49->niä лабораторные животныЕ V
zuio для научных исследований
https://doi.org/10.29296/2618723X-2018-03-05
Патоморфологическая диагностика легких при различных методах эвтаназии лабораторных животных
Е.В. Беляева1, научный сотрудник, А.В. Рыбакова1, старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, Я.А. Гущин1, научный сотрудник, Д.С. Ваганова1, научный сотрудник, К.Е.Коптяева1, научный сотрудник, А.А. Мужикян1, старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, М.Н. Макарова1, доктор медицинских наук, В.Г. Макаров2, доктор медицинских наук, профессор ''Научно-производственное объединение «Дом Фармации», 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, 3, к. 245; 2Санкт-Петербургский институт фармации, 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, к. 245
Е-тэИ: belyaeva.ev@doclinika.ru
Резюме. Известно, что углекислый газ и анестетики, применяемые для эвтаназии лабораторных животных, могут приводить к появлению артефактов, наличие которых приводит к противоречивым результатам при патоморфологической диагностике. Особенно часто выбранный метод эвтаназии влияет на структуру органов дыхательной системы, главным образом на легкие.
Цель данного исследования - выявление патоморфологических изменений в органах дыхания, связанных с использованием наиболее распространенных способов эвтаназии. Исследование проводили на самцах и самках крыс, мышей, хорьков и кроликов. Для всех видов животных использовали различные дозы и концентрации углекислого газа, а также ветеринарные препараты Ветофол и комбинацию Золетил и Ксила при внутривенном и внутрибрюшинном путях введения. После констатации смерти животных извлекали легкие с последующей фиксацией их в 10% формалине, вырезкой, стандартной гистологической проводкой, изготовлением срезов и окраской гематоксилин-эозином. При любом методе эвтаназии были обнаружены макроскопические и гистологические признаки отека, ателектаза и эмфиземы легких, участки геморрагий, которые в разной степени выраженности встречались у всех исследованных животных. На степень проявления обнаруженных изменений большое влияние оказывал способ введения препаратов. Наименее выраженные патологические изменения в органах дыхательной системы были выявлены при внутривенном введении комбинации препаратов Золетил и Ксила, в то время как при внутрибрюшинном введении тех же препаратов изменения были максимальными. Полученные результаты позволяют предложить практические рекомендации по методике выбора способа эвтаназии и дозировке препаратов при выполнении патоморфологической диагностики органов дыхания лабораторных животных при проведении доклинических исследований.
Ключевые слова: эвтаназия, анестетики, лабораторные животные, патоморфологические изменения, легкие.
Для цитирования: Беляева Е.В., Рыбакова А.В., Гущин Я.А., Ваганова Д.С., Коптяева К.Е., Мужикян А.А., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Патоморфологическая диагностика легких при различных методах эвтаназии лабораторных животных. Лабораторные животные для научных исследований. 2018; 3. https://doi.org/10/29926/2618723X-2018-03-05
лабораторные животныЕ V
zuio для научных исследований №3
Pathomorphological diagnostics of lungs at various methods of euthanasia
of laboratory animals
E. Belyaeva1, A. Rybakova1, Ya. Guschin1, D. Vaganova1, K. Koptyaeva1, A. Muzhikyan1, M. Makarova1, V. Makarov2
1JSC «Research-and-manufacturing company «Houm оf Pharmacy», 188663, Russia, Leningradskiy region, Vsevolozhskiy district, Kuzmolovskiy, st. Zavodskaya, 3, b. 245; 2CJSC «St. Petersburg Pharmaceutical Institute», 188663, Russia, Leningradskiy region, Vsevolozhskiy
district, Kuzmolovskiy, b. 245 Е-mail: belyaeva.ev@doclinika.ru
Summary. It is known that carbon dioxide and anesthetics used for euthanasia laboratory animals can lead to the appearance of artifacts, the presence of which makes pathomorphological diagnosis difficult. The purpose of this study was to identify pathomorphological changes in the respiratory organs associated with the using of the most common methods of euthanasia. The study was performed on male and female rats, mice, ferrets and rabbits. In all animal species, various doses and concentrations of carbon dioxide, Vetofol, and combinations of Zoletil and Xyla were used in the intravenous and intraperitoneal route of administra-tion.After confirming the death of the animal, extraction of the lung was carried out, followed by fixation in 10% formalin, histological extraction, standard histological wiring, sectioning and staining with haematoxy-lin and eosin. Within the use of each method of euthanasia were found macroscopic and histological signs of edema, atelectasis and emphysema of the lungs, foci of hemorrhages, which were found in different degrees of severity in all of the studied animals. The degree of manifestation of the detected changes was greatly influenced by the way the drugs were administered.Less prominent pathological changes in the respiratory organs were identified by intravenous administration of a combination of drugs Zoletil and Xyla, while the intraperitoneal administration of the same drugs changes reached maximum severity.The obtained results give an opportunity to offer practical advice on the choice of the method of euthanasia and dosage drugs during the pathomorphological diagnostics respiratory organs of laboratory animals as part of the pre-clinical studies.
