CC BY
16© Коллектив авторов, 2022 https://doi.org/10.29296/24999490-2022-02-05
ПЕПТИД AED АКТИВИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ И СИНТЕЗ БЕЛКОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РЕПЛИКАТИВНОМ СТАРЕНИИ
Е.О. Гутоп1, Н.С. Линькова1-3, Н.В. Фридман1, Е.О. Кожевникова1, В.О. Полякова1, 4, В.Х. Хавинсон1, 5
'Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Российская Федерация, '97110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3; 2Академия постдипломного образования ФГБУ ФНКЦ ФМБА России, Российская Федерация, '2537', Москва, Волоколамское шоссе, д. 9'; 3Белгородский государственный национальный исследовательский университет, Российская Федерация, 308009, Белгород, ул. Победы, д. 85, корп. '2; 4Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, Российская Федерация. '94'00, Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2;
5Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Российская Федерация, '99034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Гутоп Екатерина Олеговна — кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории биогеронтологии отдела биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии. Тел.: +7(916) 254-99-82. E-mail: mgutop@mail. ru ORCID: 0000-0002-1038-7785
Линькова Наталья Сергеевна — доктор биологических наук, доцент, заведующая лабораторией молекулярных механизмов старения Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии; профессор кафедры терапии, гериатрии и антивозрастной медицины Академии постдипломного образования ФГБУ ФНКЦ ФМБА России, ведущий научный сотрудник лаборатории проблем старения Белгородского государственного национального исследовательского университета. Тел.: +7 (921) 311-42-10. E-mail: miayy@yandex.ru ORCID: 0000-0001-5156-5421
Фридман Наталья Владимировна — кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов старения, Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии. Тел.: +7(921) 918-18-27. E-mail: natfri@mail. ru ORCID: 0000-0001-8929-6829.
Кожевникова Екатерина Олеговна — кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биогеронтологии отдела биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии. Тел.: +7 (905) 225-54-48. E-mail: katena_94@list.ru ORCID: 0000-0002-9835-694X
Полякова Виктория Олеговна — профессор РАН, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией иммунологии старения Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии; заведующая центром молекулярной медицины Санкт-Петербургского государственного педиатрического медицинского университета. Тел.: +7 (812) 230-00-49. E-mail: vopol@yandex.ru ORCID: 0000-0001-8682-9909
Хавинсон Владимир Хацкелевич — член-корреспондент РАН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, директор Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии; руководитель группы пептидной регуляции старения Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Тел.: +7 (812) 230-00-49. E-mail: khavinson@gerontology.ru ORCID:0000-0001-7547-7725
Старение фибробластов кожи обусловлено генетическими особенностями и воздействием факторов внешней среды. Одним из физиологических аспектов старения кожи является снижение регенеративной способности фибробластов дермы, в том числе их способности к дифференцировке.
Цель работы — изучить влияние пептида AED на дифференцировку фибробластов кожи человека при старении in vitro. Исследование проведено на клетках линии DF-1 (дермальные фибробласты человека [мезенхимные стволовые клетки]), выделенные из кожи век 37-летнего донора женского пола).
Методы. Для достижения репликативного старения клетки культивировали 25 пассажей. Влияние пептида AED на экспрессию генов и синтез белков ранней (Engrailed 1, PDGFRa) и поздней (Spry4, Twist2) дифференцировки фибробластов оценивали методами полимеразной цепной реакции и иммуноцитохимии.
Результаты. Экспрессия генов ENGRAILED1, PDGFRA, SPRY4, TWIST2 в «старых» фибробластах дермы была снижена соответственно в 1,7; 1,6; 1,5; 4,5раза по сравнению с «молодыми» клетками кожи. Добавление пептида AED повышало экспрессию генов ENGRAILED1, PDGFRA, SPRY4, TWIST2 в «старых» фибробластах кожи соответственно в 1,9; 2,1; 2,3; 3,4 раза. Экспрессия белков Engrailed 1, PDGFRa, Spry4, Twist2 в «старых» фибробластах кожи была снижена соответственно в 1,9; 2,3; 5,1; 4,3раза по сравнению с «молодыми» клетками кожи. Добавление пептида AED увеличивало синтез белков Engrailed 1, PDGFRa, Spry4, Twist2 в «старых» фибробластах соответственно в 3,3; 2,0; 2,5; 3,9раза.
Заключение. Таким образом, пептид AED повышает функциональную активность фибробластов кожи при старении путем повышения экспрессии генов и синтеза белков дифференцировки дермальных фибробластов. Этот геропротекторный эффект пептида AED может способствовать ускорению регенерации кожи, стимуляции хемотаксиса и митоза фибробластов, синтезу в них коллагена, активации ремоделирования внеклеточного матрикса.
