CC BY
193
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2010. Вып. 1. С. 175-185 Химия
УДК 581.1;581.143.5
Влияние ассоциативных микроорганизмов на устойчивость томатов к фитопатогенам in vitro и in vivo *
Н.С. Захарченко, М.А. Чепурнова, Л.С. Карнова, А.В. Захарченко, С.В. Пиголева, И.Ф. Пунтус, В.В. Кочетков
Аннотация. Исследовано влияние ассоциативных микроорганизмов (Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas putida и Methylovorus mays) на рост, развитие и устойчивость к патогенным микроорганизмам растений томатов (Lycopersicon esculentum Mill.) in vitro и in vivo.
Ключевые слова: клональное микроразмножение, Lycopersicon esculentum Mill., ассоциативные микроорганизмы, колонизация, фитопатогены.
ВВЕДЕНИЕ
Повышение продуктивности сельскохозяйственных растений и их устойчивости к различным биотическим и абиотическим стрессовым факторам внешней среды является важнейшей проблемой современной агробиотехнологии. При этом приоритет отдается экологическим методам ведения сельского хозяйства.
Одним из путей решения этой задачи является разработка биотехнологических основ защиты растений от фитопатогенов с помощью их колонизации ассоциативными микроорганизмами.
Ассоциированные микроорганизмы оказывают стимулирующее влияние на рост и развитие растений за счет способности к азотофиксации, продуцированию физиологически активных веществ, в т.ч. и фитогормонов, мобилизации питательных элементов из почвы, подавлению роста фитопатогенов. Некоторые из них обладают способностью к деградации и детоксикации чужеродных химических соединений в окружающей среде. Ассоциированные микроорганизмы способны устанавливать с растениями прочную симбиотическую связь, что указывает на перспективность их использования в условиях конкуренции с микроорганизмами различных агробиоценозов.
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты № 09-04-90705-моб_ст, № 08-08-00406, 08-04-90028-Бел_а) и госконтракта № 02.512.11.2337.
Список микроорганизмов, положительно влияющих на рост растений и их устойчивость к фитопатогенам, невелик и расширение этого списка является актуальной задачей агробиотехнологии.
В связи с этим целью работы было исследование влияния штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas putida и Methylovorus mays на рост и развитие, адаптацию к условиям in vivo и устойчивость к фитопатогенам растений томата, выращенных и клонально микроразмноженных in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Объектами исследования служили растения томата (Lycopersicon esculentum Mill.) сорта Космос. Семена томата после поверхностной стерилизации в 1% растворе гипохлорита натрия проращивали в культуре in vitro на агаризованной безгормональной среде МС, содержащей стандартный набор солей и включающей 7 г/л агара и 30 г/л сахарозы (рН 5,8) [1]. Растения культивировали при температуре 22-240С, 16-часовом дне и освещенности 2,5 клк.
Бактериальные штаммы. Для колонизации растений использовали следующие штаммы:
1. Pseudomonas aureofaciens BS1393 (ВКМ-В-2188) — продуцент фена-зиновых антибиотиков из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН [2,3].
2. Pseudomonas putida KT 2442::gfp (pNF142::TnMod) (Kmr, Tcr), штамм, содержащий в хромосоме маркерный ген gfp, любезно предоставлен K.Smalla (Германия) [4].
3. Methylovorus mays ВКМ В-2221 — из коллекции лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ РАН [5].
Бактерии рода Pseudomonas культивировали на среде LB (рН 7,5), бактерии рода Methylovorus выращивали на среде Канеда (рН 7,2) с добавлением 0,5% метанола [5]. Для колонизации растений использовали клетки микроорганизмов в конце экспоненциальной фазы роста с оптической плотностью суспензии 1,6—1,8 оптических единиц, соответствующей концентрации бактерий 1х109 колониеобразующих единиц на 1 мл (КОЕ/мл). Далее суспензию разбавляли до концентрации бактерий 1х105 КОЕ/мл.