Key words: euthanasia, anesthetics, laboratory animals, pathomorphological changes, lungs.
For citation: Belyaeva E., Rybakova A., Guschin Ya., Vaganova D., Koptyaeva K., Muzhikyan A., Makarova M., Makarov V. Pathomorphological diagnostics of lungs at various methods of euthanasia of laboratory animals. Laboratory Animals for Science. 2018; 3. https://doi.org/10.29296/2618723X-2018-03-05
Введение
Патоморфологическое исследование органов дыхания широко используется при определении токсичности лекарственных препаратов на стадии доклинических исследований [5, 27]. Проведению патологоанатомического и гистологического исследований предшествует эвтаназия животных. Эвтаназия (от греческого eu - хорошо, thanatos - смерть) - это процесс безболезненного умерщвления животного [1, 8]. В последнее время во всем мире уделяется большое внимание гуманности проведения тех или иных манипуляций с животными. Особое значение имеет метод эвтаназии, используемый для лабораторного животного. Выбор метода эвтаназии должен соответствовать гуманным принципам, а также позволять провести объективную оценку влияния исследуемого препарата на организм лабораторного животного [8]. С точки зрения этических принципов следует выбрать надежный, легко выполнимый и необратимый метод эвтаназии, т.е. такой, ко-
2018
№3
Информация об использованных препаратах
Таблица 1
Наименование Производитель Действующие вещества
Золетил (Zoletil) Virbac Sante Animale, Франция 250 мг тилетамина гидрохлорида и 250 мг золазе-пама гидрохлорида. Вспомогательные вещества -натрия сульфат и лактоза
Ксила (Xyla) Interchemiewerken, Голландия Ксила в качестве действующего вещества в 1 мл содержит 20 мг ксилазина гидрохлорида, а также вспомогательные вещества: натрия метабисуль-фит - 1 мг, кислоту лимонную - 10 мг, спирт бензи-ловый - 0,01 мл, натрия гидроокись (для коррекции рН = 5,0) и воду для инъекций - до 1мл
Ветофол (Vetofol) Norbrook Laboratories Limited, Великобритания Пропофол - 10 мг и вспомогательные вещества: лецитин (липоид Е-80) - 12 мг, глицерин - 22,5 мг, соевое масло - 100 мг, натрия гидроксид (в количестве, необходимом для коррекции рН до 6,0-8,5) и воду для инъекций - до 1 мл
торый гарантирует быструю потерю сознания, а в дальнейшем приводит к остановке сердца, дыхания и окончательной потери функции мозга [1-3, 6, 8, 24].
Существуют 3 группы методов эвтаназии: агенты, оказывающие прямое угнетение функциональных нейронов; агенты, вызывающие стойкую гипоксию; агенты, вызывающие разрушение структур головного мозга [1, 6, 8]. Любой из них приводит к различным изменениям в клетках, тканях и органах, а также влияет на весь организм в целом. Это следует учитывать при дальнейшей патоморфологи-ческой диагностике, так как изменения, возникшие в результате эвтаназии, могут быть ошибочно приняты за результат действия исследуемого препарата на организм животного.
Цель данной работы - апробация известных методов эвтаназии лабораторных животных с точки зрения влияния их на патологоанатомическую и гистологическую картину легких.
Материал и методы
Исследование проводилось на самцах и самках аутбредных крыс (п=20), мышей (п=40), новозеландских кроликов (п=10) и хорьков (п=10), взятых из питомника НПО «Дом Фармации»». Масса крыс составляла 250-300 г, мышей - 20-30 г, кроликов -3,6-4,2 кг, хорьков - 2,5-3 кг.
