CC BY
101
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 3. С. 210-219
Химия
УДК 581.1;58.084.1
Положительное влияние колонизации сахарной свеклы метилотрофными бактериями на систему антиоксидантной защиты растений *
С. В. Пиголева, Н. С. Захарченко, А. А. Ермошин, М. А. Чепурнова,
Я. И. Бурьянов
Аннотация. Исследовано влияние колонизации растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) ассоциативными бактериями (Methylovorus mays) на устойчивость растений к окислительному стрессу, вызванному гербицидом паракватом. Оценены следующие показатели стресса — уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран, содержание эндогенной перекиси водорода и свободного пролина, активность ферментов супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и пероксидазы. Показано, что колонизированные растения более устойчивы к окислительному стрессу, чем контрольные. Под действием стрессора у колонизированных растений отмечено повышение активности ферментов-антиоксидантов, в то же время уровень ПОЛ оставался без изменений, а содержание перекиси водорода увеличивалось не так значительно, как в контроле.
Ключевые слова: Beta vulgaris L., ассоциативные микроорганизмы, Methylovorus mays, колонизация растений, ферменты-антиоксиданты, окислительный стресс, перекисное окисление липидов, паракват.
Введение
Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) одна из важнейших технических культур для производства сахара и получения корма для животных. Однако, эта культура довольно сложна в культивировании, требовательна к свету и влажности, особенно в период интенсивного роста, а при низких температурах легко погибает и поражается болезнями. В связи с этим повышение устойчивости данной культуры к стрессовым факторам является
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты №10-04-00037, №1108-00413) и Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» ГК № П1301.
актуальной задачей сельскохозяйственной биотехнологии. Колонизация растений ассоциативными микроорганизмами позволяет решить эту проблему, поскольку они выделяют биологически активные вещества, стимулирующие рост и развитие растений.
Устойчивость растений к стрессовым факторам определяется способностью своевременно включать механизм защиты. В неблагоприятных условиях в клетках растений происходит усиление продукции активных форм кислорода (АФК), накопление которых приводит к окислительному стрессу и повреждению клеток [1]. Поддержание концентрации АФК на достаточно низком уровне и локализацию их действия осуществляет специализированная многокомпонентная антиокислительная система, включающая низкомолекулярные антиоксиданты и ферменты, такие как супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, различные изоформы пероксидаз [2, 3]. Целью нашей работы было изучить влияние колонизации
метилотрофными ассоциативными бактериями Methylovorus mays растений сахарной свеклы на устойчивость их к стрессу. Для достижения данной цели была проведена оценка окислительного повреждения мембран (уровень перекисного окисления липидов), содержания эндогенной перекиси водорода в клетках, активности ферментов антиоксидантной защиты (СОД, каталаза, гваяколовая пероксидаза) и концентрации свободного пролина.
Материалы и методы
Объектом исследования служили растения сахарной свеклы (Beta vulgaris L.), выращенные в культуре in vitro на агаризованной безгормональной среде МС [4]. Растения культивировали при температуре 22-24°С, 16-часовом дне и освещенности 2,5 клк. Для колонизации растений использовали бактериальный штамм Methylovorus mays ВКМ В-2221 любезно предоставленный проф. Ю.А. Троценко (Учреждение РАН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН) [5]. Клетки микроорганизмов использовали в конце экспоненциальной фазы роста с оптической плотностью суспензии ОДбоо 1,6—1,8 ОЕ, соответствующей концентрации бактерий 1 х 109 колониеобразующих единиц на 1 мл (КОЕ/мл).
Для бактериальной колонизации использовали семена или 15-дневные черенки асептически выращенных растений. Стерильной кисточкой на листья растений или семена наносили суспензию микроорганизмов разбавленную до концентрации бактерий 1 х 105 КОЕ/мл. Растения инкубировали при 22-24°С, длительность пассажа составляла 3 недели. Далее растения были высажены в закрытый грунт на станции искусственного климата «Биотрон».
Стабильность ассоциативных связей бактерий с растениями проверяли через 2 недели после колонизации. Для этого гомогенат 1 см2 растительной ткани наносили на поверхность твердой питательной среды Канеда,
содержащую 1% метанола, и проводили подсчет колониеобразующих единиц в см2 растительной ткани.
Для оценки устойчивости к абиотическому стрессу, листовые диски диаметром 1 см инкубировали в 5 мкМ растворе параквата и для контроля на воде в течение 1 ч в темноте и 20 ч на свету.
Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически по образованию окрашенного продукта с тиобарбитуровой кислотой, по методике [6].
Содержание пролина определяли в водной вытяжке, по образованию окрашенного продукта с нингидриновым реактивом, по методике [7] с небольшими модификациями.