Ключевые слова: дермальные фибробласты человека, пептид AED, дифференцировка, экспрессия генов, репликативное старение
AED PEPTIDE ACTIVATES GENE EXPRESSION AND DIFFERENTIATION PROTEINS SYNTHESIS
OF HUMAN SKIN FIBROBLASTS DURING REPLICATIVE AGING E.O. Gutop1, N.S. Linkova1-3, N.V. Fridman1, E.O. Kozhevnikova1, V.O. Polyakova1'4, V.Kh. Khavinson1'5
1Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, Dynamo pr., 3, Saint Petersburg, 197110, Russian Federation;
2Academy of postgraduate education underFSBU FSCC of FMBA of Russia, Volokolamskaya r., 91, Moscow, 125371, Russian Federation;
3Belgorod National Research University, Pobedy str., 85, Belgorod, 308009, Russian Federation;
4Saint Petersburg State Pediatric Medical University, Litovskaya str, 2, Saint Petersburg, 194100, Russian Federation;
5Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences, Makarova emb., 6, Saint Petersburg, 199034, Russian Federation
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Gutop Ekaterina Olegovna — MD, PhD, the scientific researcher of the Laboratory of Biogerontology of the Department of Biogerontology, Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Tel.: +7 (916) 254-99-82. E-mail: mgutop@mail.ru ORCID: 0000-00021038-7785
Linkova Natalia Sergeevna — doctor of biological sciences, docent, the head of the laboratory of molecular mechanisms of aging of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology; professor of the Department of therapy, geriatrics and antiaging medicine of Academy of postgraduate education under FSBU FSCC of FMBA of Russia, senior researcher of the Laboratory "Problem of Aging", Belgorod National Research University. Tel.: +7 (921) 311-42-10. E-mail: miayy@yandex.ru ORCID: 0000-0001-51565421
Fridman Natalia Vladimirovna — MD, PhD, scientific research of the laboratory of molecular mechanisms of aging, Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Tel.: +7(921) 918-18-27. E-mail: natfri@mail.ru ORCID: 0000-0001-8929-6829.
Kozhevnikova Ekaterina Olegovna — PhD, the scientific researcher of the Laboratory of Biogerontology of the Department of Biogerontology, Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology. Tel.: +7(905) 225-54-48. E-mail: katena_94@list.ru ORCID: 0000-0002-9835-694X
Polyakova Victoria Olegovna — professor of Russian Academy of Science, doctor of biological sciences, professor, the head of the laboratory of immunology of aging of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology; the head of the center of molecular medicine of Saint Petersburg State Pediatric Medical University. Tel.: +7(812) 230-00-49. E-mail: vopol@yandex.ru ORCID: 0000-00018682-9909
Khavinson Vladimir Khatskelevich — corresponding member of Russian Academy of Science, honored worker of science of Russian Federation, doctor of medical sciences, professor, the head of Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology; the head of the group of peptide regulation of aging of Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences. Tel.: +7 (812) 230-00-49. E-mail: khavinson@gerontology.ru ORCID: 0000-0001-7547-7725
Skin fibroblasts aging is caused by genetic features and the environmental factors influence. One of the physiological aspects of skin aging is a decrease of regenerative capacity of dermis fibroblasts, including their ability to differentiate.
The aim of this work is to study the effect of the AED peptide on fibroblast differentiation of human skin when aging in vitro.
Methods. The study was conducted on DF-1 cell line (human dermal fibroblasts (mesenchymalstem cells)) isolated from the skin of the eyelids of a 37-year-old female donor). Cells were cultured till 25 passages for achieving the replicative aging. The effects of the AED peptide on gene expression and protein synthesis of early (Engrailed 1, PDGFRa) and late (Spry4, Twist2) fibroblast differentiation were assessed by polymerase chain reaction and immunocytochemistry.
Results. The expression of the ENGRAILED1, PDGFRA, SPRY4, TWIST2 genes decreased by 1,7; 1.6; 1.5; 4.5 times respectively with aging of dermal fibroblasts. The addition of the AED peptide increased the expression of the ENGRAILED1, PDGFRA, SPRY4, TWIST2 genes in «old» skin fibroblasts by 1,9; 2,1; 2,3; 3,4 times, respectively. Expression of Engrailed 1, PDGFRa, Spry4, Twist2 proteins in fibroblasts decreased by 1,9; 2,3; 5,1; 4,3 times respectively with aging. The AED peptide increased the synthesis of Engrailed 1, PDGFRa, Spry4, Twist2 proteins in «old» fibroblasts by 3.3; 2.0; 2.5; 3.9 times respectively.