Животные содержались в стандартных условиях вивария, потребляли полнорационный гранулированный комбикорм, доступ к воде был не ограничен. Эвтаназия осуществлялась в рамках проводимых в Организации исследований, в соответствии с планами исследований. Отдельно с целью выполнения данной работы животные не эвтаназировались.
Для проведения исследования применялись ветеринарные препараты, зарегистрированные на территории Российской Федерации и разрешенные для использования в ветеринарии (табл. 1), а также углекислый газ (СО2).
Таблица 2
Дозы препаратов, использованные для эвтаназии разных видов животных
Вид животных Препарат/способ введения/дозы, мг/кг
Золетил/Ксила Ветофол СО2
внутривенно внутрибрюшинно внутривенно ингаляционно
объем камеры, л скорость потока, л/мин
Крысы 60/15 300/57 60 32 20
Мыши 50/15 300/57 60 16 18
Хорьки 33/13 - 15 -
Кролики 33/13 - 15 -
Дозы препаратов для эвтаназии разных видов животных (табл. 2) были выбраны на основании данных литературы [15-17, 20, 21, 26].
После эвтаназии и наступления смерти животных осуществляли патологоана-томическое исследование и эвисцерацию органов дыхательной системы (трахея и легкие) с последующей фиксацией материала в 10% растворе нейтрального забуфе-ренного формалина в течение 24 ч.
Для дальнейшего гистологического исследования по общепринятой методике отобранный материал подвергался вырезке, стандартной проводке, заливке в парафин. Затем изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином [4]. На этапе вырезки производили отбор материала от
U TT и
каждой доли легких у крыс, хорьков и кроликов. У мышей легкие помещались в кассету целиком [14]. Анализ гистологических препаратов выполняли при помощи светооптического микроскопа Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия) при увеличении 50, 100, 200 и 400. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры AxioCam ICc 1 и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.8 (Германия).
Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 (SoftStat, США), где рассчитывались медиана и квартальный размах, поскольку данные не соответствовали нормальному закону распределения.
Результаты и обсуждение
У всех исследованных животных выявлены патологические изменения в ткани легких, связанные с эвтаназией (табл. 3).
При применении углекислого газа с заданной скоростью потока визуально отмечались отек легких и мелкоточечные геморрагии (рис. 1-4). При гистологическом исследовании также было подтверждено наличие отека легких с неравномерными участками ателектазов и кровоизлияний. При этом у крыс изменения были выражены сильнее, чем у мышей, и проявлялись в виде дистелектазов, причем вместе с участками спадения альвеол присутствовали расширенные участки (см. рис. 2-4).
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ^^
2018 для научных исследований
Таблица 3
Патоморфологические изменения, наблюдаемые при эвтаназии (Ме [Ц1; Ц3])
Способ введения Вид Обнаруженные изменения, оценка в баллах (0-5)
Передозировка Доза животного геморрагии отек ателектаз эмфизема
СО2 Объем камеры 32 л, скорость потока 20 л/мин Ингаляционно Крыса 2 [1; 3] 2 [1; 3] 1 [1; 2] 1 [1; 2]
Объем камеры 16 л, скорость потока 18 л/мин Ингаляционно Мышь 1 [0; 2] 1 [0; 2] 1 [1; 2] 0 [0; 1]
Анестетиком 60 + 15 в/в Крыса 0 [0; 1] 0 [0; 1] 1 [0; 2] 0 [0; 1]
Золетил+Ксила, мг/кг 300 + 57 в/б Крыса 1 [0; 1] 0 [0; 1] 2 [1; 3] 2[0; 3]
50 + 15 в/в Мышь 1 [0; 2] 2 [1; 3] 2 [1; 3] 0 [0; 1]
300 + 57 в/б Мышь 2 [1; 3] 0 [0; 1] 0 [0; 1] 3 [2; 4]
33 + 13 в/в Кролик 0 [0; 1] 1 [0; 2] 1 [1; 2] 1 [0; 2]
33 + 13 в/в Хорек 1 [0; 2] 0 [0; 1] 1 [0; 1] 0 [0; 1]
Анестетиком 60 в/в Крыса 0 [0; 1] 0 [0; 1] 2 [1; 3] 3 [2; 4]
Ветофол, мг/кг 60 в/в Мышь 2 [1; 3] 0 [0; 1] 1 [1; 2] 2 [1; 3]
15 в/в Кролик 1 [0; 2] 0 [0; 1] 2 [1; 3] 1 [0; 2]
15 в/в Хорек 0 [0; 1] 0 [0; 1] 2 [1; 3] 1 [0; 2]
Примечание. Данные получены в ходе исследования: Ме - медиана; Ц1 - нижний квартиль; Ц3 - верхний квартиль.
