CC BY
104
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 3
ДНК-технологии, трансгенез, молекулярное маркирование
УДК 633.111.1:(573.6.086.83+577.21)
АНАЛИЗ ВЕРТИКАЛЬНОГО ПЕРЕНОСА ГЕНОВ ОТ ТРАНСГЕННЫХ К НЕТРАНСГЕННЫМ РАСТЕНИЯМ ПШЕНИЦЫ (Triticum aestivum L.)*
Д.Н. МИРОШНИЧЕНКО1, М.В. ФИЛИППОВ1, С.В. ДОЛГОВ1, 2
При культивировании трансгенной пшеницы существует возможность вертикального переноса генов от генно-модифицированных к обычным сортам вследствие переноса пыыьцы, переопыления и образования семян, гибридных по трансгенам. Использовав в качестве доноров пыльцы трансгенную гомозиготную линию яровой пшеницы сорта Андрос, которая содержит гетероло-гичные последовательности гена bar, придающего устойчивость к гербицидам на основе фосфи-нотрицина, и гена зеленого флуоресцентного белка gfp, мы продемонстрировали вертикальный перенос трансгенов у пшеницы в естественных условиях при удалении нетрансгенных растений того же сорта от генно-модифицированных на расстояние 1, 2 и 3 м. В результате 2-летних исследований показана зависимость частоты переноса трансгенов от направления господствующих ветров и удаления нетрансгенных растений относительно трансгенных. Частота вертикального дрейфа трансгенов в семенах нетрансгенных растений на полевых участках варьировала от 0,000 до 0,797 %. Трансгенный статус гибридных семян был подтвержден устойчивостью к примененному гербициду, флуоресценцией тканей, наличием последовательности трансгенов в геноме растений (данные ПЦР и ПЦР с обратной транскрипцией), а также характерным наследованием трансгенов в следующем семенном поколении. Подобные эксперименты проведены в России впервые.
Ключевые слова: трансгенная пшеница, вертикальный перенос генов, наследование трансгенов, устойчивость к гербициду, флуоресценция тканей.
Keywords: transgenic wheat, crop-to-crop gene flow, transgene segregation, herbicide resistance, GFP fluorescence.
За последнее десятилетие выполнено большое число исследований, посвященных экспрессии различных гетерологичных генов в культурныж сортах у твердой и мягкой пшеницы. Хотя генно-модифицированная (ГМ) пшеница пока не возделывается, внедрение трансгенных сортов в широкую практику мирового сельскохозяйственного производства в ближайшие годы представляется вполне реальным, поскольку с 1996 года в разных регионах мира, включая развитые европейские страны, США, Канаду, Японию, Австралию, а также Китай, Мексику и Россию, проведено более 500 полевых испытаний трансгенных форм пшеницы. В этой связи вопросы дрейфа генов при возделывании генетически модифицированной пшеницы имеют немаловажное значение, тем более что пшеница — главная сельскохозяйственная культура в России.
Одной из проблем при внедрении ГМ культур в широкую сельскохозяйственную практику может быть дрейф генов из генома ГМ растений в геном нетрансгенных растений (вертикальный перенос). Проявления последствий вертикального переноса можно ожидать в регионах с перекрывающимися зонами произрастания и синхронизированными периодами цветения ГМ культур и традиционных сортов, а также в регионах произрастания близкородственных сорных или дикорастущих видов.
Пшеница представляет собой однолетнее самоопыляющееся растение, что значительно уменьшает риск дрейфа трансгенов посредством переноса пыльцы. Среди злаковых культур частота переопыления у мягкой пшеницы самая низкая и в зависимости от сорта составляет 0,5-10,0 % (1), что обусловлено ее биологическими особенностями. По сравнению с пыль-
* Завершающие этапы исследований выполнены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, грант № 16.М04.12.0005.
цой у других злаков у пшеницы пыльцевые зерна достаточно тяжелые, а их количество меньше (2), поэтому приблизительно 90 % пыльцы оседает в радиусе 3 м (3, 4). Однако в отдельных случаях она может переноситься ветром на расстояние до 50-60 м (2, 3). Считается, что жизнеспособность пыльцы у пшеницы достаточно низкая и сохраняется в среднем 20-30 мин (2, 5), хотя у разных сортов она может варьировать от нескольких минут до 2-3 ч (6). Еще одна важная биологическая особенность пшеницы заключается в том, что при цветении колосьев частота раскрытия пыльников колеблется от 61 до 93 % в зависимости от сорта (7).
