CC BY
16в объектах окружающей среды. В: Руководство по медицинской микробиологии. Лабинская А.С., Костюкова Н.Н., Иванова С.М. (ред.). М., 2010, с. 37-46.
8. Blinkova L.P., Pakhomov Yu.D., Nikiforova O.V. et al. Express assessment of cell viability in biological preparation. Pharmaceutical and Medical Biotechnology. Moscow, JSC Expo-biochem-Technology, 2012, p. 391-392.
9. Mukamolova G.V., Yasnopolskaya N.D., Kell D.B., Kaprelyants A.S. On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie van Leeuwenhoek, 1998, 73(3): 237-243.
10. Nystrom T. Not-quite dead enough: on bacterial life, culturability, senescence, and death. Arch. Microbiol, 2001, 176: 159-164.
11. Oliver J.D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbial Rev. 2010, 34: 415-425.
12. Oliver J.D. The viable but nonculturable state in the human pathogen, Vibrio vulnificus. FEMS Microbiоl. Lett., 1995, 133: 203-208.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Блинкова Лариса Петровна, д.б.н., проф.,
105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, р.т. (495) 916-11-52
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 С.А.Лисовская, Н.И.Глушко, Е.В.Халдеева
ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ РОДА FUSARIUM, ВЫДЕЛЕННЫХ У БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ
Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии
Цель. Изучение адгезивной активности и скорости роста у грибов рода Fusarium, выделенных с поверхности кожного покрова у больных атопическим дерматитом (АД). Материалы и методы. В исследовании использовали клинические и музейные штаммы F.oxysporum, F.solani. Посев проводили на агаризованную среду Чапека и Сабуро. Исследовали культуры в течение девяти суток при 30±2°C. Адгезивные свойства грибов определяли с помощью модели на основе нитроцеллюлозной пленки (Лисовская С.А. и др., 2006). Результаты. Проведенные исследования показали статистически достоверные отличия адгезивных свойств и интенсивности прорастания различных видов Fusarium spp. Уровень адгезии микроконидий F.solani был почти в 2,5 раза выше по сравнению с F.oxysporum. Формирование первой ростковой трубки микроконидиями вида F.solani отмечали в первые десять часов, тогда как у F.oxysporum — только на вторые сутки. Заключение. Полученные данные подтверждают видовые различия патогенных свойств Fusarium spp., что подчеркивает значимость видовой идентификации грибов.
Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 88—92
Ключевые слова: патогенные грибы, патогенность, адгезия, микроконидии
S.A.Lisovskaya, N.I.Glushko, E.V.Khaldeeva
PATHOGENIC PROPERTIES OF FUNGI FUSARIUM GENUS ISOLATED FROM PATIENTS WITH ATOPIC DERMATITIS
Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russia
Aim. Study of adhesive activity and growth speed of fungi Fusarium genus isolated from the surface of cutaneous covering in patients with atopic dermatitis (AD). Materials and methods. Clinical and museum F. oxysporum, F. solani strains were used in the study. Seeding was carried out into agarized Czapek and Sabouraud medium. The cultures were studied for 9 days at 30±2°C.
adhesive properties of fungi were determined by using model based on nitrocellulose film (S.A.Li-sovskaya et al., 2006). Results. The studies carried out showed statistically significant differences in adhesive properties and intergrowth intensity of various Fusarium spp. Adhesion level of F. solani microconidia was almost 2.5 times higher compared with F. oxysporum. Formation of the first germ tube by F. solani microconidia was noted during the first 10 hours whereas by F. oxysporum — only at day 2. Conclusion. The data obtained confirm species differences of Fusarium spp. pathogenic properties that emphasize the importance of species identification of fungi.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 3, P. 88—92
Key words: pathogenic fungi, pathogenicity, adhesion, microconidia
Долгое время как возбудителей грибковых заболеваний человека рассматривали сравнительно небольшую группу первичных патогенов, которые могут вызывать заболевания у относительно здоровых людей. Однако в последнее время увеличивается число регистрируемых случаев вторичных микозов, вызванных видами, ранее остававшимися в тени, относящимися к оппортунистическим — потенциально патогенным видам из-за лабильных свойств [7]. Среди них есть и достаточно выраженные патогенные формы микромицетов, виды, способные поражать ослабленные организмы, и, наконец, сапрофиты, живущие на растительных остатках, в почве и на отмерших частях растений. Обладая большим разнообразием ферментов, они способны использовать в качестве субстрата различные органические соединения, что позволяет им быть широко распространенными в природе. Они способны, с одной стороны, длительно сохраняться и развиваться во внешней среде, а с другой, вызывать тяжелые формы заболеваний различных организмов. Большинство представителей грибов рода Fusarium являются фитопатогенами, однако известны Fusarium spp., паразитирующие на насекомых, а также вызывающие микозы и токсикозы человека и теплокровных животных [5, 8, 9]. Также в последнее время в литературе появляется все больше сведений о клинических и эпидемиологических аспектах инфекций, вызванных Fusarium spp. [2].