а
ГЩ|Ш1 в
Рис. 1. Эвисцериро-ванные легкие крысы, эвтаназированной с применением С02. Отек, стрелками указаны точечные геморрагии в ткани органа
|11п|1ш|1
Рис. 3. Эвисцериро-ванные легкие крысы, эвтаназированной с применением С02. Отек, точечные геморрагии в ткани органа
Ш-: - - i
Рис. 2. Легкие крысы, эв-таназированной с применением С02. Отмечаются умеренный отек и геморрагическое пропитывание ткани легких с участками ателектазов. Окр. гематоксилином-эозином. х100
Рис. 4. Легкие мыши, эвта-назированной с применением С02. Отмечаются слабо выраженный отек и незначительное геморрагическое пропитывание ткани легких. Окр. гематоксилином-эозином. х100
2018
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ для научных исследований
№3
Рис. 5. Эвисцериро-ванные легкие крысы, эвтаназированной с применением Золетил + Ксила (в/в, 60 + 15 мг/кг). Макроскопически видимые изменения отсутствуют
ШЛ
уУ' ¡s V ■■ 5
Рис. 6. Легкие крысы, эв-таназированной с применением Золетил + Ксила (в/в, 60 + 15 мг/кг). Ткань легких без выраженных изменений. Окр. гематоксилином-эозином. х100
И УД . 5ч ?•» г';:'ч V >
Vr'- Jr.wr % >
• I
a
Рис. 7. Эвисцериро-ванные легкие мыши, эвтаназированной с применением Золетил + Ксила (в/в, 60 + 15 мг/кг). В правой доле легких стрелками отмечены геморрагии неправильной формы, различной величины
Рис. 8. Легкие мыши, эвта-назированной с применением Золетил + Ксила (в/в, 60 + 15 мг/кг). Геморрагическое пропитывание и отек с участками спадения легочной ткани. Окр. гематоксилином-эозином. х100
а
Рис. 9. Эвисцериро-ванные легкие кролика, эвтаназиро-ванного с применением Золетил + Ксила (в/в, 33 + 13 мг/кг). Макроскопически видимые изменения отсутствуют
б
Я М.
г,"
«ЖЙ С * У i* It»
ж 4 тк^
Рис. 10. Легкие кролика, эвтаназированного с применением Золетил + Ксила (в/в, 33 + 13 мг/кг). Отмечается чередование участков спадения и эмфизематозного расширения легочной ткани. Окр. гематоксилином-эозином. х100
; ч с ■ < л ■ • ' •
■ ----- Tii|"i¥Ijili |м ji i|iii|iiii|hii|iiig|
a
Рис. 11. Эвисцериро-ванные легкие хорька, эвтаназиро-ванного с применением Золетил + Ксила (в/в, 33 + 13 мг/кг). Стрелками отмечены единичные геморрагии
й-
яг
'i-ii
гЩ
я/яШ
, 'Л
ш §
* ' lis**' ;
•; л. о v •
cr—■<>„
yt
«v £
IW
A', -fay
if Тч*' i 4 ' ?
t 4 * »
tr- vг.t-.xs.-v ...?■■ м--*- is.: Л Л-. ". Л* '"Г- '' li /
■РЯО V Же.
. т" ^ v ; ivv.ib --ь,
't
¿ж
г
Рис. 12. Легкие хорька, эв-таназированного с применением Золетил + Ксила (в/в, 33 + 13 мг/кг). Ткань легких без выраженных изменений. Окр. гематоксилином-эозином. х100
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ для научных исследований
№3
Рис. 13. Эвисцериро-ванные легкие крысы, эвтаназиро-ванной с применением Золетил + Ксила (в/б, 300 + 57 мг/кг). Стрелкой отмечены мелкие единичные кровоизлияния. В соседней доле отмечаются признаки эмфиземы
¿'-Jb У.