Conclusion. Thus, the AED peptide increases the functional activity of skin fibroblasts during aging by increasing gene expression and synthesizing differentiation proteins in dermal fibroblast. This geroprotective effect of the AED peptide can accelerate the skin regeneration, stimulate chemotaxis and mitosis of fibroblasts, the synthesis of collagen in them, and activate the remodeling of the extracellular matrix.
Key words: human dermal fibroblasts, AED peptide, differentiation, gene expression, replicative aging
ВВЕДЕНИЕ
Старение кожи представляет собой сложный биологический процесс, включающий в себя генетические, эпигенетические факторы и влияние окружающей среды [1]. Снижение функций фибробластов дермы во многом обуславливает физиологические механизмы старения кожи. Это связано с тем, что фибробласты представляют собой самую многочисленную субпопуляцию клеток кожи. Фи-бробласты синтезируют основные компоненты дермальной матрицы: коллаген, эластин, гликоза-мингликаны [2]. Старение фибробластов кожи обусловлено снижением их способности к дифферен-цировке. Основными факторами ранней и поздней дифференцировки фибробластов кожи являются белки Engrailed 1, PDGFRa, Spry4, Twist2. Экспрессия гена ранней дифференцировки ENGRAILED-1 в дермальных фибробластах повышается при образовании раны. Активация этого гена является одним из механизмов репарации кожи [3, 4]. Фактор роста тромбоцитов (PDGF) и его рецептор (PDGFR) регулируют раннюю дифференцировку и пролиферацию фибробластов в различных тканях, в том числе в дерме. PDGF и PDGFR способствуют пролиферации, выживанию и миграции клеток мезенхимального происхождения. Установлено, что PDGF стимулирует хемотаксис и митоз, активирует синтез коллагена и ремоделирование внеклеточного матрикса фибробластами кожи [5]. Белок Spry4 экспрессируется в эмбриональных тканях, дерме и является супрессором опухолей. Spry4 ингибирует сигнальный путь митоген-активируе-мой протеинкиназы MAPK. Дезактивация каскада MAPK — один из ключевых механизмов регуляции дифференцировки и пролиферации фибробластов [6]. Установлено, что необходимым условием диф-ференцировки мезенхимальных стволовых клеток в фибробласты является активация синтеза Fgf2, стимулирующего синтез белков Spry4, Twist2 и ин-гибирующего сигнальный путь Erk1/2 [7, 8]. Белки Twist представляют собой высококонсервативные факторы транскрипции, регуляторы эмбриогенеза. Twist2 участвует в дифференцировке различных клеточных линий, в частности, дермальных фибробластов [7]. Twist2 активирует экспрессию генов, кодирующих цитокины и белки внеклеточного ма-трикса, регулирующие поздние этапы дифференцировки фибробластов кожи [9].
В регуляции экспрессии генов и синтеза белков дифференцировки клеток важную роль играют полипептидные комплексы и ультракороткие пептиды длинной 2-7 аминокислотных остатков [10, 11]. Установлено, что полипептидный комплекс хрящей в совместном применении с ультракороткими пептидами на 38% повышает толщину дермы и на 15% увеличивает толщину эпидермиса у женщин пожилого возраста [12]. В составе полипептидного комплекса хрящей был идентифицирован трипептид AED. Пептид AED обладает теми же биологическими эффектами,
что и полипептидный комплекс хрящей, и регулирует метаболизм соединительной ткани [13]. Пептид AED снижает апоптоз, стимулирует пролиферацию, повышает функциональную активность фибробла-стов кожи, нормализует гомеостаз внеклеточного матрикса, обладает антиоксидантными и геропро-текторными свойствами [14, 15, 16]. Пептид AED модулирует экспрессию геронтогенов при старении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга эмбриона человека [17]. Известно, что направление дифференцировки клеток зависит от структуры и концентрации пептидов. Пептиды могут взаимодействовать с ДНК и гистонами, изменяя доступность генов для транскрипции, регулируют метилирование генов [18].