Вследствие низкой частоты перекрестного опыления в естественных условиях Европейское агентство по окружающей среде (European Environment Agency — EEA) и Европейский научный фонд (European Science Foundation — ESF) рассматривают пшеницу как культуру с очень низким риском вертикального переноса трансгенов в геном дикорастущих родственных видов (8). Несмотря на это, при возделывании пшеницы на полях нельзя исключать вероятность вертикального переноса генов от генно-модифицированных к немодифицированным сортам пшеницы вследствие переноса пыльцы, переопыления и образования гибридных по гетероло-гичным генам зерновок, что может отразиться на чистоте производимого семенного материала и качестве зерна.
Исследования по вертикальному переносу трансгенов с пыльцой у зерновых культур стали проводиться с конца ХХ века. При этом более известны работы по анализу вертикального переноса трансгенов, выполненные на сортах кукурузы (9), сорго (10), риса (11) и ячменя (12). На пшенице в основном анализировали дрейф генов с пыльцой у нетрансгенных сортов (13, 14). В единственной известной публикации, посвященной вертикальному переносу трансгенов у пшеницы (15), авторы ограничиваются информацией об образовании гибридных трансгенных форм Fj при совместном выращивании на делянках нетрансгенных и трансгенных растений с генами bar и gus, однако данные о частоте переноса трансгенов не приводятся, а анализ факторов, влияющих на эффективность переноса, отсутствует из-за недостаточного объема выборки.
Мы изучили изменение частоты вертикального переноса генов от трансгенных к нетрансгенным растениям мягкой пшеницы в зависимости от направления господствующих ветров, удаления нетрансгенных растений относительно трансгенных, а также проанализировали наследование перенесенных трансгенов в следующем семенном поколении.
Методика. Опыты проводили в течение 2 лет (2004 и 2005 годы). Объектами исследований служили нетрансгенные растения яровой пшеницы сорта Андрос и его трансгенные формы, полученные на станции искусственного климата «Биотрон» (Филиал Института биоорганической химии РАН, Московская обл.) посредством баллистической трансформации векторной конструкцией psGFP-BAR с помощью генной пушки (16). В работе использовали гомозиготное семенное потомство Т3. Оно было отобрано в результате размножения первичного трансгенного растения A-20, несущего ген ацетилфосфотрансферазы bar, который содержал интрон гена ubi1 кукурузы и находился под контролем промотора ubi1 кукурузы (17), а также ген зеленого флуоресцентного белка gfp (GFP) с интроном гена act1 риса под действием промотора act1 риса (18). Экспериментальный участок закладывали на территории карантинного питомника Всероссийского НИИ селекции плодовых культур (г. Орел). Удаление от промышленных полей, на которых возделываются коммерческие сорта пшеницы, составляло не менее 10 км.
В оба года испытаний трансгенные семена пшеницы высевали внутри круга диаметром 1 м из расчета 500 шт/м2. Нетрансгенные семена на участке 1-го года исследований (2004 год) высевали в 2 ряда с междурядьем 10 см на расстоянии 1 м от внешнего периметра круга, засеянного трансгенными семенами, на участке 2-го года (2005 год) — на расстоянии 1, 2 и 3 м от внешнего периметра. Первый круг нетрансгенных растений-реципиентов был сплошным, второй и третий круг (2-й год испытаний) закладывали в виде восьми секторальных участков (длиной 1 м), ориентированных по сторонам света. Перед уборкой колосьев первый круг также разделяли на восемь равных секторов в соответствии со сторонами света.
Для анализа растений пшеницы Fx на вертикальный перенос трансгенов семена F1 от нетрансгенных растений высевали в зимних теплицах на стеллажные столы, заполненные смесью верхового торфа и песка (3:1). После достижения всходами высоты 9-11 см проводили 1-кратную обработку посевов в вечернее время 1 % раствором гербицида Баста («Bayer Crop-Science», Германия) согласно рекомендациям производителя. Через 1 нед после обработки выжившие растения выкапывали, пересаживали в отдельные горшки и продолжали выращивание. Активность экспрессии гена gfp оценивали при флуоресцентном исследовании пыльцы растений F1 с помощью светового микроскопа ICM 405 («Opton», Германия) со светофильтрами 450-490 нм (длина волны возбуждения) и 515-530 нм (длина волны экстинкции белка GFP).