""V ч-V-га/ЛЗи . г
Ч Ci -Vv.* ' < w
Рис. 14. Легкие крысы, эвтаназированной с применением Золетил + Ксила (в/б, 300 + 57 мг/кг). Отмечаются незначительные геморрагии, а также чередование участков спадения и эмфизематозного расширения легочной ткани. Окр. ге-матоксилином-эози-ном. х100
в
Рис. 15. Эвисцериро-ванные легкие мыши, эвтаназирован-ной с применением Золетил + Ксила (в/б, 300 + 57 мг/кг). Стрелками отмечены геморрагии неправильной формы, различной величины. Во всех долях отмечаются умеренно выраженные признаки эмфиземы
ЧШьь
„ N&t;45 v rJvO»
Рис. 16. Легкие мыши, эвтаназированной с применением Золетил + Ксила (в/б, 300 + 57 мг/кг). Отмечаются полнокровие сосудов и очаги эмфизематозного расширения легочной ткани. Окр. ге-матоксилином-эози-ном. х100
Рис. 17. Эвисцериро-ванные легкие крысы, эвтаназирован-ной с применением Ветофола (в/в, 60 мг/кг. Макроскопически видимые изменения отсутствуют
' г
V К. / ■ —у*.-.
ys
У-Тй?
»
f.
I ■ ^C
у
^ijF jt
'4
Рис. 18. Легкие крысы, эвтаназированной с применением Ветофола (в/в, 60 мг/кг). Отмечаются очаги эмфизематозного расширения альвеолярной ткани. Окр. гематоксилином-эозином. х100
в
Рис. 19. Эвисцериро-ванные легкие мыши, эвтаназирован-ной с применением Ветофола (в/в, 60 мг/кг). Стрелками отмечены геморрагии различной формы и величины
Рис. 20. Легкие мыши, эвтаназированной с применением Ве-тофола (в/в, 60 мг/кг). Отмечаются умеренные геморрагии, а также чередование участков спадения и эмфизематозного расширения легочной ткани. Окр. гематоксилином-эозином. х100
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ для научных исследований
№3
а
jiiiiiiiiiiiiiiii
Рис. 21. Эвисцериро-ванные легкие кролика, эвтаназиро-ванного с применением Ветофола (в/в, 15 мг/кг). В правой доле легкого стрелкой отмечены геморрагии различной формы и величины
кшШ ж
8*4
б
wyj
few YJ
- V i'..* -J ■
Рис. 22. Легкие кролика, эвтаназирован-ного с применением Ветофола (в/в, 15 мг/кг). Отмечаются незначительные геморрагии, а также чередование участков спадения и эмфизематозного расширения легочной ткани. Окр. гематоксилином-эозином. х100
=1 ■
в
Рис.23.Эвисцериро-ванные легкие хорька, эвтаназирован-ного с применением Ветофола (в/в, 15 мг/кг. Макроскопически видимые изменения отсутствуют
Г?
# «f \• ,
&
>1
■*■ -,., V'W
A,
■ J >
\
v V *
Г JoM?
- . V '
г
Mv .
'■.»Л:
Рис. 24. Легкие хорька, эвтаназированного с применением Ве-тофола (в/в, 15 мг/кг). Ткань легких без выраженных изменений. Отмечается чередование участков спадения и незначительного эмфизематозного расширения легочной ткани. Окр. гематоксилином-эозином. х100
Внутривенное (в/в) введение препаратов Золетил и Ксила вызывало незначительные изменения в легких животных, за исключением таковых у мышей (рис. 5-8). Отек легких был не выражен и отмечался только у кроликов, так же как и эмфизема (рис. 9-10). Единичные геморрагии наблюдались у хорьков. У всех животных наблюдались небольшие участки спадения легочной ткани (рис. 11-12). У мышей патологические изменения были умеренно выражены и носили диффузный характер.
При внутрибрюшинном (в/б) введении препаратов картина передозировки была выражена ярче, чем при внутривенном пути введения. У крыс присутствовали мелкие кровоизлияния и очаговые ателектазы, чередующиеся с очагами расширения альвеолярной ткани (рис. 13-14). В то же время у мышей вместо ателектазов микроскопически определялись обширные участки эмфизематозно расширенных альвеол с разрывами межальвеолярных перегородок и множественные кровоизлияния, при этом макроскопически эмфизема была умеренно выражена (рис. 15-16).
Ветофол при внутривенном введении не вызывал отек легких. Макроскопически у крыс и хорьков изменения отсутствовали, у мышей и кроликов отмечались геморрагии различной величины (рис. 17-24). При микроскопическом исследовании отмечались участки расширения альвеолярной ткани и очаговые дистелектазы, которые у мышей и кроликов сопровождались кровоизлияниями в ткани легких (см. рис. 18, 20, 22, 24).