Обычной причиной заражения оппортунистическими видами грибов во внешней среде является вдыхание спор грибов, а в случае повреждения кожных покровов — занос в раны инфекции, причем часто из почвы. У человека и теплокровных животных грибы рода Fusarium наиболее часто колонизируют ногти, кожу, роговицу глаза и легкие. В то же время, у Fusarium spp., в отличие от многих признанных патогенных грибов, имеется необычная способность продуцировать в тканях человека особые морфологические формы: конидии и торулоидные гифы, способные проникать в кровоток и приводить к диссеминации процесса [1]. Такие одноклеточные формы легко циркулируют в кровотоке. Однако среди грибов Fusarium spp. нет видов, патогенных однозначно только для человека. Виды, выделяемые от больных, как правило, являются активными фитотрофами.
В связи с этим, целью нашей работы было изучение факторов патогенности у грибов рода Fusarium, выделенных с поверхности кожного покрова у больных с ато-пическим дерматитом (АД). Длительное нарушение как общего, так и местного иммунитета, сопровождающее данное хроническое заболевание кожи, способствует расширенной колонизации условно патогенной микрофлорой, в том числе, грибами рода Fusarium.
Потенциальную патогенность принято характеризовать наличием и проявлением факторов патогенности, основанных на физиологических особенностях грибковой клетки и характере ее взаимодействия с макроорганизмом, которые способствуют закреплению грибов в организме и развитию заболевания.
Известно, что любой инфекционный процесс начинается с адгезии возбудителя на клетках-мишенях. Адгезивность является одним из основных факторов, опреде-
ляющих поведение микроорганизмов в биоценозах, и она же определяет способность гетеротрофных микроорганизмов переходить к паразитическому образу существования [3]. Поэтому нами были изучены адгезивные свойства штаммов грибов Fusarium spp., выделенных у больных атопическим дерматитом с кожных поверхностей. Адгезивную способность определяли с помощью ранее разработанной нами модели на основе нитроцеллюлозной пленки [6]. Кроме того, представляло интерес сравнение скорости роста клинических и музейных штаммов, поскольку для фитопатогенных грибов эта способность позволяет быстро поражать и колонизировать как вегетативные, так и репродуктивные органы растений, вызывая их увядание, повреждение и гибель [5].
В исследовании использовали штаммы Fusarium oxysporum, F.solani, выделенные от пациентов, находящихся на амбулаторном лечении (4), и музейные штаммы (2), полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов: F. oxysporum ВКМ (F-1182) и F. solani ВКМ (F-819). Всего было протестировано 6 штаммов грибов: F. oxysporum (2 штамма), F. solani (4 штамма).
Материал для выделения изолятов грибов брали от больных с помощью стерильного ватного тампона с последующим смывом стерильной водой по периметру наиболее свежих поражений. Затем тампон помещали в пробирку с 2 мл стерильной воды. Посев смыва проводился на агаризованную среду Чапека и Сабуро, в три чашки Петри, причем в одну чашку добавлялся стрептомицин в количестве 70 ед/мл среды. Выращивание проводили при 30±2°C в течение 6 — 9 суток.
Идентификацию выделенных штаммов грибов проводили по основным принятым микроскопическим и биохимическим критериям [4, 8].