Цель работы — изучить влияние пептида AED на дифференцировку фибробластов кожи человека при старении in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на клетках линии DF-1 (дермальные фибробласты человека (мезен-химные стволовые клетки), выделенные из кожи век 37-летнего донора женского пола) из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки линии DF-1 характеризуются экспрессией на мембране поверхностных антигенов, характерных для мезенхимных стволовых клеток: CD44, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC. Данная линия клеток при определенных условиях способна к направленной дифферен-цировке и имеет ограниченный срок жизни. Фаза активного репликативного старения фибробластов линии DF-1 наступает на 25-м пассаже, что соответствует примерно 50 удвоениям популяции клеток. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% L-глютамина, 1,5% Hepes-буфера, раствора пенициллина и стрептомицина. При достижении клетками 80% монослоя их пассеровали с помощью смеси 0,25% трипсина и 0,2% версена в соотношении 1:3. Концентрация клеток при пассеровании составила 50 тыс. клеток на 1 мл среды. Клетки на 6-м («молодые» культуры) и 25-м («старые» культуры) пассажах разделяли на 3 группы:
• 1-я — контроль;
• 2-я — добавление контрольного пептида GGG, 400 нг/мл;
• 3-я — добавление исследуемого пептида AED, 400 нг/мл. Фибробласты культивировали с пептидами в течение 24 ч.
После прохождения 25 пассажей жизнеспособность и пролиферативный потенциал дермальных фибробластов снижался, что было подтверждено результатами MTS-теста. Снижение жизнеспособности клеток отражает их репликативное старение [19].
При исследовании экспрессии генов полную РНК выделяли из фибробластов 3-го и 22-го пассажей с использованием фиксатора для стабили-
зации РНК RNeasy Mini Kit (Qiagen LLC, США). Выделение РНК осуществляли, используя набор RNeasy MiniKit (Qiagen LLC, США) по протоколу, указанному производителем. Первую нить кДНК синтезировали с использованием Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc, США), используя 100 нг РНК на 20 мкл реакционной смеси. Полученную кДНК использовали непосредственно как матрицу для количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) из расчета 1 мкл на 24 мкл реакционной смеси. Конструирование олигонуклеотидных праймеров осуществляли с помощью онлайн-сервиса NCBI Primer-Blast. Использовали пары праймеров, один из которых соответствовал участкам двух соседних экзонов. Экспрессию генов определяли методом ПЦР с регистрацией в режиме реального времени. Количественную ПЦР в присутствии интеркалиру-ющего флуоресцентного красителя SYBR Green I проводили с помощью набора QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen LLC, США) и термоцикле-ра CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad Laboratories, США). Статистическую обработку результатов осуществляли в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения CFX Manager Software. В качестве внутреннего стандарта использовали мРНК GAPDH. Ее концентрацию во всех образцах принимали за единицу.
Для исследования синтеза белков было произведено иммуноцитохимическое окрашивание культур. Для проведения пермеабилизации использовали 0,1% Тритон X-100 («Биолот»), растворенный в фосфатно-солевом буфере. Культуры клеток инкубировали в 1% фосфатно-солевом буфере (pH 7,5) в течение 30 мин для блокировки неспецифического связывания. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 мин. В работе использовали первичные мо-ноклональные антитела к Engrailed 1 (1:250, Abcam, США), PDGFRa (1:100, Abcam, США), Spry4 (1:100, Abcam, США), Twist2 (1:100, Abcam, США). Ядра кле-
ток докрашивали Hoechst 33258 (Sigma), в результате чего они флюоресцировали темно-синим. Красная флуоресценция характеризовала экспрессию исследуемых маркеров (инкубация со вторичными антителами, конъюгированными с флюорохромом Alexa Fluor 647 (1:1000, Abcam), в течение 30 мин при комнатной температуре, в темноте. Исследование проводили на конфокальном микроскопе LSM 710 (Zeiss GmbH, Германия). Полученные изображения анализировали с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health, США). В каждом случае анализировали 5 полей зрения при ><200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади иммуно-окрашенных клеток к общей площади клеток в поле зрения и выражали в %.
Статистическая обработка данных включала подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе Statistica 6.0. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро—Уилка. Для проверки статистической однородности нескольких выборок использовали критерий Крускала—Уоллиса. Для попарного сравнения групп применяли t-критерий Стьюдента. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0.01.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При репликативном старении дермальных фибробластов наблюдалось снижение экспрессии генов ENGRAILED 1, PDGFRA, SPRY4, TWIST2 соответственно в 1,7; 1,6; 1,5; 4,5 раза (табл. 1). Добавление пептида AED в 1,5 раза повышало экспрессию гена ранней дифференцировки фибробластов ENGRAILED1 и в 1,3 раза увеличивало экспрессию гена поздней дифференцировки фибробластов SPRY4 в «молодых» клетках. Контрольный пептид GGG снижал экспрессию гена ранней дифференцировки фибробластов PDGFRA в «молодых» фибробластах кожи в 1,9 раза по сравнению с контролем.