Штаммы фитопатогенов. Для изучения устойчивости ассоциированных растений к патогенам использовали следующие микроорганизмы:
1) штамм микомицета Sclerotinia sclerotiorum, полученный из Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур им. В. С. Пустовойта (г. Краснодар);
2) штамм бактерии Erwinia carotovora B15, полученный из Horticulture Centre (Канада).
Для культивирования микомицетов использовали питательную среду — картофельно-глюкозный агар, содержащую 20% глюкозы, экстракционную вытяжку картофеля и 20 г/л агара (рН 7,2) [6]. Бактерии выращивали на среде LB (рН 7,5).
Колонизация растений томата. Для бактериальной колонизации использовали 15-дневные черенки стерильных растений томата, выращенных в культуре in vitro на агаризованной питательной среде МС. Стерильной кисточкой на листья растений наносили суспензию микроорганизмов, при этом концентрация бактерий составляла 1х105 КОЕ/мл. Растения инкубировали при 22-24°С в термальной комнате, длительность пассажа составляла 3 недели.
Биотесты на стабильность ассоциативных связей. Через 2 недели после колонизации проводили черенкование растений и микробиологическое тестирование различных эксплантов (корней и листьев) на установление ассоциативной связи с бактериями. Для этого растительный экссудат,
-1 2
путем гомогенизации 1 см2 растительной ткани, наносили на поверхность твердой питательной среды в чашках Петри. Экссудаты растений, колонизированных P. aureofaciens, растирали на среде LB, P. putida — на среде LB с добавлением селективных антибиотиков канамицина и тетрациклина, а экссудаты растений, колонизированных метилобактериями — на среде Ка-неда. После инкубирования микроорганизмов проводили подсчет КОЕ в см2 растительной ткани.
Биотесты на изолированных листьях растений. Исследование устойчивости растений томата к фитопатогенам E. carotovora и S. sclerotiorum проводили на изолированных листьях. Для этого молодые листья колонизированных и контрольных растений помещали в чашки Петри и инфицировали суспензией E. carotovora (1х106 КОЕ/мл), а также кусочками агара с мицелием гриба S. sclerotiorum, предварительно создав раневую поверхность на черешке листа. Степень повреждения листовой пластинки оценивали в течение 1-14 суток при заражении бактериями и 30 суток в случае грибного поражения.
Биометрические исследования. Для определения влияния ассоциации на рост и развитие растений томата и их адаптацию к условиям закрытого, а потом и открытого грунта колонизированные растения из системы in vitro сначала пересаживали в стерильную почву на станции искусственного климата «Биотрон» ФИБХ РАН (г. Пущино), а затем высаживали в открытый грунт учебно-опытного участка и наблюдали за их ростом и развитием. Биометрические измерения проводили еженедельно, отмечая время наступления фенологических фаз. Определение сухого вещества и сахаров в плодах томата проводили рефрактометрическим методом.
