. So J.S., Lim H.T., Oh E., Heo T.R., Koh S.C., Leung K.T., Lee H., Trevors J.T. Visualizing the infection process of Xanthomonas campestris in cabbage using green fluorescent protein // World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2002. V. 18. P. 17-21.
Рецензент — к. б. н. А.А. Ванькова
SUMMARY
According to the electroporation method, using pHC60 plasmid with GFP gene, causative agent of black bacterial speck in tomato plants bas been transformed. Genetically transformed strain X. vesicatoria does not differ from the initial one in both growth rate, in artificial nutrient medium, and its pathogenic characteristics. Principle possibility of bactericides’ activity rapid analysis by means of fluorescence intensity measuring, green fluorescent protein in a transformed phytopathogen strain, has been proven in the article.
Key words: green fluorescent protein, GFP, black bacterial speck in tomato plants.
Мотамеди Шаламзари Абдоррахман — асп. каф. фитопатологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 976-12-79. Эл. почта: motamedy_a@yahoo.com
Джалилов Февзи Сеид-Умерович — д. б. н., РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 976-12-79. Эл. почта: labzara@mail.ru
Карлов Геннадий Ильич — к. б. н., РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 977-70-01. Эл. почта: karlov@timacad.ru