Определение адгезивных свойств выделенных штаммов Fusarium spp. проводили на ранее разработанной авторами модели [6]. Полученную пленку площадью 7 см2 инкубировали при 30°С с 3 мл суспензии спор гриба в 0,1 М фосфатном буфере в течение 1 суток. Определение уровня адгезии проводили по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток при длине волны 540 нм, а также прямым подсчетом клеток в суспензии с помощью микроскопа Биолам Р-11 при увеличении 10x20; подсчитывали не менее 10 полей зрения.
Определение скорости роста мицелия грибов и прорастания микроконидий проводили на нитроцеллюлозной пленке, погруженной в жидкую питательную среду Сабуро и Чапека. Густота посевной взвеси — приблизительно 100 спор на пленку. Инкубирование проводили в течение 1 — 4 суток при 30°С. Скорость прорастания спор грибов определяли временем достижения ростковой трубкой первого ветвления и числа ростковых трубок (в процентах; на основании изучения не менее чем 100 спор) [2].
Результаты обследования пациентов, обратившихся в лабораторию микологии КНИИЭМ, показывают, что грибы рода Fusarium наиболее часто обнаруживаются в микробиологических посевах поздней весной и ранней осенью. Это связанно с хорошим ростом этих грибов во влажных условиях и распространением их конидий ветром и осадками. [10]. Частота обнаружения грибов рода Fusarium в организме человека за период 2010, 2011 гг. составила, по данным наших исследований, около 9%. Из них только в семи случаях обсемененность грибами Fusarium spp. составила более 1х104 КОЕ/мл. Причем, в четырех случаях заражения у больных был поставлен диагноз атопический дерматит с хроническим течением заболевания. Необходимо отметить, что данные микромицеты в большинстве посевах от больных высевали совместно с Candida albicans. Наиболее часто в посевах встречался вид F. solani.
Для дальнейшего исследования нами были отобраны четыре клинических и два музейных штамма Fusarium spp. Группу клинических штаммов составили три штамма F. solani и один штамм F. оxysporum, при выделении которых учитывали клинические проявления микотического заболевания и выявление Fusarium spp. в количестве, превышающем 104 КОЕ/мл. Группу музейных штаммов составили F. oxysporum и F. solani.
В изучении адгезии и ростовой активности штаммов использовали микроконидии, несмотря на то, что в морфологическом отношении они менее дифференцированы, чем макроконидии, но играют определенную роль в распространении вида и заселении субстрата.
Однако было замечено, что на активное спорообразование микроконидий влияет качество питательной среды. Так, на среде Чапека у видов F.oxysporum и F.solani образование микроконидий проходило слабо или отсутствовало полностью, по сравнению с ростом и образованием микроконидий на среде Сабуро.
Изучение выделенных микроконидий у штаммов Fusarium spp. выявило значительные отличия в их адгезивных свойствах, связанные с видовой принадлежностью штаммов. Тестирование адгезивных свойств микроконидий грибов Fusarium spp. показало значительное (почти в 2,5 раза) увеличение уровня адгезии у вида F.solani, по сравнению с F. oxysporum (16,0 — 17,6% и 8,6 — 9,0% соответственно), что позволило выявить достоверные отличия между изученными видами (р=0,95).
Кроме того, было установлено отсутствие отличий в адгезивной активности клинических штаммов и музейных штаммов одного вида. Таким образом, адгезивная активность микроконидий, по-видимому, является видовым атрибутом грибов рода Fusarium.
Для фитопатогенных грибов важна способность к быстрому росту, поскольку позволяет быстро поражать и колонизировать органы растений. Поэтому в дальнейшем изучалась интенсивность прорастания, то есть время появления первой ростковой трубки и числа ростковых трубок.
Было отмечено, что на интенсивность прорастания также влияет качество питательной среды. Так, на среде Сабуро отмечено активное обрастание нитроцеллюлоз-ной пленки всеми видами грибов рода Fusarium, по сравнению с ростом данных грибов на среде Чапека, где скорость прорастания была ниже. Это позволило при прорастании спор определять степень увеличения их объема, интенсивность прорастания и размеры ростковой трубки.