Геномную ДНК растений F1, устойчивых к гербициду, экстрагировали согласно описанию (19) с применением 2*СТАВ-буфера, тотальную матричную РНК (мРНК) — в соответствии с приведенной методикой (20). Наличие вставок генов gfp и bar в геноме растений F1 анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР); наличие аналогичных фрагментов в кДНК, синтезированной с мРНК растений F1, — применяя ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Использовали следующие пары праймеров: для гена bar — bar for 5'-TGC ACC ATC GTC AAC CAC TA-3', bar rev 5'-ACA GCG ACC ACG CTC TTG AA-3' (размер ожидаемого фрагмента - 310 п.н.); для гена gfp — sgfp for 5'-GCG ACG TAA ACG GCC ACA AG-3', sgfp rev 5'-CCA GCA GGA CCA TGT GTG ATC G-3' (размер ожидаемого фрагмента — 600 п.н.). Режим амплификации: старт при 95 °С, 5 мин; денатурация при 94 °С, 45 с; элонгация при 72 °С, 45 с; температура отжига — 60 °С, 40 с (30 циклов). Амплификацию проводили на приборе MasterCycler Gradient («Eppendorf», Германия). Продукты амплификации разделяли в электрофорезной камере («Hoeffer», США) в 1,2 % агарозном геле в 0,5*ТАЕ-буфере с добавлением бромистого этидия, применяя маркер М23 («СибЭнзим», Россия).
Наследование трансгенного признака в семенном потомстве оценивали по флуоресценции GFP в молодых зародышах пшеницы в F2 in vitro на 2-е-3-и сут после инициации прорастания.
Статистический анализ результатов проводили с использованием критерия соответствия х2 (21).
Результаты. Схемы размещения трансгенных и нетрансгенных растений на участках приведены на рисунке 1.
На полевых участках 1-го и 2-го года исследований после прорастания семян наблюдали синхронное развитие трансгенных и нетрансгенных растений (кущение, выход в трубку, колошение и цветение). В 1-й год цветение отмечали с 26 июня по 13 июля, во 2-й — с 25 июня по 9 июля.
В период цветения растений пшеницы направление преобладаю-
щих ветров было сходным (западное, северо-западное и северное), однако скорость ветра во 2-й год оказалась ниже, что отразилось на значении суммарного пробега ветра (табл. 1).
В 1-й год исследований число семян Бь собранных с нетрансгенных растений пшеницы на круговом участке, который располагался на расстоянии 1 м от трансгенных, составило 62 221 шт., во 2-й — более 125 тыс. шт. Вследствие того, что климатические условия 2-го года исследований оказались менее благоприятными (год был засушливее), урожай семян нетрансгенных растений снизился по сравнению с тако-этом средняя масса 1000 семян
Рис 1. Схематическое изображение опытного участка по изучению вертикального переноса генов от трансгенных к нетрансгенным растениям пшеницы в 2004 (А) и 2005
(Б) году (карантинный питомник Всероссийского НИИ селекции плодовых культур, г. Орел).
вым в предыдущий год (табл. 2). При уменьшилась на 14 %.
1. Продолжительность цветения (ПЦ) у трансгенных и нетрансгенных растений пшеницы сорта Андрос и климатические характеристики в этот период на полевом участке по годам исследований (600-2100, карантинный питомник Всероссийского НИИ селекции плодовых культур, г. Орел)
ПЦ, сут Cредняя температура воз-дуxа, °C Относительная влажность, % Суммарный пробег ветра, м Доля в направлении господствующих ветров, %
C C-В В Ю-В Ю Ю-3 3 C-3 без ветра
2004 г о д
18 18,1 74,4 3877 18,0 2,3 1,6 4,7 5,5 10,2 25,8 28,1 3,9
2005 г о д
16 18,5 67,3 2959 27,5 4,2 6,3 2,1 2,1 8,4 24,2 17,9 7,4
П р и м СО ГО Ю- Ю, -В, Ю- В, -В, C- C, е. и X а ч е и С-3 — соответственно северный, северо-восточный
восточный, юго-восточный, южный, юго-западный, западный и северо-западный ветер.