Таблица 1
Влияние пептида AED на экспрессию генов дифференцировки дермальных фибробластов при репликативном старении
Table 1
The influence of AED peptide on dermal fibroblasts differentiation genes expression during replicative aging
Ген Экспрессия мРНК, усл. ед.
«молодые» культуры «старые» культуры
контроль пептид GGG пептид AED контроль пептид GGG пептид AED
ENGRAILED1 1,15+0,17 1,01+0,09 1,79+0,22* 0,67±0,09* 0,70±0,05 1,24+0,11**
PDGFRA 2,09+0,19 1,12+0,15* 1,88+0,24 1,29+0,18* 0,97+0,17 2,67+0,31**
SPRY4 1,33+0,17 1,40+0,20 1,78+0,10* 0,87+0,11* 0,71+0,13 1,98+0,17**
TWIST2 2,56+0,23 2,11+0,24 2,35+0,16 0,57+0,04* 0,70+0,11 1,94+0,16**
Примечание. * — p<0,01 по сравнению с контролем в «молодых» культурах; ** — p<0,01 по сравнению с контролем в «старых» культурах. Note. * — p<0.01 in comparison with the control in «young» cultures; ** — p<0.01 in comparison with the control in «old» cultures.
В «старых» культурах добавление пептида AED увеличивало экспрессию генов ENGRAILED1, PDGFRA, SPRY4, TWIST2 соответственно в 1,9; 2,1; 2,3; 3,4 раза по сравнению с этими показателями в контроле (табл. 1). После добавления пептида AED к фибробластам кожи, находящимся в состоянии ре-пликативного старения, экспрессия генов дифферен-цировки была сопоставима со значениями, характерными для «молодых» клеток. Контрольный пептид GGG не влиял на экспрессию генов дифференци-ровки дермальных фибробластов при репликативном старении.
Далее было исследовано влияние пептида AED на синтез белков дифференцировки дермальных фибро-бластов при старении in vitro. Установлено, что при ре-пликативном старении происходит уменьшение площади экспрессии белков Engrailed 1, PDGFRa, Spry4, Twist2 в дермальных фибробластах соответственно в 1,9; 2,3; 5,1; 4,3 раза (табл. 2). Пептид AED повышал экспрессию белков Engrailed 1 и Twist2 в «молодых» фибробластах кожи соответственно в 1,7 и 1,3 раза. При добавлении пептида AED в «молодые» культуры фибробластов дермы площадь экспрессии белков PDGFRa и Spry4 достоверно не изменялась. Контрольный пептид GGG не влиял экспрессию белков дифференцировки в «молодых» и «старых» культурах. Пептид AED повышал площадь экспрессии белков дифференцировки дермальных фибробластов в «старых» культуры фибробластов. Под действием пептида AED экспрессия белка Engrailed 1 увеличилась в 3,3 раза, белка PDGFRa — в 2,0 раза, Spry4 — в 2,5 раза, белка Twist2 — в 3,9 раза по сравнению с этими показателями в контрольных «старых» культурах (табл. 2, см. рисунок).
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время молекулярно-клеточный механизм действия большинства ультракоротких пептидов, регулирующих функции клеток кожи, не достаточно изучен. Пептиды имеют маленький размер,
благодаря чему могут проникать через роговой слой кожи. Эти вещества участвуют в естественных метаболических реакциях дермальных фибробластов, что указывает на перспективность их исследований в геронтологии и дерматологии [20]. Одним из пептидов, регулирующих функции клеток кожи при старении, является AED.
Пептид AED повышает экспрессию генов (ENGRAILED1, PDGFRA, SPRY4, TWIST2) и синтез белков дифференцировки (Engrailed 1, PDGFRa, Spry4, Twist2) в «молодых» и «старых» фибробластах кожи человека. Следует отметить, что под действием пептида AED уровень экспрессии генов и синтеза белков дифференцировки в «старых» дермальных фибробластах достигает значений, характерных для «молодых» клеток. При этом в «старых» культурах эффект пептида AED более выражен, чем в «молодых» фибробластах. Эти данные указывают на геропротек-торное действие трипептида и согласуются с результатами ранее проведенных исследований [14, 15].