Согласно полученным данным и результатам исследований многих авторов, метод эвтаназии оказывает значительное влияние на структуру легких [1]. Так, в ряде исследований при использовании CO2 в различных концентрациях для эвтаназии крыс и мышей при патоморфологическом исследовании отмечались кровоизлияния в ткани легких и отек легких (Dannemanetal, 1997); кровоизлияния, отек легких и эмфизема (Iwarsson&Rehbinder, 1993). J.K. Fawell et al. (1972) обнаружили отек периваскулярной соединительной ткани в легких крыс [10, 11, 13]. Существующие результаты исследований зависимости концентрации CO2 и степени выраженности изменений отличаются. Так, Britt (1986) в своих исследованиях выявил выраженные кровоизлияния в ткани легких при более высоких концентрациях CO2. В свою очередь, Danneman (1997) обнаружил, что степень кровоизлияний и отека легких отрицательно коррелирует с концентрацией вдыхаемого CO2, однако это может быть результатом увеличенного времени экспозиции, в результате чего животные подвергаются воздействию газа в течение длительного времени [9-11, 18].
В других исследованиях выявлено, что при медленной эвтаназии в ткани легких определялся сильно выраженный отек, при этом альвеолы находились в состоянии выраженного ателектаза, а в межальвеолярных перегородках встречались микрокровоизлияния. В случае быстрой эвтаназии с высокой концентрацией CO2 массивного ателектаза легких не наблюдается, однако присутствуют дисте-лектаз, т.е. чередование участков ателектазов, и эмфизематозное расширение альвеол с разрывом межальвеолярных перегородок. Также присутствует интерстици-альный отек легких с обширными кровоизлияниями [1, 25].
При использовании CO2 для эвтаназии у мышей отмечаются назальное и легочное кровотечения, развитие и распространенность которых не зависят от возраста, пола и физиологического состояния животного. При этом легочное кровотечение не ограничивается одной легочной долей, а наблюдается во всех долях. Назальное кровотечение всегда ограничивается просветом полости носа, при этом на слизистой оболочке носовой полости отсутствуют повреждения и кровоизлияния. Это наблюдение может указывать на то, что легочное кровотечение развивается раньше, чем назальное, а кровь выходит из легкого в носовую полость. Указанные наблюдения опровергают тот факт, что раздражение и повреждение слизистой оболочки носа от высоких концентраций CO2 приводят к назальному кровотечению. Кроме того, при гистологическом исследовании в очагах назального и легочного кровотечения отсутствует воспалительная инфильтрация. Таким образом, развитие геморрагических поражений в легких наиболее вероятно связано с использованием газа, однако сам механизм его развития неясен [18].
У мышей, которых эвтаназировали CO2 с предварительным использованием изофлурана, не обнаруживали патологических изменений в легких [23].
Результаты наших исследований с использованием углекислого газа согласуются с приведенными данным литературы [1, 10, 11, 13, 25]. При макроскопическом исследовании отмечали отек легких и участки геморрагий, более выраженные у крыс. При гистологической диагностике у крыс и мышей подтверждали
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ^^
2018 для научных исследований
диагнозы, установленные при визуальном осмотре исследованных органов, а также обнаруживали участки ателектаза и эмфиземы, однако эмфизема не сопровождалась разрывом межальвеолярных перегородок. В других органах дыхательной системы не было выявлено патологических изменений, связанных с методом эвтаназии.
Наиболее гуманным методом эвтаназии для лабораторных животных является передозировка средствами для наркоза. Для этого вводится анестезирующее средство в дозе, которая превышает в 3 раза дозу, обеспечивающую общий наркоз. В случае введения летальной дозы животное засыпает, далее отмечается остановка сердца и дыхания. Несмотря на то, что при данном виде эвтаназии животное погибает быстро, анестетик может вызвать эффекты, которые сохраняются в тканях после прекращения циркуляции крови, тем самым влияя на патоморфологиче-скую картину тканей и органов [19].