2. Распределение семян Fj, содержащих гены bar и gfp, у нетрансгенных растений пшеницы сорта Андрос в зависимости от их расположения относительно трансгенных растений (карантинный питомник Всероссийского НИИ селекции плодовых культур, г. Орел)
Участок Число семян F1, собранный с нетрансгенныx растений пшеницы, шт. Число устойчивый к гербициду проростков F1 (bar+/gfp+), шт. Частота вертикального переноса с пыльцой (gene flow), %
2004 год 2005 год 2004 год 2005 год 2004 год 2005 год
1 м 1 м | 2 м | 3 м 1 м 1 м | 2 м | 3 м 1 м 1 м 2 м | 3 м
С 8468 5539 3902 3056 8 5 0 0 0,094 0,090 0
С-В 8020 6312 5967 4930 49 13 4 1 0,611 0,206 0,067 0,020
В 6660 5604 3382 5839 53 13 1 0 0,796 0,232 0,030 0
Ю-В 7404 5571 5945 5311 59 17 1 0 0,797 0,305 0,017 0
Ю 7980 5161 4398 5565 45 11 1 0 0,564 0,213 0,023 0
Ю-3 9071 6613 4748 7860 24 1 2 0 0,265 0,015 0,042 0
3 8400 6352 4712 3500 18 4 4 0 0,214 0,063 0,085 0
С-3 8446 6617 3837 4398 4 0 0 0 0,047 0 0 0
Всего 62221 47669 36891 40459 259 64 13 1 0,416 0,134 0,035 0,002
П р и м е ч а н и — СО C- и СО со Ю- Ю, -В, Ю- В, -В, C- C, е. описание участков с долей господствующих
ветров (соответственно северный, северо-восточный, западный и северо-западный) см. в таблице 1. восточный, юго-восточный, южный юго-западный,
В 1-й год испытаний после того, как все собранные семена Бх высеяли в зимние теплицы и на 10-е сут обработали всходы гербицидом, произошла гибель более 99,5 % проростков. Однако были также обнаружены
растения, которые не проявляли признаков повреждения, продолжали успешно расти и формировать листья. Доля устойчивые к гербициду растений F1, которые получили из семян нетрансгенныx форм, произраставши на расстоянии 1 м от тран^енные (при общем числе выживши растений 259 шт.), заметно варьировала в зависимости от того, в каком направлении относительно центрального круга наxодились растения-реципиенты (см. табл. 2). На северном и северо-западном участкаx число гибридные семян, давшю начало устойчивым к гербициду растениям, составило 1-2 шт. на 2000 семян, тогда как на восточном и юго-восточном — достигло 8 шт. на 1000 семян.
При тестировании на экспрессию гена GFP синтез этого маркерного белка отмечали у всеx 259 растений F1, выживши после обработки гербицидом (для исследования мы использовали пыльцу, которая не содержит xлорофилл, что облегчает визуализацию). Проведенный ПЦР-ана-лиз ДНК (рис. 2, А) полностью подтвердил присутствие последовательности трансгенов в геноме у всеx проанализированные гибридные растений F1, поскольку во всеx образцаx происxодила амплификация фрагментов ожидаемой длины — 310 п.н. (ген bar) и 600 п.н. (ген gfp). ОТ-ПЦР-анализ экспрессии генов bar и gfp с использованием тотальной растительной РНК (см. рис. 2, Б) также подтвердил наличие вставки трансгенов, с которые успешно транскрибировались мРНК, необxодимые для синтеза ацетил-фосфотрансферазы, обеспечившей устойчивость к гербициду, а также маркерного флуоресцентного белка GFP. Как свидетельствуют наши предыдущие исследования (16), в тран^енные растенияx — донораx пыльцы гены bar и gfp наследуются сцепленно, поскольку оба изначально наxодятся в одной векторной конструкции psGFP-BAR, которая использовалась для получения тран^енные растений линии А-20.
А Б
МРК1 12 34567 8 9К2М МРК1 1 2 3 4 5678К2М
Рис. 2. Типичные электрофореграммы ампликонов, полученных у пшеницы сорта Андрос при анализе тотальной ДНК методом полимеразной цепной реакции (А) и анализе тотальной кДНК методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (Б) на присутствие генов gfp (верхний ряд) и bar (нижний ряд) в геноме устойчивых к гербициду растений Fj, которые были обнаружены при высеве семян от нетрансгенных растений, выращенных на расстоянии 1 м от трансгенных: М — маркер молекулярной массы (1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 п.н.); P — положительный контроль (ДНК плазмиды psGFP-BAR, использовавшейся при получении трансгенной линии); К1 — отрицательный контроль (ДНК нетранс-генного растения пшеницы); K2 — реакционная смесь, не содержащая ДНК; 1-9 — гибридные растения F1 (соответственно 9/2, 1/10, 4/7, 5/15, 4/4, 4/9, 5/12, 4/13 и 17/1); размер ожидаемого фрагмента для гена bar — 310 п.н., для гена gfp — 600 п.н.
Таким образом, в 1-й год молекулярно-биологический анализ показал, что все выжившие при обработке гербицидом растения представляют собой потомство Fx со вставкой генов bar и gfp в геноме, которое получено в полевых условиях на опыгтном участке в результате естественного переопыления трансгенные и нетрансгенных растений пшеницы.