Ранее было установлено, что пептид AED стимулирует синтез гистоновых деацетилаз Sirt-1, Sirt-6 в фибробластах кожи человека при репликативном старении [15]. Методами физикохимии и молекулярного моделирования выявлено, что ультракороткие пептиды могут комплементарно связываться с определенными последовательностями двунитевой ДНК. Это связывание в промоторной области генов приводит к регуляции их экспрессии и синтеза соответствующих белков [21]. Предполагается, что пептид AED может комплементарно связываться с последовательностью ДНК CGGG в промоторе гена SIRT1 5'cggg tcacgtgatggggtttaaatctcccgcagccggagccgcgggggcgccagtgcc gc 3' (Eukaryotic Promoter Database). Sirt-1 регулирует функции фактора транскрипции SOX2, который участвует в активации и репрограммировании плюри-потентных стволовых клеток через сигнальный путь miR-34a-SIRT1-p53. Sirt-6 участвует в репрограмми-ровании фибробластов кожи через регуляцию активности miR-766. Это способствует активации генов
Таблица 2
Влияние пептида AED на синтез белков дифференцировки дермальных фибробластов при репликативном старении
Table 2
The influence of AED peptide on dermal fibroblasts differentiation protein sythesis during replicative aging
Белок Площадь экспрессии, %
«молодые» культуры «старые» культуры
контроль пептид GGG пептид AED контроль пептид GGG пептид AED
Engrailed 1 0,78+0,12 0,70+0,10 1,34+0,11* 0,42±0,05* 0,35±0,05 1,40+0,17**
PDGFRa 1,22+0,20 0,96+0,13 1,19+0,15 0,52+0,06* 0,60+0,07 1,03+0,11**
Spry4 1,79+0,18 1,90+0,21 1,76+0,16 0,35+0,04* 0,41+0,05 0,83+0,07**
Twist2 1,90+0,23 1,73+0,16 2,50+0,21* 0,44+0,04* 0,55+0,13 1,72+0,19**
Примечание. * — p<0,01 по сравнению с контролем в «молодых» культурах; ** — p<0,01 по сравнению с контролем в «старых» культурах Note. * — p<0.01 in comparison with the control in «young» cultures; ** — p<0.01 in comparison with the control in «old» cultures
a (a) ff б (b) 1 в (c) * A ¡¡¡l/> 13
о f _ LIM» |im ■ # 100tun K> T -P' ф. * Ф # I0W pnv
Экспрессия Twist2 в цитоплазме фибробластов кожи при репликативном старении. Иммунофлуоресцентная микроскопия, х200. Экспрессия Twist2 — красная флуоресценция, Alexa Fluor 567. Ядра докрашены Hoechst 33258, синяя флуоресценция. А — контроль, «молодая» культура; Б — контроль «старая» культура»; В — пептид AED, «старая» культура»
Twist2 expression in the cytoplasm of skin fibroblasts during replicative aging. Immunofluorescent microscopy, x200. Twist2 expression — red fluorescence, Alexa Fluor 567. Nucleus marked by Hoechst 33258, blue fluorescence. А — control, «young» culture; B — control «old» culture; C — AED peptide, «old» culture
дифференцировки дермальных фибробластов Sox2, Oct4, Nanog путем ацетилирования гистона H3 по лизину в 56-м положении [22]. Влияние пептида AED на дифференцировку фибробластов кожи может достигаться через регуляцию экспрессии генов и синтеза белков семейства сиртуинов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, пептид AED повышает функциональную активность фибробластов кожи при старении путем увеличения экспрессии генов и синтеза белков дифференцировки дермальных фибробластов.
Этот геропротекторный эффект пептида AED может способствовать ускорению регенерации кожи, стимуляции хемотаксиса и митоза фибробластов, синтезу в них коллагена, активации ремоделирования внеклеточного матрикса.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Zouboulis C.C., Ganceviciene R., Liakou A.I., Theodoridis A., Elewa R., Makranto-naki E. Aesthetic aspects of skin aging, prevention, and local treatment. Clin. Dermatol. 2019; 37 (4): 365-72. https://doi. org/10.1016/j.clindermatol.2019.04.002,
2. Woodley D.T. Distinct Fibroblasts in the Papillary and Reticular Dermis: Implications for Wound Healing. Dermatologie clinics. 2017; 35 (1): 95-100. https://doi. org/10.1016/j.det.2016.07.004.
3. Mascharak S., des Jardins-Park H.E., Davitt M.F., Griffin M., Borrelli M.R., Moore A.L., Chen K., Duoto B., Chinta M., Foster D.S., Shen A.H., Januszyk M., Kwon S.H., Wernig
G., Wan D.C., Lorenz H.P., Gurtner G.C., Longaker M.T. Preventing Engrailed-1 activation in fibroblasts yields wound regeneration without scarring. Science. 2021; 372 (6540): eaba2374. https://doi.org/10.1126/ science.aba2374.