Изучение устойчивости растений к фитопатогенам. Фитопатологическое обследование посадок томатов в открытом грунте проводили в два срока за вегетацию, учитывая появление и распространение фитофто-роза. Степень развития болезни отмечали на последний срок учета. Для
этого распространенность и интенсивность развития фитофтороза на вегетирующих растениях определяли, используя рекомендованные методы учета и шкалы. Для определения интенсивности развития болезни использовали условные шкалы [7], [8]. Для определения степени поражения листьев и плодов растений фитофторозом использовали шкалу, рекомендованную [7]. Расчет биологической эффективности колонизации растений микроорганизмами проводили по формуле [7]. Статистическая обработка данных проводилась по Доспехову [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты тестирования растений на ассоциативность с микроорганизмами показали наличие клеток изучаемых штаммов бактерий как во всех исходно колонизированных томатах, так и в растениях, полученных после нескольких пассажей микроразмножения. Присутствие бактерий P. аureofa-ciens, P. putida и M. mays в растительных тканях после нескольких пассажей клонального микроразмножения указывает на стабильную ассоциацию этих микроорганизмов с растениями в культуре in vitro. В чашках Петри на среде LB наблюдали рост колоний псевдомонад, имеющих характерный желто-оранжевый цвет, обусловленный синтезом феназин-1-карбоновой кислоты и ее окси-производных. В чашках на среде Канеда отмечали рост метилобактерий. Колонизация растений штаммом, экспрессирующим флуоресцентный белок GFP, также приводила к стабильной ассоциации бактерий с растениями. Колонии, выросшие на среде LB с добавлением антибиотиков, имели зеленый цвет при ультрафиолетовом освещении. Необходимо отметить, что содержание псевдомонад в листьях в первом пассаже микроразмножения составляло 1-3 тыс. КОЕ/см2, а в корнях 10-20 тыс. КОЕ/см2, что указывает на ризосферную специфичность штамма. В последующих пассажах микроразмножения содержание бактерий P. аureofaciens, P. putida в растительных эксплантах стабильно сохранялось. Количество КОЕ метилобактерий в листьях и корнях составляло 1-3-103/см2, что также свидетельствует о стабильной ассоциации бактерий с размножаемыми in vitro растениями. Необходимо отметить, что устойчивость ассоциативной связи «растение-микроорганизм» сохранялась не только в культуре in vitro, но и на протяжении всего срока вегетации растений в системе in vivo. Так, результаты тестирования плодов томатов, колонизированных микроорганизмами, показали наличие клеток псевдомонад с маркерным геном gfp в мякоти плодов.
Таким образом, ассоциативная связь «растение-микроорганизм», установившаяся в системе in vitro, сохраняется и в культуре in vivo на протяжении всего срока вегетации растений.
Изучение устойчивости колонизированных растений к фитопатогенным микроорганизмам проводили в два этапа: в культуре in vitro, заражая листья растений патогенами E. carotovora и S. sclerotiorum, а также в системе in
vivo, отмечая степень поражения томатов болезнями в течение всего периода вегетации.
Инфицирование растений бактериями E. carotovora показало, что уже через сутки на контрольных листьях отмечались признаки разрушения ткани мезофилла. К концу вторых суток степень поражения контрольных листьев составила уже 100%. В то же время листья колонизированных растений оставались без признаков повреждения. Аналогичные результаты были отмечены при заражении целых растений. Колонизированные растения остались практически неповрежденными в течение всего времени эксперимента, тогда как контрольные полностью сгнили.
Инфицирование растений грибом S. sclerotiorum показало, что уже в первые дни эксперимента на неколонизированных листьях были заметны признаки поражения — темные некротические пятна, что в дальнейшем приводило к полной гибели клеток листа. У листьев колонизированных растений таких признаков отмечено не было, они остались полностью здоровыми и неповрежденными. Целые растения также заражали микомицетом, помещая кусочки мицелия гриба в междоузлия листьев. Уже через неделю на листьях контрольных растений был заметен некроз ткани. К концу второй недели степень поражения контрольных растений достигла 50%, в то время как колонизированные растения остались без признаков повреждения. В течение 15-20 суток неколонизированные растения погибали от воздействия патогена, а колонизированные проявляли устойчивость.
Процессы взаимодействий между микроорганизмами и растениями определяют существенные стороны физиологической активности последних. Недавно показано, что ассоциированные с растениями метилобактерии синтезируют цитокинины и ауксины и способствуют не только ускоренному прорастанию семян, но и дальнейшему активному росту проростков [10]. Псевдомонады также стимулируют развитие растений, они способны растворять труднодоступные фосфаты и не обладают фитотоксическим действием. Известно, что штамм P. aureofaciens BS1393 синтезирует феназин-1-карбоновую кислоту и ряд окси-производных феназина, обладающих антибиотическими свойствами и подавляющих рост фитопатогенных грибов и бактерий [3].
Культивирование растений в системе in vitro показало, что ассоциированные растения имеют более развитую корневую систему, значительно превышают в высоте и количестве листьев контрольные растения.