В литературе нет данных о патоморфологических изменениях при применении препаратов Золетил и (или) Ксила для эвтаназии лабораторных животных. Однако исследователями отмечено, что при использовании сочетания Ксилазина и Кетамина у крыс выявляется макроскопически выраженный серозный плеврит, сопровождаемый гидротораксом, а также отек легких с серо-красными геморра-гиями. Гистологическим исследованием при этом выявляются альвеолярные и пе-риваскулярные отеки, иногда локализованные только в области ворот органа [7].
Для эвтаназии животных мы применяли комбинацию препаратов Золетил и Ксила, которую вводили внутривенно и внутрибрюшинно. Макроскопически не обнаруживали признаков серозного плеврита и гидроторакса, как отмечалось в литературных источниках, однако были выявлены отек легких и геморрагии у мышей и хорьков при внутривенном введении препаратов. При гистологическом исследовании самые яркие изменения в легких были выявлены у мышей (отек и участки ателектаза), у кроликов - слабовыраженные признаки отека, ателектаза и эмфиземы легких. Наиболее выраженные изменения в легких отмечались при внутрибрю-шинном введении комбинации препаратов Золетил и Ксила крысам и мышам. При этом признаки эмфиземы легких и участки геморрагий встречались у мышей, в то время как у крыс геморрагии были менее выраженные, а наряду с эмфиземой выявлялись участки ателектаза. В других органах дыхательной системы, как и при использовании СО2, патологические изменения отсутствовали.
Значительные изменения в легких обнаруживаются при изучении влияния препарата Ветофол на организм кроликов. Так, при макроскопической оценке органа отмечается его увеличение, кровоизлияния и отек, который сопровождается скоплением розоватой пенистой жидкости в верхних дыхательных путях, а также в просвете трахеи и бронхов. При дальнейшем гистологическом исследовании выявляется интерстициальная пневмония и отек. Альвеолы при этом заполнены альвеолярными макрофагами, а альвеолярный эпителий находится в состоянии гиперплазии [22]. Результаты гистологических исследований влияния препарата Ветофол на структуру легких крыс показывают наличие дилатации дыхательных путей [12].
Полученные нами результаты действия препарата Ветофол на органы дыхательной системы не согласуются с данными литературы. При использовании препарата Ветофол для эвтаназии внутривенно у кроликов отмечались участки ателектаза, эмфиземы и геморрагии. Макроскопические и гистологические признаки отека и интерстициальной пневмонии отсутствовали, гиперплазия альвеолярного эпителия в наших исследованиях не подтвердилась. У крыс и хорьков отмечали ателектаз и эмфизему легких, последняя была более выражена у крыс, дилатация дыхательных путей не обнаружена. У мышей наблюдались наиболее выраженные геморрагии в ткани легких, а так же, как и у других исследуемых животных, -участки ателектаза и эмфиземы.
Заключение
Согласно полученным данным, при использовании любого исследованного нами метода эвтаназии будут отмечаться патологические изменения в органах дыхания, главным образом в легких. Большое влияние на появление этих изменений также оказывает способ введения препаратов. Самые выраженные изменения в легких отмечались при внутрибрюшинном введении комбинации препаратов Золетил и Ксила, что, вероятно, связано с очень большой всасывающей поверхностью брюшины, которая обеспечивает быстрое всасывание лекарственных средств и жидкостей. Менее выраженными, но не менее значительными, оказались изменения при внутривенных введениях исследуемых анестетиков. Основные патологические изменения при использовании препарата Ветофол, а также комбинации препаратов Золетил и Ксила, проявляются в виде ателектаза, эмфиземы и гемор-рагий в ткани легких, в то время как отек легких практически не встречался. При использовании углекислого газа для эвтаназии у грызунов характерными признаками являются отек и геморрагии в ткани легких, при этом ателектаз и эмфизема встречаются реже.
Полученные результаты можно использовать при проведении эвтаназии лабораторных животных с целью дальнейшего патоморфологического исследования органов дыхания, а также в спорных случаях о причинах возникновения тех или иных патологических изменений в исследованных органах.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Литература
1. Гущин Я.А., Мужикян А.А. Влияние методов эвтаназии на гистологическую картину легких мелких грызунов. Международный вестник ветеринарии. 2014; 4: 96-104.
2. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях. Гл. I, ст. 6.
2018
№3
3. Европейская конвенция по защите домашних животных № 125 от 13.11.87 г. Гл. II, ст. 11.
4. Мужикян А.А., Макарова М.Н., Гущин Я.А. Особенности гистологической обработки органов и тканей лабораторных животных. Международный вестник ветеринарии. 2014; 2: 103-9.