4. Rinkevich Y., Walmsley G.G., Hu M.S., Maan Z.N., Newman A.M., Drukker M., Januszyk M., Krampitz G.W., Gurtner G.C., Lorenz
H.P., Weissman I.L., Longaker M.T. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science.
2015; 348 (6232): aaa2151. https://doi. org/10.1126/science.aaa2151.
5. Marques L.F., Stessuk T., Camargo I.C., Sabeh Junior N., dos Santos L., Ribeiro-Paes J.T. Platelet-rich plasma (PRP): methodological aspects and clinical applications. Platelets. 2015; 26 (2): 101-13. https://doi.or g/10.3109/09537104.2014.881991.
6. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г., Зеленин Н.В., Аюшинова Н.И. Воздействие на митогенактивируемые протеинкиназы как новое направление регуляции роста соединительной ткани. Бюллетень сибирской медицины. 2017; 16 (4): 86-93. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2017-4-86-93
[Shurygina I.A., Shurygin M.G., Zelenin N.V., Ayushinova N.I. Influence on mitogen-ac-tivated protein kinases as a new direction of connective tissue growth regulation. Bulletin of Siberian Medicine. 2017; 16 (4): 86-93. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2017-4-86-93 (In Russian)].
7. Lee M.S., Lowe G., Flanagan S., Kuchler K., Glackin C.A. Human Dermo-1 has attributes similar to Twist in early bone development. Bone. 2000; 27: 591-602. https://doi.
org/10.1016/s8756-3282(00)00380-x.
8. Lai W.T., Krishnappa V., Phinney D.G. Fibroblast growth factor 2 (Fgf2) inhibits differentiation of mesenchymal stem cells by inducing Twist2 and Spry4, blocking extracellular regulated kinase activation, and altering Fgf receptor expression levels. Stem Cells. 2011; 29 (7): 1102-11. https:// doi.org/10.1002/stem.661.
9. Crespo N.E., Torres-Bracero A., Renta J.Y., Desnick R.J., Cadilla C.L. Expression profiling identifies twist2 target genes in setleis syndrome patient fibroblast and lympho-blast cells. Int. J. Environ Res. Public Health. 2021; 18 (4): 1997. https://doi.org/10.3390/ ijerph18041997.
10. Hoffknecht B.C., Worm D.J., Bobersky S., Prochnow P., Bandow J.E., Metzler-Nolte N. Influence of the Multivalency of Ultrashort Arg-Trp-Based Antimicrobial Peptides (AMP) on Their Antibacterial Activity Chem. Med. Chem. 2015; 10 (9): 1564-9. doi: 10.1002/cmdc.201500220.
11. Ni M., Tresset G., Iliescu C., Hauser C.A.E. Ultrashort Peptide Theranostic Nanoparticles by Microfluidic-Assisted Rapid Solvent Exchange. IEEE Trans Nanobioscience. 2020;
19 (4): 627-32. https://doi.org/10.1109/ TNB.2020.3007103.
12. Фридман Н.В., Линькова Н.С., Бойко Л.В., Кахели М.А. Влияние пептидных биорегуляторов на структурно-функциональные особенности кожи лица женщин пожилого возраста. Молекулярная медицина. 2021; 4: 42-6. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-04-07.
[Fridman N.V., Linkova N.S., Bojko L.V., Kacheli M.A. The influence of peptide bioregulators on the structural and functional specific of face skin in elderly women. Moleculyarnaya meditcina. 2021; 4: 42-6. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-04-07 (In Russian)].
13. Журкович И.К., Ковров Н.Г., Рыжак Г.А., Миронова Е.С., Хавинсон В.Х. Идентификация коротких пептидов в составе полипептидных комплексов, выделенных из органов животных. Успехи современной биологии. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi.org/10.31857/ S004213242002012X
[Zhurkovich I.K., Kovrov N.G., Ryzhak G.A., Mironova E.S., Khavinson V.Kh. Identification of Short Peptides as Part of Polypeptide Complexes Isolated from Animal Organs. Biology Bulletin Reviews. 2020; 140 (2): 140-8. https://doi.org/10.31857/ S004213242002012X (In Russian)].
14. Линькова Н.С., Дробинцева А.О., Орлова О.А., Кузнецова Е.П., Полякова В.О., Кветной И.М., Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция функций фибробластов кожи при их старении in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2016; 161 (1): 40-4. https://doi.org/10.1007/ s10517-016-3370-x.