Во 2-й год исследований нетрансгенные растения-реципиенты дополнительно высадили на расстоянии 2 и 3 м от трансгенныж. После обработки всходов семян F1 гербицидом обнаружили 78 выживших проростков без признаков повреждения. Доля выживших растений Fj значительно варьировала в зависимости от удаления анализируемых семенныж участков от растений — доноров пыльцы. Так, у растений-реципиентов, произраставших на расстоянии 3 и 2 м от трансгенных, устойчивую к гербициду форму F1 дали соответственно 1 и 13 семян (см. табл. 2). При удалении на 2 м распределение гибридныж растений F1 варьировало от 0 шт. (северный и северо-восточный участки) до 4 шт. (северо-восточный и западный участки). При удалении на 3 м единственное устойчивое растение F1 было обнаружено на северо-восточном участке. У нетрансгенных растений, размещенных на расстоянии 1 м от трансгенных, устойчивые к гербициду формы F1 получили от 64 семян, при этом частота вертикального переноса изменялась в зависимости от анализируемого участка: на юго-восточном число таких семян составило 3 шт. на 1000, тогда как на северо-западном их не обнаружили (см. табл. 2).
Флуорометрическое исследование пыльцы у всех 78 растений F1 подтвердило сцепленный перенос признаков флуоресценции и устойчивости к гербициду. Результаты выполненного молекулярно-биологического анализа (ПЦР и ОТ-ПЦР) совпали с данными физиологического и биохимического тестирования. ПЦР -анализ показал, что в геноме всех анализируемых гибридныж растений F1 присутствовали последовательности генов gfp и bar, а также наблюдалась их экспрессия на уровне мРНК. Таким образом, отобранные в результате обработки гербицидом растения F1 транс-генны по генам bar и gfp, перенос которыж произошел при переопылении трансгенной пышьцой.
Для подтверждения того, что обнаруженные устойчивые к гербициду формы не являются следствием случайного загрязнения семенами трансгенныж растений-доноров, а действительно образовались в результате переноса пыльцы, мы проанализировали наследование приобретенных генов при дальнейшем семенном размножении. В случае опыления нетрансгенных растений трансгенной пыльцой гомозиготных растений линии А-20 гибридные растения F1 должны представлять собой гетерозиготы по приобретенным генам bar и gfp. При последующем самоопылении таких растений F1 наследование будет соответствовать однолокусному характеру встраивания, поскольку гены bar и gfp имеют регуляторные элементы (промоторы) генов actl и ubil риса и кукурузы, определяющих доминантные признаки. Если же эти растения получены из случайно попавших семян гомозиготныж трансгенныж растений-доноров, то расщепления признаков происходить не должно, а флуоресценция будет наблюдаться во всех растениях-потомках.
Характер наследования экспрессии гена gfp изучили для 14 691 зерновки F2 (табл. 3). Уровень экспрессии gfp у трансгенныж семян варьировал, однако в потомстве у всех 337 гибридныж растений F1 наблюдалось стабильное наследование приобретенного гетерологичного гена. Статистический анализ по %2-критерию соответствия показал, что для большинства растений, полученных как в 1-й, так и во 2-й год, была характерна од-нолокусная модель наследования 3:1 (см. табл. 3), несмотря на колебания реального соотношения числа трансгенныж и нетрансгенныж потомков F2, полученных от индивидуальныж растений Fb от 1:1 до 11:1. Следует отметить, что большинство «необычных» расщеплений наблюдали у растений, сформировавших ограниченное число семян (10-20 шт.). При этом не бышо
3. Результаты анализа наследования экспрессии гена в семенном поколении гибридных растений Бх, полученных в результате вертикального переноса генов от трансгенных к нетрансгенным растениям пшеницы сорта Андрос в зависимости от их расположения относительно трансгенных растений (станция искусственного климата «Биотрон», Филиал Института био-органической химии РАН, г. Пущино)
Год | А | Б |___________В_____________| Г | Д
2004 1 259 9970 239 92,3
2005:
всего 78 4721 68 87,2
в том числе 1 64 3842 57 89,1
2 13 814 10 76,9
3 1 65 1 100
П р и м е ч а н и е. А — расстояние между трансгенными и нетрансгенными растениями, м; Б — число Ьаг+/§/р+ растений Р1, шт.; В — число зародышей Ьат+/%£р+ растений Р1, проанализированных на экспрессию ОРР, шт.; Г — число Ьаг+/^р+ растений Р1, показавших расщепление по %£р 3:1 согласно х2, шт.; Д — доля зародышей, показавших расщепление 3:1, %.