Адаптация in vivo — сложный и стрессовый этап для растений послекуль-тивирования in vitro, во время которого погибает значительное количество регенерантов. Одним из способов оптимизации адаптационного периода может быть использование колонизации растений полезными ассоциативными микроорганизмами.
Для изучения эффекта ассоциативной связи «растение-микроорганизм» в закрытом грунте проводили еженедельные биометрические исследования. Данные табл. 1 показывают, что колонизированные растения томата после пересадки из системы in vitro лучше адаптируются к условиям закрытого
грунта, по сравнению с контрольными растениями. Так, приживаемость растений, колонизированных M. mays и P. aureofaciens, составила 100 %, тогда как контрольных растений была в два раза меньше и составила 53 %. Еженедельные биометрические исследования показали, что динамика роста ассоциированных растений была значительно выше по сравнению с контролем. Так, средняя высота растений после 8 недель колонизации была на 40-52 % больше, чем у неколонизированных растений. Необходимо отметить, что колонизация томатов метилобактериями стимулировала большее образование пасынков (по 3-4 на одном растении; в контроле — 1-2) и более активное бутонообразование (количество растений с бутонами было на 63 % больше, чем в контроле).
Таблица 1
Биометрические исследования томатов в зарытом грунте
Показатели растений Контроль M. mays P. aureo-fadens P. putida
Кол-во прижившихся растений, после пересадки из системы in vitro в закрытый грунт, % 53 100 100 89
Средняя высота растений после 4 недель колонизации, см 5,3 ± 0,3 14,6 ± 1,1 12,6 ± 0,9 16,3 ± 1,1
Средняя высота растений после 8 недель колонизации, см 22,5 ± 2,0 34,3 ± 2,6 31,6 ± 2,8 33,2 ± 3,0
Количество пасынков на одном растении после 8 недель колонизации, шт. 2-3 3-4 2-3 2-3
Количество растений с бутонами после 8 недель колонизации, % 57,1 93,2 84,3 88,4
Таким образом, колонизированные растения проявляют не только активное корнеобразование и рост в системе in vitro, но и в условиях закрытого грунта. Они легче переносят процесс адаптации к новым условиям, гибель растений была минимальной по сравнению с контролем. Такая тенденция сохранялась при введении растений в систему открытого грунта.
Динамика развития контрольных и опытных растений в открытом грунте приведена в табл. 2. Необходимо отметить, что время наступления фенологических фаз у контрольных и ассоциированных растений значительно различалось. Так, неколонизированные растения позже вступали в каждую из фенофаз, а период вегетации у них закончился раньше, чем в других вариантах опыта (на 30 дней раньше, чем у растений колонизированных P. aureofaGiens).
Среди колонизированных растений выявлена следующая закономерность. Томаты, ассоциированные метилобактериями, вступали в фенофазы на 2-3 дня раньше, чем растения, ассоциированные псевдомонадами. Фаза
Таблица 2
Динамика развития растений томата по фенофазам в системе in vivo
Фенологические фазы растений Контроль M. mays P. aureo-fadens P. putida,
Появление первых бутонов, день вегетации 60 59 60 58
Появление первых цветов, день вегетации 73 70 71 71
Массовое цветение, день вегетации 82-92 80-86 80-88 80-88
Начало плодоношения, день вегетации 86 84 82 82
Срок первого сбора урожая, день вегетации 127 117 120 118
Срок последнего сбора урожая, день вегетации 136 156 161 163
Начало увядания растений, день вегетации 131 153 161 162
массового цветения прошла у них значительно дружнее — за 6 дней, при колонизации псевдомонадами — за 8 дней и в контроле — за 10 дней. Однако увядание растений было более ранним, чем у томатов, ассоциированных псевдомонадами. Это можно объяснить тем, что псевдомонады синтезируют антибиотические вещества, подавляющие рост фитопатогенной микофлоры, тем самым продлевая жизнь колонизированным растениям.