[Linkova N.S., Drobintseva A.O., Orlova
O.A., Kuznetsova E.P., Polyakova V.O., Kvetnoy I.M., Khavinson V.Kh. Peptide Regulation of Skin Fibroblast Functions during Their Aging In Vitro. Bull. Exp. Biol. Med. 2016; 161 (1): 40-4. https://doi.org/10.1007/ s10517-016-3370-x (In Russian)].
15. Фридман Н.В., Линькова Н.С., Кожевникова Е.О., Гутоп Е.О., Хавинсон В.Х. Сравнительное влияние пептидов KE и AED на функциональную активность фибробластов кожи человека при их репликативном старении. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2020; 3: 197-201. https://doi.org/10.1007/s10517-020-05022-1.
[Fridman N.V., Linkova N.S., Kozhevnikova E.O., Gutop E.O., Khavinson V.K. Comparison of the Effects of KE and AED Peptides on Functional Activity of Human Skin Fibro-blasts during Their Replicative Aging. Bull. Exp. Biol. Med. 2020; 3: 197-201. https:// doi.org/10.1007/s10517-020-05022-1 (In Russian)].
16. Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Дятлова А.С., Гутоп Е.О., Орлова О.А. Короткие пептиды: регуляция функций кожи при старении. Успехи геронтологии. 2020; 33 (1): 46-54.
[Khavinson V.K., Linkova N.S., Diatlova A.S., Gutop E.O., Orlova O.A. (2020) Short peptides: regulation of skin function during aging. Adv. Gerontol. 2020; 33 (1): 46-54 (In Russian)].
17. Ashapkin V., Khavinson V., Shilovsky G., Linkova N., Vanuyshin B. Gene expression in human mesenchymal stem cell aging cultures: modulation by short peptides. Molecular Biology Reports. 2020; 47: 4323-9. https://doi.org/10.1007/s11033-020-05506-3.
18. Khavinson V., Linkova N., Diatlova A., Trofi-
mova S. Peptide Regulation of Cell Differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 2020; 16: 118-25. https://doi.org/10.1007/ s12015-019-09938-8.
19. Хохлов А.Н., Клебанов А.А., Кармушаков А.Ф., Шиловский Г.А., Насонов
М.М., Моргунова Г.В. Тестирование геропротекторов в экспериментах на клеточных культурах: выбор оптимальной модельной системы. Вестник Московского университета. Серия 16: биология. 2014; 1: 13-8. [Khokhlov A.N., Klebanov A.A., Karmusha-kov A.F., Shulovsky G.A., Nasonov M.M., Morgunova G.V. Testing of anti-aging drugs in experiments on cell cultures: choosing the correct model system. Vestnik of Moscow University. Series 16: biology. 2014; 1: 13-8 (In Russian)].
20. Орасмяэ-Медер Т., Эрнандес Е. Пептидные технологии в косметике: тенденции и перспективы. Косметика & медицина. 2010; 2: 46-53. [Orasmaje-Meder T., Ernandes E. Peptide technology in cosmetics: tendency and perspectives. Cosmetics and medicine. 2010; 2: 46-53 (In Russian)].
21. Kolchina N., Khavinson V., Linkova N., Yaki-mov A., Baitin D., Afanasyeva A., Petukhov M. Systematic search for structural motifs of peptide binding to double-stranded DNA. Nucleic Acids Research. 2019; 47 (20): 10553-63. https://doi.org/10.1093/nar/ gkz850.
22. Hsu Y.C., Wu Y.T., Tsai C.L., Wei Y.H. Current understanding and future perspectives of the roles of sirtuins in the reprogramming and differentiation of pluripotent stem cells. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2018; 243 (6): 563-75. https://doi. org/10.1177/1535370218759636.
Для цитирования: Гутоп Е.О., Линькова Н.С., Фридман Н.В., Кожевникова Е.О., Полякова В.О., Хавинсон В.Х. Пептид AED активирует экспрессию генов и синтез белков дифференцировки фибробластов кожи человека при репликативном старении. Молекулярная медицина. 2022; 20 (2): 32-38. hffps://doi. org/10.29296/24999490-2022-02-05
Поступила 21 декабря 2021 г.
For citation: Gutop E.O., Linkova N.S., Fridman N.V., Kozhevnikova E.O., Polyakova V.O., Khavinson V.Kh. AED peptide activates gene expression and differentiation proteins synthesis of human skin fibroblasts during replicative aging. Molekulyarnaya meditsina. 2022; 20 (2): 32-38 (in Russian). https://doi.org/10.29296/2499949Ch2022-02-05