обнаружено растений Fj, наследующих флуоресценцию GFP как гомозиготный признак. То, что все устойчивые к гербициду растения F1 демонстрировали наследование трансгенного признака как гетерозиготного, свидетельствует о факте вертикального переноса генов посредством естественного переопыления трансгенной пыльцой.
а Б Наши исследования по-
казали, что частота вертикального переноса трансгенов bar и gfp на опытных участках в разные годы варьировала, что может быть обусловлено влиянием различных климатических факторов в период активного цветения колосьев пшеницы. Так, для реципиентных растений, расположенных на расстоянии 1 м от донорных, в 2004 и 2005 году она в среднем составила соответственно 0,416 и 0,134 % (см. табл. 3). Скорее всего, наблюдаемое превышение в 1-й год исследований вызвано тем, что во 2-й год продолжительность цветения в целом была короче, в период выброса пыльников наблюдалась более высокая температура воздуха при более низкой влажности, пыльца хуже мигрировала, поскольку отмечалось снижение суммарного пробега ветра (см. табл. 1). На уменьшение частоты переноса также повлияло общее снижение урожайности в 2005 году (на 23 %) вследствие менее благоприятного водного режима (недостаточное количество осадков).
Разделение анализируемого кругового опытного участка на восемь
Рис. 3. Частота вертикального переноса генов bar и gfp (верхний ряд) в зависимости от направления ветра (нижний ряд) при удалении нетрансгенных растений пшеницы сорта Андрос от трансгенных на расстояние 1 м в 2004 (А) и 2005 (Б) году.
В верхнем ряду закрашенная область показывает распределение частоты переноса трансгенов (одно деление — 0,1 %) в зависимости от географического положения нетрансгенных растений относительно центрального кругового участка, засеянного трансгенной пшеницей. В нижнем ряду пунктиром обозначена метеорологическая роза ветров, закрашенная область — роза ветров, обратная метеорологической (карантинный питомник Всероссийского НИИ селекции плодовых культур, г. Орел).
сегментов в соответствии со сторонами света позволило выявить корреляцию между распределением трансгенных гибридных семян и направлением господствующих ветров в период массового цветения пшеницы. Направление преобладающих ветров в оба года исследований было схожим (западное, северо-западное и северное направления) (рис. 3). Большая часть трансгенных гибридных семян Р1 была обнаружена на четырех участках, находящихся по перечисленным направлениям, а также по юго-восточному направлению. В 1-й год на северо-восточном, восточном, юго-западном и южном участках (относительно центрального круга) обнаружили 206 трансгенных гибридных семян (или 81 % от их общего числа), во 2-й — 45 семян (или 84 % от общего числа). В оба года исследований самую высокую частоту переноса регистрировали у растений, находящихся по направлению северо-западного ветра: в 2004 и 2005 году она составила соответственно 0,797 и 0,305 % (или 59 и 17 устойчивых к гербициду растений).
Совершенно иным было распределение гибридных семян на участках круга нетрансгенных растений, находившихся в направлении южного, юго-восточного, восточного и северо-восточного ветров. В сумме доля гибридных семян, образовавшихся в секторах внешнего круга в этих направлениях, равнялась всего 19 % (2004 год) и 16 % (2005 год) от общего числа обнаруженных гибридных семян. В оба года исследований минимальную частоту вертикального переноса трансгенов регистрировали на северо-восточном участке. Эти данные позволяют утверждать, что общее количество переносимой трансгенной пыльцы в зависимости от направления ветра могло различаться в 4-5 раз, что и привело к наблюдаемым колебаниям.
При увеличении расстояния от трансгенных растений — доноров пыльцы до нетрансгенных происходило очевидное снижение вероятности переноса трансгенов с пыльцой. Так, при удалении на 1 м частота переноса в среднем составила 0,134 %, снизившись при 2-кратном увеличении расстояния почти в 4 раза (0,035 %), при 3-кратном — в 66 раз (0,002 %). Эти данные в целом согласуются с результатами исследований, в которых изучалась частота перекрестного опыления у некоторых сортов мягкой и твердой пшеницы в разных условиях (1, 3, 5, 6, 13, 14).