Исследование клинических и музейных штаммов грибов рода Fusarium показало различия в скорости прорастания спор на нитроцеллюлозной пленке только в зависимости от вида. На основании сравнительного анализа полученных данных показано, что микроконидии вида F. solani не только адгезировались более активно, но и отличались длиной главной гифы, числом и скоростью образования перегородок. Клетки микроконидий F. oxysporum выглядели малоактивными. Время появления первой ростковой трубки для разных видов было различно. Так, у грибов F. solani ее появление отмечено в первые шесть часов, а полное прорастание спор завершилось на вторые сутки опыта, тогда как у штаммов F. oxysporum первые ростковые трубки появились на вторые сутки.
Проведенные исследования показали статистически достоверные отличия адгезивных свойств и интенсивности прорастания различных видов Fusarium spp. Полученные данные подтверждают наличие более выраженных патогенных видов среди грибов рода Fusarium, что подчеркивает значимость видовой идентификации грибов. Принадлежность тех или иных клинических штаммов к определенным видам может послужить одним из критериев для врача-клинициста в прогнозирования ми-котических осложнений у больных, особенно при наличии выраженных нарушений кожного покрова, например, при атопическом дерматите.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аравийский Р.А., Климко Н.Н., Васильева Н.В. Диагностика микозов. СПб, МАПО, 2004.
2. Блинов Н.П., Васильева Н.В. Основные итоги 15 конгресса международного общества медицинских и ветеринарных микологов (ISHAM), США. Проблемы медицинской микологии. 2003, 5 (4): 45-59.
3. Буркутбаева Т.Н., Фохридина Л.И., Тастанбекова Л.К. Свойства плесневых грибов, выделенных от больных с микозами лор-органов. Проблемы медицинской микологии. 2006, 8 (1): 37-39.
4. Дудка И. А., Вассер С.П. Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев, Наукова думка, 1982.
5. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. М., Академия, 2005.
6. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В. Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов. Проблемы медицинской микологии. 2006, 8 (3): 36-39.
7. Марфенина О.Е., Фомичева Г.М. Потенциальные патогенные мицелиальные грибы в среде обитания человека. Современные тенденции. Микология сегодня. Ю.Т.Дьяков, Ю.В. Сергеев (ред.) М., Национальная академия микологии, 2007.
8. Саттон Д. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди (ред.). М., Мир, 2001.
9. Kantarcioglu A.S., Summerbell R.C., Sutton D.A. et al. A dark strain in the Fusarium solani species complex isolated from primary subcutaneous sporotrichioid lesions associated with traumatic inoculation via a rose bush thorn. Med. Mycol. 2009, 30: 1-7.
10. Nelson P.E, Dignani M.C., Anaissie E.J. Taxonomy, biology and clinical aspect of Fusarium species. Clin. МюгоЬю1. Reviews. 1994, Oct.: 479-504.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Лисовская Светлана Анатольевна,
420015, Казань, ул. Б.Красная, 67, р.т. (843)236-56-59
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Ю.Д.Пахомов1, Л.П.Блинкова1, О.В.Дмитриева1, Л.Г.Стоянова2
ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ РОСТА И ОБРАЗОВАНИЯ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ У LACTOCOCCUS ЬАСТШ
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва; 2Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова
Цель. Изучение штаммовых различий динамики жизнеспособности и образования некультивируемых форм Lactococcus 1аеИ8. Материалы и методы. В работе использованы 3 штамма L. 1actis МГУ, 729 и F116. Некультивируемые формы получали при длительной инкубации культур лактококков в синтетической среде в условиях углеводного голодания. Среду инокулировали культурами, выращенными на бульоне Элликера, отмытыми физраствором и без отмывки. Полученные популяции инкубировали при 30°С без перемешивания в течение 4 месяцев. Пробы культур периодически исследовали на жизнеспособность и высеваемость. Результаты. В культурах, полученных с использованием неотмытого инокулята, наблюдался активный рост численности бактерий в первые дни после посева. Показано, что скорость образования некультивируемых форм тем быстрее, чем выше уровень метаболической активности клеток в популяции. Выявлен факт фенотипической диссоциации в культуре лактококков в стрессовых условиях. Заключение. Скорость образования некультивируемых форм L. 1actis, а также стабильность их существования, вероятно, зависит от штамма, условий культивирования и метаболической активности клеток в популяции.
Журн. микробиол., № 3, С. 92—96
Ключевые слова: Lactococcus 1actis, некультивируемые формы, жизнеспособность, штаммы, углеводное голодание