Таблица 3
Характеристика морфологических и биохимических показателей плодов
томата
Контроль M. mays P. aureo-faáens P. putida
Средняя масса одного плода, г 68,4 ± 5,8 80,3 ± 7,2 77,2 ± 6,7 79,2 ± 4,7
Урожайность с одного куста, г 1500 ± 112 2160 ± 170 1950 ± 125 2070 ± 168
Содержание сухого вещества, % 6,3 ± 0,4 6,3 ± 0,3 6,2 ± 0,6 6,3 ± 0,4
Содержание сахаров, % 5,5 ± 0,3 5,5 ± 0,4 5,2 ± 0,5 5,4 ± 0,3
Данные табл. 3 показывают, что колонизация растений микроорганизмами повлияла на урожайность томатов. Средняя масса одного плода в контроле составила 68,4 г, что соответствует мелкоплодным растениям. Тогда как томаты сорта «Космос» являются среднеплодным растениями. У колонизированных растений масса одного плода в среднем была на 12-17 % больше,
что соответствует сортовой характеристике. По урожайности контрольные растения значительно уступали опытным. Так, урожайность с одного куста растений, колонизированных метилобактериями, была на 44 % выше, чем у неколонизированных томатов. Колонизация растений микроорганизмами не повлияла на содержание в плодах сухого вещества и сахаров. Разница в показаниях была в пределах ошибки. Необходимо отметить то, что плоды колонизированных томатов были правильной формы, созревание их было более дружным, что позволяло снимать урожай кистями.
Действие фитопатогенов отрицательно сказывается на росте и развитии растений. Несмотря на очевидные достижения в области разработки химических средств защиты растений и создания сортов сельскохозяйственных культур с повышенной устойчивостью к патогенам методами традиционной селекции, проблема защиты растений от фитопатогенных организмов остается по-прежнему актуальной [11]. Для культуры томата одним из злостных патогенов является микомицет рода Phytophtora гриб Phytophtora infestans. Поражение томатов фитофторозом ежегодно приводит к значительным потерям урожая. Колонизация растений ассоциативными микроорганизмами является одной из стратегий биологического метода защиты растений. Ранее нами была изучена устойчивость колонизированных растений к бактериальным и грибным фитопатогенным микроорганизмам в культуре in vitro. Для более полного вывода об эффективности колонизации томата ассоциативными микроорганизмами против фитопатогенов провели обследование посадок, с целью изучения распространенности фитофтороза и степенью развития заболевания.
ТАБЛИЦА 4
Динамика развития фитофтороза на растениях томата открытом грунте
Вариант опыта Р аспространенность болезни на листьях, % Р аспространенность болезни на плодах, % Степень развития болезни, %
25.07.09 11.08.09 25.07.09 11.08.09
Контроль 84 100 44 86 80
Колонизация M. mays 72 100 23 67 40
Колонизация P. aureofaсiens 63 100 0 45 20
Колонизация P. putida 66 100 0 42 20
Фитопатологическая оценка устойчивости томатов к фитофторозу, представленная в табл. 4, показала, что растения всех вариантов опыта поражались этим заболеванием, причем распространенность заболевания особенно интенсивно начинала нарастать в третьей декаде июля и достигала максимальных значений к концу вегетации растений. Однако в распростра-
ненности заболевания на листьях и плодах томата есть различия. К концу вегетации симптомы фитофторозного поражения листьев были отмечены у всех учетных растений во всех вариантах опыта, т.е. 100 %. Проявление фитофтороза на плодах томата было следующим: в контроле распространенность составила 86 %; на растениях, колонизированных P. aureofaciens и P. putida показатели были в 2 раза меньше и составили 45% и 42% соответственно, причем признаки заболевания появлялись только ко второму сроку учета. Интенсивность заболевания на растениях разных вариантов также проявлялась неоднозначно. Степень развития фитофтороза в контроле имеет высокое значение — 80 %; степень развития заболевания на растениях, колонизированных псевдомонадами, составила всего 20 %.