Выводы, изложенные в нашей работе, основаны на интерпретации экспериментальных данных, которые были получены для выяснения того, насколько велика опасность дрейфа трансгенов с пыльцой в естественных условиях. Подобные данные предоставляют возможность проанализировать эффект различных факторов (удаленность растений-реципиентов, направление господствующего ветра, сезонность и климатические характеристики), что необходимо для определения условий, при которых перенос трансгенных признаков с пыльцой будет сведен к некритическому минимуму или полностью предотвращен. Это позволит избежать засорения не-трансгенного зерна трансгенными примесями (и наоборот), а также обеспечит генетическую целостность сортов пшеницы, возделываемых в хозяйствах, где существует вероятность «соприкосновения» обычных и генно-модифицированных сортов.
Итак, в полевых условиях у пшеницы продемонстрирована возможность вертикального переноса трансгенов при возделывании форм, близких по фенологии. Подобные эксперименты проведены в России впервые. Полученные нами данные показывают, что для обеспечения безопасной изоляции трансгенных посевов от нетрансгенных необходим анализ большей выборки, изучение последствий удаления растений на большие расстояния, учет объема переносимой с ветром трансгеной пыльцы в зависимости
от площади выращивания растений и т.д.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. L a w r i e R.G., M a t u s - C a d r i z M.A., H u c l P. Estimating outcrossing rates in spring wheat cultivars using the contact method. Crop Sci., 2006, 4: 247-249.
2. D ’ S o u z a V.L. Investigations concerning the suitability of wheat as a pollen-donor for cross pollination by wind as compared to rye, Triticale and Secalotricum. Zeitschrift fur Pflanzenzuch-tung, 1970, 63: 246-269.
3. K h a n M.N., H e y n e E.G., A r p A.L. Pollen distribution and the seed set on Triticum aestivum L. Crop Sci., 1973, 13: 223-226.
4. V i r m a n i S.S., E d w a r d s I.B. Current status and prospects for breeding hybrid rice and wheat. Adv. Agron., 1983, 36: 145-214.
5. D e V r i e s A.P. Flowering biology of wheat particularly in view of hybrid seed production: a review. Euphytica, 1971, 20: 152-170.
6. H e g d e S.G., W a i n e s J.G. Hybridization and introgression between bread wheat and wild and weedy relatives in North America. Crop Sci., 2004, 44: 1145-1155.
7. R a j k i E. Effect on pollination of the amount of pollen on the surface of the stigma. Nove-nytermeles, 1962, 11: 35-44.
8. E a s t h a m K., S w e e t J. Genetically modified organisms (GMOs): The significance of gene flow through pollen transfer. Environmental Issue (Report № 28), European Environment Agency. Copenhagen, 2002: 75.
9. M a B.L., S u b e d i K.D., R e i d L.M. Extent of cross-fertilization in maize by pollen from neighboring transgenic hybrids. Crop Sci., 2004, 44: 1273-1282.
10. S c h m i d t M., B o t h m a G. Risk assessment for transgenic sorghum in Africa: crop-to-crop gene flow in Sorghum bicolor (L.) Moench. Crop Sci., 2006, 46: 790-798.
11. M e s s e g u e r J., F o g h e r C., G u i d e r d o n i E., M a r f a V., C a t al a M.M., B a l d i G., M e l e E. Field assessments of gene flow from transgenic to culti-
vated rice (Oryza sativa L.) using a herbicide resistance gene as tracer marker. Theor. Appl. Genet., 2001, 103: 1151-1159.
12. R i t a l a A., N u u t i l a A.M., A i k a s a l o R., K a u p p i n e n V., T a m m i s o l a J. Measuring gene flow in the cultivation of transgenic barley. Crop Sci., 2002, 42: 278-285.
13. M a t u s - C a d i z M.A., H u c l P., H o r a k M.J., B l o m q u i s t L.K. Gene flow in wheat at the field scale. Crop Sci., 2004, 44: 718-727.
14. H a n s o n B.D., M a l l o r y - S m i t h C.A., S h a f i i B., T h i l l D.C., Z e m e-t r a R.S. Pollen-mediated gene flow from blue aleurone wheat to other wheat cultivars. Crop Sci., 2005, 45: 1610-1617.
15. G a t f o r d K.T., B a s r i Z., E d l i n g t o n J., L l o y d J., Q u r e s h i J.A., B r e t-
t e l l R., F i n c h e r G.B. Gene flow from transgenic wheat and barley under field condi-
tions. Euphytica, 2006, 151: 383-391.
16. Ф и л и п п о в М.В., М и р о ш н и ч е н к о Д.Н., В е р н и к о в с к а я Д.И., Д о лг о в С.В. Подбор оптимальных параметров баллистической трансформации генома мягкой пшеницы. С.-х. биол., 2006, 1: 67-73.