Содержание эндогенной перекиси водорода определяли спектрофотометрически по методу [8].
Для выделения ферментов растительный материал (100 мг) гомогенизировали в 0,6 мл 100 мМ фосфатного буфера (рН 7,8). Супернатант использовали для определения ферментов. Содержание белка определяли методом Брэдфорд [9].
Активность супероксиддисмутазы определяли по методу [10], используя нитросиний тетразолий (НСТ). За одну единицу активности СОД принимали содержание фермента, вызывающее ингибирование фотохимического восстановления НСТ на 50%; данные представлены в единицах активности фермента (Еи)/(мг белка*ч).
Активность гваяколовой пероксидазы (ГП) определяли спектрофотометрически, по окислению гваякола по методике [11] и выражали в мкмоль окисленного субстрата за единицу времени в расчете на 1 мг белка.
Активность каталазы определяли по образованию окрашенного продукта, в результате реакции перекиси водорода с молибдатом аммония по методу Королюка [12].
Измерения производили на спектрофотометре Shimadzu UV 1600 (Япония).
На рисунках данные представлены в виде средних значений и их стандартной ошибки. Статистическиий анализ данных проводили с помощью програмных пакетов Excel 2007 и Statistica 6.0. Анализы проводили в трех биологических и в двух-четырех аналитических повторностях. Достоверность отличий оценивали по непараметрическому критерию Мана-Уитни.
Результаты и обсуждение
Колонизация семян сахарной свеклы ассоциативными почвенными бактериями Methylovorus mays показала, что всхожесть колонизированных семян возрастала на 20-25% по сравнению с неколонизированными контрольными. Тестирование сегментов листьев и корней на присутствие метилобактерий доказало их наличие во всех колонизированных растениях.
Содержание бактерий M. mays в листьях сахарной свеклы составляло 1,5-2,6 тыс. КОЕ/см2 листа. Культивированные in vitro колонизированные растения сахарной свеклы имели более развитую корневую систему и значительно превышали в высоте и количестве листьев контрольные растения (табл. 1). Колонизированные растения раньше начинали формировать корневую систему (на 6-й день после черенкования), в то время как контрольные — на 8-14-й день. Ранее было показано, что устойчивость ассоциативной связи «растение-микроорганизм» сохраняется не только в культуре in vitro, но и на протяжении всего срока вегетации растений in vivo [13]. Колонизированные растения табака и льна лучше переносят стрессовые условия, растут на обедненных средах, в отсутствии сахарозы или витаминов, в то время как контрольные растения прекращают свой рост, и погибают [14]. Результаты нашего исследования совпадают с приведенными выше данными. Так, колонизированные растения свеклы продолжали рост в течение двух-трех месяцев на обедненных средах (без азота или сахарозы), а контрольные растения погибали в течение 8-20 дней. Возможно, это связано со свойством метилобактерий синтезировать и поставлять в растения цитокинины, ауксины, гиббереллины, витамины и полисахариды [5, 15, 16]
Таблица 1
Влияние M. mays на рост и морфогенез растений сахарной свеклы
Параметры Колонизированные растения Контрольные растения
Количество корней 1 (шт.) 15 ± 0,1 10 ± 0, 2
Количество листьев 2 (шт.) 13, 7 ± 0, 2 8,4 ± 0, 6
Длина листьев 3 (см) 8, 9 ± 0,1 6, 2 ± 0, 3
Растения, выжившие после высадки в условия теплицы4 (%) 92 ± 1, 5 70 ± 1,1
1 ,4 — измерения проведены через 3-4 недели после колонизации, 2 ,3 — измерения проведены через два месяца после колонизации
Окислительный стресс у растений вызывали с помощью гербицида параквата, обладающего токсическим действием в связи с индукцией супероксид радикалов при его восстановлении на свету.
Нами проведена оценка перекисного окисления липидов в растениях при стрессе и без него. В отсутствие стресса уровень ПОЛ у колонизированных и контрольных растений сахарной свеклы был примерно одинаков. При стрессе у контрольных растений уровень ПОЛ повысился на 47%, а у колонизированных растений уменьшился на 3,7% (рис. 1). Таким образом, у колонизированных растений уровень ПОЛ не изменился после стресса, а у контрольных растений произошла существенная индукция ПОЛ.