5. Мужикян А.А., Макарова М.Н., Гущин Я.А. Особенности патологоанатомического исследования группы экспериментальных животных. Международный вестник ветеринарии. 2014; 2: 103-9.
6. Рыбакова А.В., Макарова М.Н. Методы эвтаназии лабораторных животных в соответствии с европейской директивой 2010/63. Международный вестник ветеринарии. 2015; 2: 96-107.
7. Anesthetic and pathological changes following highdoses of ketamine and xylazine in Sprague Dawleyrats / M.C. Giroux, P. Helie, P. Burns, P. Vachon. Experimental animals. 2015; 64 (3): 253-60.
8. AVMA. Euthanasia of animals that are unwanted or unfit for adoption. Available at: www.avma.org/KB/ Policies/Pages/ Euthanasia of-Animals-That-Are-Unwanted-or-Unfit-for-Adoption.aspx. Accessed May 7, 2011.
9. CCAC guidelines on: euthanasia of animals used in science. R. Charbonneau, L. Niel, E. Olfert et al. Canadian Council on Animal Care. 2010; 32.
10. Comparison of Carbon Dioxide and Argon Euthanasia: Effects on Behavior, Heart Rate, and Respiratory Lesions in Rats. T.H. Burkholder, L. Niel, J. L. Weed et al. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 2010; 49 (4): 448-53.
11. Conlee K.M. Carbon dioxide for euthanasia: concerns regarding pain and distress, with special reference to mice and rats/ K.M. Conlee, M.L. Stephens, A.N. Rowan. Laboratory Animals. 2005; 39 (2): 13761.
12. Effects of propofol on respiratory mechanic and lung histology in normal rats. A. Peratoner, C.S. Nascimento, M.C.E. Santana et al. Zin. British Journal of Anaesthesia. 2004; 92 (5): 737-40.
13. Fawell J.K., Tomson C., Cooke L. Respiratory artifact produced by carbon dioxide and pentobarbitone sodium euthanasia in rats. Laboratory Animals. 1972; 6: 321-6.
14. Guidance document on histopathology for inhalation toxicity studies, supporting TG 412 (subacute inhalation toxicity: 28-day study) and TG 413 (subchronic inhalation toxicity: 90-day stude). OECD Environment, Health and Safety Publications, №125. Paris, 2010: 52.
15. Guide for the care and use of laboratory animals. National Academy press. Washington, D.C. 1996.
16. Guidelines for anesthesia and analgesia in laboratory animals. Animal Care and Use Program. University of California, Berkeley. 2012; 5.
17. Guidelines for rodent and rabbit anesthesia, analgesia and tranquilization and euthanasia methods. Tulane University IACUC. 2012; 6.
18. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. S. Fisher, W.L. Burgess, K.D. Hines et al. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2016; 55 (6): 811-5.
19. Karmarkar S.W., Bottum K.M., Tischkau S.A. Considerations for the Use of Anesthetics in Neurotoxicity Studies/ Comparative Medicine. 2010; 60 (4): 256-62.
20. Keeble E., Meredith А. BSAVA Manual of Rodents and Ferrets. BSAVA. 2013; 391.
21. Matchett A., Marr R., Berard F. et al. The laboratory ferret. CRC Press. 2012; 114.
22. Organ Toxicity and Mortality in Propofol-Sedated Rabbits Under Prolonged Mechanical Ventilation. P. Ypsilantis, M. Politou, D. Mikroulis et al. Anesthesia & Analgesia. 2007; 105 (1): 155-66.
23. Physiological, Behavioral, and Histological Responses of Male C57BL/6N Mice to Different CO2 Chamber Replacement Rates. G.P. Boivin, M.A. Bottomley, E.S. Dudley et al. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2016; 55 (4): 451-61.
24. Recognition and Alleviation of Pain and Distress in Laboratory Animals. National Academies Press. Washington, D.C. 1992; 160.
25. Report of the ACLAM Task Force on Rodent Euthanasia. J. Artwohl, P. Brown, B. Corning, S.Stein. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2006; 45 (1): 98-105.
26. Suckow M., Stevens K., Wilson R. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster and other rodent. Academic Press. 2012; 1268.
27. Weber K. Role of the Study Pathologist. Toxicologic Pathology. 2014; 42 (1): 276-77.
2018
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
№3