17. C h r i s t e n s e n A.H., S h a r r o c k R.A., Q u a i l P.H. Maize poly-ubiquitin genes: genes, structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplast by electroporation. Plant Mol. Biol., 1992, 18: 675-689.
18. M c E l r o y D., Z h a n g W., C a o J., W u R. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell, 1990, 2: 163-171.
19. R o g e r s S., B e n d i c h A. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi. In: Plant molecular biology manual /S. Gelvin, R. Schiperoort (eds.). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London, 1995: Section 7-1.
20. G e h r i g H., W i n t e r K., C u s h m a n J., B o r l a n d A., T a y b i T. An improved RNA isolation method for succulent plant species rich in polyphenols and polysaccharides. Plant Mol. Biol. Rep., 2000, 18: 369-376.
21. Л а к и н С.Ф. Биометрия: уч. пос. для биол. вузов. М., 1990.
1Филиал Института биоорганической химии Поступила в редакцию
имени академиков М.М. Шемякина 24 апреля 2011 года
и Ю.А. Овчинникова РАН,
142290 Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 6;
2Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии,
127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, e-mail: [email protected]
ANALYSIS OF VERTICAL GENE TRANSFER FROM TRANSGENIC TO NONTRANSGENIC PLANTS OF WHEAT (Triticum aestivum L.)
D.N. Miroshnichenko1, M.V. Filippov1, S.V. Dolgov1> 2
S u m m a r y
During cultivation of transgenic wheat a vertical gene transfer is possible from genetically modified to usual varieties as a result of pollen transfer, subbing and formation of seeds, hybridous on transgenes. In field trials the authors demonstrated the vertical transfer of transgenes in spring wheat with moving away nontransgenic plants of the Andros variety at a distance of 1, 2 and 3 m from genetically modified plants of the same variety. The transgenic homozygous line used as a pollen donor contains the heterologous sequences of bar gene and gfp gene which encode resistance to herbicides and green fluorescent protein, respectively. In two-years study it was shown that the frequency of transgenes transfer depends on prevailing wind direction and remoteness of nontransgenic plants from transgenic ones. In the field investigations the frequency of vertical flow of transgenes to seeds of nontransgenic plants varied from 0.000 to 0.797 %. The transgenic status of hybridous seeds was confirmed by the resistance to used herbicide, the tissue fluorescence, the presence of transgene sequence in plant genome (the data of PCR and RT-PCR) and also by the specific inheritance of transgenes in the next seed generation. Such experiments were carried out for the first time in Russia.
Научные собрания МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «ХРОМОСОМА 2012»
(г. Новосибирск, 2-7 сентября 2012 года)
Организаторы конференции: Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения РАН (ИМКБ СО РАН), Новосибирское отделение Межрегиональной общественной организации «Вавиловское общество генетиков и селекционеров» (НО ВОГиС), Общество с ограниченной ответственностью «Технологии Биосистем» (ООО «ТБ»)
Конференция «Хромосома 2009», прошедшая в Новосибирском научном центре, по мнению участников, выполнила цель возрождения научных семинаров, идейным вдохновителем и организатором которых была Ллександра Алексеевна Прокофьева-Бельговская. Собранием участников было принято решение о проведении аналогичных научных форумов на регулярной основе.
Планируемые секции:
■ Организация генома, пространственная организация ядра и хромосом
■ Специализированные районы хромосом
■ Хромосомы митохондрий
■ Хромосомы и эволюция
■ Хромосомы человека. Хромосомы при патологиях
■ Хромосомы в клеточных делениях
■ Молекулярно-генетические механизмы инактивации Х-хромосомы у млекопитающих
■ Политенные хромосомы
Контакты и информация: http://chromosome2012.mcb.nsc.ru
IV МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
(г. Пущино, 14-19 октября 2012 года)
Организаторы: Российская академия наук, Научный Совет по математической биологии и биоинформатике, Институт математических проблем биологии Российской академии наук
Конференция посвящена 40-летию Института математических проблем биологии РАН.
Основные научные направления:
■ Высокопроизводительные вычисления в моделировании биологических систем
■ Математическое моделирование структуры и динамики биополимеров
■ Математическое моделирование нанобиоэлектронных систем
■ Математическое моделирование генных и метаболических сетей
■ Математические модели обработки информации в структурах мозга
■ Модели эволюции и развития в биологии
■ Математическое моделирование в иммунологии и эпидемиологии
■ Популяционное моделирование и вычислительная экология
■ Математическая биофизика
■ Математические методы обработки и анализа биологических данных
■ Биоинформатика
Контакты и информация: [email protected]