Рис. 1. Влияние параквата на уровень перекисного окисления липидов у контрольных (1) и колонизированных растений (2)
Рис. 2. Влияние параквата на активность супероксиддисмутазы у контрольных (1) и колонизированных растений (2)
СОД является первой линией защиты клеток от повреждения АФК и осуществляет реакцию дисмутации супероксид аниона. Показано, что при обработке паракватом колонизированных растений активность СОД возрастала на 74,8%, в то время как у контрольных растений активность фермента повышалась на 41% (рис. 2). Рядом исследователей показано, что более устойчивые к стрессу растения отличаются более высокими активностями СОД и меньшими окислительными повреждениями. Из этого можно сделать вывод, что колонизированные растения являются более устойчивыми по сравнению с контрольными [17, 18, 19]. В результате ферментативной активности СОД, а также в неферментативных реакциях в клетке образуется перекись водорода, которая оказывает повреждающее действие на белки и мембраны клетки. Однако перекись водорода также считается вторичным месенджером, передающим сигнал от межклеточных
сигнальных молекул на внутриклеточные регуляторные системы. По нашим данным, исходное количество перекиси водорода у колонизированных растений было значительно ниже (на 83%), чем у контрольных (рис. 3). Возможно, этот эффект является дополнительным положительным моментом колонизации растений метилотрофами и предадаптацией организма растения к стрессу, то есть проявляет новое приспособление или повышает уровень устойчивости в новых условиях. При стрессе количество перекиси водорода в колонизированных и контрольных растениях различалось незначительно, повышалось на 75 и 81% соответственно. Поскольку изначальное количество перекиси водорода у колонизированных растений было существенно ниже, то её уровень у них при стрессе был на 55% ниже, чем у контрольных растений (рис. 3).
о
О 200
^ 150
§ 100 с. о
и 50
.4 £
2
о
ф
с 1 2
□ вода Шпаракват
Рис. 3. Влияние параквата на уровень пероксида водорода в листьях контрольных (1) и колонизированных растений (2)
Избыток перекиси водорода токсичен для клеток и утилизируется ферментами защитной системы — каталазой и различными пероксидазами растений. Каталаза может эффективно работать при высоких концентрациях перекиси водорода, в то время как пероксидазы — при невысоком её уровне [1]. Гваяколовая пероксидаза окисляет фенольные соединения и участвует в биосинтезе лигнина клеточной стенки [20]. Активность каталазы у колонизированных растений при стрессе повышалась на 88%, у контрольных — на 69% (рис. 4). В то же время, возрастание активности ГП было одинаковым у колонизированных (на 33%) и у контрольных растений (на 29%).
Известно, что при стрессе в клетках растений увеличивается количество пролина. Пролин оказывает стабилизирующее действие на мембраны, уменьшает осмотический стресс, защищает белки от денатурации, участвует в передаче стрессового сигнала, регулирует ге^х-потенциал клетки [21]. Уровень пролина в колонизированных и контрольных растениях до стресса был одинаков. Под действием параквата его уровень увеличился в контроле
Рис. 4. Влияние параквата на активность каталазы у контрольных (1) и колонизированных растений (2)
на 33%, у колонизированных растений — на 20%, что показывает большую устойчивость колонизированных растений к стрессу (рис. 5).
Рис. 5. Влияние параквата на уровень пролина в листьях контрольных (1) и колонизированных растений (2)
Таким образом, нами установлено, что колонизированные метилотрофами растения обладают большей устойчивостью к окислительному стрессу. Активность ферментов-антиоксидантов у колонизированных растений была выше, чем в клетках контрольных растений. Уровень ПОЛ под действием стрессора у колонизированных растений практически не изменялся, в то
время как у контрольных растений повысился в полтора раза, что говорит о значительном повреждении мембран контрольных растений. Содержание перекиси до и после стресса у колонизированных растений было значительно ниже, чем в контроле, что должно существенно снижать повреждение клеток при стрессе.
Колонизированные растения можно использовать в качестве экологически чистого посадочного материала, обладающего повышенной устойчивостью к окислительному стрессу, к которому продемонстрирована устойчивость.
Список литературы
1. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода: учебн. пособие. М.: КДУ, 2007. 140 с.
2. Колупаев Ю.Е. Активные формы кислорода в растениях при действии стрессоров: образование и возможные функции // Вісник Харківського національного аграрного унивеситету. Сер. биологія. 2007. Вип. 3(12). С.6-26.
3. Noctor G, Foyer C.H. Ascorbate and Glutathione: Keeping Active Oxygen under Control // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V.49. P.249-279.
4. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. V.15. P.473-497.
5. Доронина Н.В., Кудинова Л.В., Троценко Ю.А. Methylovorus mays — новый вид аэробных облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями // Микробиология. 2000. Т.69. С.712-716.
6. Uchiyama M., Mihara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissue by thiobarbituric acid test // Analytic. Biochem. 1978. V.86. P.287-297.
7. Bates L., Waldren P.P., Teare J.D. Rapid Determination of Free Proline of Water Stress Studies // Plant Soil. 1973. V.39. P.205-207.