Таким образом, фитопатологическая оценка устойчивости томата к фи-тофторозу показала, что колонизация растений ассоциативными микроорганизмами значительно повышает защитные механизмы растений против фитопатогенов. При этом лучшие результаты были получены при колонизации растений штаммами рода Pseudomonas, по сравнению с колонизацией Methylovorus mays. Так биологическая эффективность колонизации томатов псевдомонадами была на 75 % выше, чем в контроле, а эффективность колонизации метилобактериями — на 50 %.
Проведенное исследование показало эффективность колонизации растений томата in vitro полезными ассоциативными микроорганизмами как перспективного метода биологической защиты культурных растений.
Список литературы
1. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. V.15. P.473-497.
2. Боронин А.М., Кочетков В.В. Эффективный биофунгицид для защиты растений // Агро XXI. 2003. №1-6. C.64-66.
3. Боронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский образовательный журнал. 1998. №10. С.25-31.
4. Exogenous isolation of antibiotic resistance plasmids from piggery manure slurries reveals a high prevalence and diversity of IncQ-like plasmids / K. Smalla [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66, №11. Р.4854-4862.
5. Доронина Н.В., Кудинова Л.В., Троценко Ю.А. Methylovorus mays-новый вид аэробных облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями // Микробиология. 2000. Т.69. С.712-716.
6. Наумов Н.А. Методы микологических и фитопатологических исследований. Л.:Сельхозиздат, 1937. С.272.
7. Захарова Т.И., Минкевич И.И. Методические указания по определению вредоносности болезней сельскохозяйственных культур. М.: Наука, 1975. 56 с.
8. Дьяков Ю.Т. Эволюция и систематика грибов. Л.: Наука, 1984. C.37-46.
9. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1965. 422 с.
10. Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метило-
трофными бактериями / М.А. Каляева [и др.] // Физиология растений. 2001.
Т.48, №4. С.596-599.
11. Бурьянов Я.И., Кадо К.И. Стратегия создания растений с устойчивостью к фитопатогенам и вредителям // Биорганическая химия. 1999. Т.25, №12. С.903-910.
Захарченко Наталья Сергеевна (znata_2004@rambler.ru), к.б.н., старший научный сотрудник, Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино.
Чепурнова Майя Александровна (chepurnovama@rambler.ru), к.б.н., доцент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Карнова Людмила Сергеевна, студент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Захарченко Андрей Владимирович, магистрант, Филиал Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Пущино.
Пиголева Светлана Васильевна, научный сотрудник, Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино.
Пунтус Ирина Филипповна, к.б.н., старший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Кочетков Владимир Васильевич, к.б.н., старший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Effect of the associative microorganisms on the resistance of tomato plants to pathogens in vitro and in vivo
N.S. Zakharchenko, M.A. Chepurnova, L.S. Karnova, A.V. Zakharchenko, S.V. Pigoleva, I.F. Puntus, V.V. Kochetkov
Abstract. Effect of the associative microorganisms (Pseudomonas aureofa-ciens, Pseudomonas putida and Methylovorus mays) on the growth, development and resistance to pathogens of tomato plants (Lycopersicon esculentum Mill.) was studied in vitro and in vivo.
Keywords: clonal mikroreproduction, Lycopersicon esculentum Mill., associative microorganism, colonization, phytopathogens / plant pathogens.
Zakharchenko Natalia (znata_2004@rambler.ru), candidate of biological sciences, senior researcher, Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, Pushchino.
Chepurnova Maya (chepurnovama@rambler.ru), candidate of biological sciences, associate professor, department of biotechnology, Tula State University.
Karnova Ludmila, student, department of biotechnology, Tula State University.
Zakharchenko Andrey, undergraduate student, Branch of Lomonosov Moscow State University, Pushchino.
Pigoleva Svetlana, scientist, Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, Pushchino.
Puntus Irina, candidate of biological sciences, senior researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Kochetkov Vladimir, candidate of biological sciences, senior researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Поступила 20.10.2009