8. Extracellular H2O2 induced by oligogalacturonides is not involved in the inhibition of the auxin-regulated rolB gene expression in tobacco leaf explants / D. Bellincampi [et al.] // Plant Physiology. 2000. V. 122. P. 1379-1385.
9. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Proteins Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V.72. P.248-254.
10. Beauchamp C.O., Fridovich I. Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal Biochem. 1971. V. 44. P. 276-87.
11. Chance B, Maehly A.C. Assays catalase and peroxidase. Methods in Enzymology. N.Y.: Academic Press, 1955. P.764-775.
12. Метод определения активности каталазы /М. А. Королюк [и др.] // Лаб. дело. 1988. №1. С.16-19.
13. Влияние ассоциативных микроорганизмов на устойчивость томатов к фитопатогенам in vitro и in vivo/Н.С. Захарченко [и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2010. Вып.1. С.175-185.
14. Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метилотрофными бактериями /М.А. Каляева [и др.] // Физиология растений. 2001. Т.48, №4. С.596-599.
15. Факультативные и облигатные аэробные метилобактерии синтезируют цитокинины /Е.Г. Иванова [и др.] // Микробиология. 2000. Т.69, №6. С.764-769.
16. Биосинтез веществ с гиббереллиновой активностью аэробными метилотрофными бактериями, ассоциированными с растениями /М.Н. Цибозова [и др.] // Сб. трудов I Международной Интернет-Конференции. Казань, 2011.
17. Up-regulation of the leaf motochondrial and peroxisomal antioxidative systems in response to salt-induced oxidative stress in the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii / V. Mittova [et al.] // Plant. Cell Envir. 2003. V. 26. P. 845-856.
18. Different induction of superoxide dismutase in downy mildew-resistant and -susceptible genotypes of pearl millet /M.P. Babithaa [et al.] // Plant Pathol. 2002. V. 51. P. 480-486.
19. Wu F, Zhang G, Dominy P. Four barley genotypes respond differently to cadmium: lipid peroxidation and activities of antioxidant capacity // Environ. Exp. Bot. 2003. V. 50. P. 67-78.
20. Аверьянов А.А. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Успехи современной биологии. 1991. Т.111. С.722-737.
21. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиологмя растений. 1999. Т.46, №2. С.321-336.
Пиголева Светлана Васильевна ([email protected]), младший научный сотрудник, Филиал УРАН института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина, Ю.А. Овчинникова, Пущино.
Захарченко Наталья Сергеевна ([email protected]), к.б.н., старший научный сотрудник, Филиал УРАН института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина, Ю.А. Овчинникова, Пущино.
Ермошин Александр Анатольевич, аспирант, Уральский Федеральный университет им. Б.Н. Ельцина, Институт естественных наук, Екатеринбург.
Чепурнова Майя Александровна ([email protected]), к.б.н., доцент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Бурьянов Ярослав Иванович ([email protected]), д.б.н., профессор, зав. лабораторией, лаборатория биотехнологии растений, Филиал УРАН института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина, Ю.А. Овчинникова, Пущино.
The positive effect of the colonization of sugar beet methylotrophic bacteria in the system antioxidant protection of
plants
S. V. Pigoleva, N. S. Zakharchenko, A. A. Ermoshin, M. A. Chepurnova,
Ya. I.Buryanov
Abstract. The influence of plant colonization of sugar beet (Beta vulgaris L.) associative bacteria (Methylovorus mays) on the resistance of plants to oxidation stress caused by the herbicide paraquat. Assessed the following indicators of stress — the level of lipid peroxidation (LPO) of membranes, the content of endogenous hydrogen peroxide and free proline, the enzyme activity of superoxide dismutase (SOD), catalase and peroxidase. It is shown that colonized the plants more resistant to oxidation stress than controls. Under the influence of the stressor in the colonized plants increased activity of antioxidant enzymes at the same time the level of LPO unchanged, and the hydrogen peroxide content increased not so much as the control.
Keywords: Beta vulgaris L., associative bacteria, Methylovorus mays, colonization of plants, antioxidant enzymes, oxidation stress, lipid peroxidation, paraquat.
Pigoleva Svetlana ([email protected]), junior research assistant, Branch of Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, Pushchino.
Zakharchenko Natalia ([email protected]), candidate of biological sciences, senior research assistant, Branch of Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, Pushchino.
Ermoshin Alexander, postgraduate student, Yeltsin Ural Federal University, Institute of Natural Science, Ekaterinburg.
Chepurnova Maya ([email protected]), candidate of biological sciences, associate professor, department of biotechnology, Tula State University.
Buryanov Yaroslav ([email protected]), doctor of biological sciences, professor, head of laboratory, plant biotechnology laboratory, Branch of She-myakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, Pushchino.
Поступила 15.09.2011
